生物技术药品发育及DART的评估论述

作者：袁芳 潘晓靓 林海霞 王庆利 常艳 单位：中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心 国家食品药品监督管理局药品审评中心

1生物技术药物DART评价需考虑的因素

总体来说，生物技术药物的DART评价应基于受试物的特性，如种属特异性、免疫原性、生物活性和暴露情况，并且合理设计试验及给药方案。1.1选用相关种属(relevantspecies)许多生物技术药物的生物活性都与其种属或组织特异性相关，因此其安全性评价应使用相关种属动物。所谓相关种属，是指受试物在此类动物体内，由于受体/抗原决定簇(对单抗而言)的表达，能产生药理活性。由于许多生物技术药物是人源化或靶向作用于人类的蛋白，其作用往往只针对人类和非人灵长类(non-humanprimates，NHPs)动物，应用于兔、大鼠或小鼠时产生的交叉反应较弱或无交叉反应。对于这些产品的DART评价，通常考虑使用非传统物种，即NHPs。但指导原则ICHS6中推荐使用相关种属而非最相关种属，即鼓励生物技术药物进行DART评价时尽量减少NHPs的使用。因此，如生物技术药物对啮齿类或兔存在亲和力或药理学活性，只是作用弱于人类，则可根据药物在不同种属的不同效力增加给药剂量和(或)频率来确定安全范围。此外还可考虑使用替代分子或转基因动物。1.2受试物的免疫原性许多生物技术药物对动物来说是异物，因此动物会产生相应的抗体，称为抗药抗体(anti-drugantibodies，ADA)[2,3]。ADA可导致生物技术药物清除率增加，从而导致暴露降低并高估安全性，但也可能使母体出现不良反应，从而高估毒性。因此，对受试物进行评价时须综合考虑ADA对药物动力学/药效动力学(PK/PD)的影响及可能产生的抗体介导的免疫毒性。ADA反应有时可通过增加给药剂量或频率克服，但也有可能无法克服或导致由ADA介导的无关毒性增强。一般来说，啮齿类和兔通常比NHPs更易受免疫原性的限制。1.3受试物的药理作用许多生物技术药物针对的是特定的细胞信号通路，此时有必要考虑与其药理学效应相关的潜在危害。例如某些生长因子如表皮生长因子[4]、血管内皮生长因子[5]和神经生长因子[6]是胚胎/胎儿正常发育必不可少的，阻断这些通路理论上存在风险，因此即使未发现发育毒性，也应在产品标签中明确告知潜在的危险。此外，还应基于被抑制的通路考虑dart研究的类型。如抗细胞因子抗体可特异性抑制单一细胞因子，对生育或器官发育无影响，但会抑制出生后的免疫应答反应。如果使用相应基因缺陷的小鼠进行评价，由于其细胞因子在其整个生命周期都缺失，所以无法区分免疫系统损伤是出生前还是出生后的药理作用所致。此时，合理的DART评价应包括使用正常动物进行出生前后发育研究并进行F1代的免疫评价。1.4受试物的胎盘转移与小分子药物不同，大分子生物技术药物不能跨膜扩散达到与小分子同等广泛的分布，故大分子生物技术药物(抗体除外)的胚胎/胎儿暴露与小分子药物相比暴露量很低。但抗体可由Fc受体介导通过主动转运的方式透过胎盘[7,8]。人和NHPs抗体的胎盘转移发生在胎儿期，特别是胎儿期晚期[9]，因此使用NHPs作为评价种属时，对于那些无母体毒性或母体毒性很小的抗体类药物，EFD评价时将给药期延长到胎儿期可能比仅在胚胎期给药更合适。这对有免疫调节作用的单克隆抗体尤其重要，因为免疫系统会在胎儿期和出生后继续发育[10]。与人和NHPs不同，啮齿类动物在器官形成期时抗体就可透过卵黄囊产生致畸效应[11]。如淋巴毒素Fc受体融合蛋白可阻碍小鼠的淋巴结发育[12]，但对食蟹猴则无影响。因此，使用啮齿类进行EFD评价时应合理设计给药时间以更好地模拟临床暴露。综上所述，生物技术药物的DART评价在选择模型时应综合考虑该模型：①是否可与受试物发生可接受水平的交叉反应；②是否可产生与人类似的药理学作用；③ADA是否会影响受试物的PK/PD或介导产生母体毒性；④是否达到与人类似的暴露水平。

2NHPs动物模型在生物技术药物DART评价中的应用

在过去20年中，NHPs越来越多地应用于生物技术药物的安全性评价，包括DART评价中。NHPs在各阶段的DART评价中都有应用，包括生育力评价、EFD评价、PPND评价及将后两阶段研究合并后强化的出生前后发育(enhancedpre-andpost-nataldevelopment，ePPND)评价。使用NHPs进行DART研究时，需根据受试物的特性合理设计给药持续时间、每组动物数、检测终点及产后研究的持续时间。2.1生育力试验使用NHPs评价生物技术药物对生育力的影响时，给药时间一般为雌性2～3个月经周期，雄性不少于60d。NHPs生育率低(40％～70％)，着床前丢失率高(接近25％)，自发流产率高(10％～30％)[13]，使用该种属进行试验可操作性差，因此不以率、怀孕率和授孕率作评价指标。评价指标一般包括雌性月经周期，雌性及雄性激素水平，雄性体积、数量、活性及形态[14]。如果一般毒性研究时间足够长并有足够数量的性成熟动物，可将生殖毒性试验与一般毒性研究合并以减少动物的使用量。但由于猕猴性成熟通常需要4～5年，用于毒理学评价的性成熟NHPs数量很有限。多数一般毒性评价中使用的是年轻动物，与性成熟动物之间存在差异，可能会影响实验结果。因此，尽管合并研究可减少动物的使用量，但这一方法并不总是实际可行。2.2EFD试验NHPs的EFD试验通常是在怀孕d18～d20通过超声检查确认怀孕，在怀孕d20～d50(主要器官形成期)给药，在怀孕d100剖宫产取出胎仔进行外观、内脏及骨骼评价[15]。对中晚期妊娠时才会透过胎盘转移且潜在靶器官系统(如免疫系统)有可能在这段时间继续发育的生物技术药物[16]，如单克隆抗体，可延长给药期以保证胎儿和晚发育的器官(如免疫系统)充分暴露。例如，给药可延长至怀孕d90～d100(或更晚)，剖宫产可推迟到怀孕d120～d140(自然生产通常在怀孕d160)。由于NHPs本身怀孕率低，给药需等到怀孕d18确诊后，因此无法评价受试物对早期(怀孕d18前)胚胎发育的影响。由于生物技术药物大多不易透过胎盘，直接的胚胎暴露量一般很低，因此，EFD研究应重点关注母体毒性导致的不良影响而非直接的胚胎毒性。此外，猕猴易出现妊娠晚期胚胎丢失如死胎或早产，这将减少可用于评价的胎仔数，因此EFD实验需要大量怀孕动物以确保足够数量的胎儿。2.3PPND试验NHPs的PPND试验通常是在怀孕d20开始给药至妊娠结束，或是使所有的怀孕动物给药持续时间相同，如给药期全部统一为怀孕d20～d140。由于大量自发流产出现在怀孕d20～d35，如果EFD研究已涵盖这一时间段，PPND给药可推迟到怀孕d35～d50以减少每组所需NHPs的数量[17]；为评价新生儿通过乳汁哺育导致的暴露，给药也可持续到分娩后。根据评价终点的不同，出生后胎儿评价的持续时间可以是7～720d，最常见的产后观察期为6～12个月。行为学评价中的学习能力测试试验要求至少9个月的产后观察期，因为只有月龄大于6个月的动物可成功训练并完成测试，训练期也约需6周。对于免疫系统的评价，至少在出生后6个月进行，一方面免疫系统得到充分发育以供评价，另一方面婴儿达到足够的大小以采集充足量的血液进行多种免疫检测。2.4ePPND试验当NHPs用于DART评价时，标准的分段毒性试验可能不是最优选择，设计单独的发育毒性实验，即将PPN研究与EFD研究结合可能更可取。合并研究可减少动物的使用量及费用，且不会丢失关键信息[18]。对胎儿生长发育的影响可在动物出生后评估，且幼仔在头7d的生存情况可能比剖宫检查更能有效预测生物制品的毒性。随着发育免疫毒性日益受到关注，也可进一步对新生儿进行免疫学评价。但若动物在妊娠早期或晚期自发流产率增加，或受试物有堕胎作用，为确保有足够数量的新生儿，ePPND试验将需要更多的实验动物。NHPs的ePPND试验通常是在怀孕d20～d140给药，或持续给药至妊娠结束，孕猴自然分娩。胎仔出生后评价方法与PPND试验类似，要进行骨骼、外观、行为学及母婴关系评价，出生后胎仔评价的持续时间需考虑评价终点的不同。终末解剖时检查胎仔内脏并进行骨骼染色检查。NHPs模型最大的优越性便是与人类的生殖内分泌系统具有高度相似性。但使用NHPs也面临诸多挑战，如性成熟的雄性与雌性动物数量有限、进行试验的实验室数量有限、动物怀孕率低、每胎只产一仔、试验周期长(ePPND试验的报告草稿需要15～24个月)及试验费用高昂(ePPND试验费用约150～300万美元)等。

3替代分子在生物技术药物DART评价中的应用

有些生物技术药物只与人或黑猩猩产生交叉反应，不存在毒理学相关物种，此时DART评价只能考虑其他检测体系。方法之一就是使用针对啮齿类动物开发的受试物的同系蛋白，即可识别啮齿类相同抗原的相似抗体，称为替代分子(surrogatemolecules)或同源蛋白。理论上可开发任何种属的替代分子，但由于啮齿类动物作为常规种属的优越性，替代分子通常是鼠源蛋白。替代分子已成功用于英利昔单抗(inflixi-mab)[19]、依法珠单抗(efalizumab)[20]和赛妥珠单抗(certolizumabpegol)的妊娠药物分级。其中英利昔单抗和依法珠单抗只在人和黑猩猩上产生交叉反应，因此不存在毒理学评价的相关物种，一般毒性研究也使用替代分子在啮齿类动物中进行；赛妥珠单抗只与人和NHPs发生交叉反应，一般毒性研究使用NHPs，DART研究则使用替代分子。但EFD评价是否可使用替代分子在啮齿类动物上进行，从而替代NHPs模型仍存在争议，应在充分科学论证的基础上具体分析。若啮齿类动物使用替代分子进行研究时有所发现，还应使用NHPs进行EFD研究以确认这些发现。因此对于与NHPs发生交叉反应并有可能应用于有生育可能的妇女(womenofchild-bearingpotential，WOCBP)的药物，EFD评价仍推荐使用NHPs作为研究种属。使用替代分子可减少NHPs的使用量，啮齿类的试验方案和检测终点都已十分成熟，历史对照数据也更充分，并可充分进行统计学分析，一旦替代分子开发成功，可在较短时间进行试验并得到结果(与NHPs相比)。但开发替代分子相当于开发一种新的药物，且须对其与相应人源化蛋白的相似性进行充分论证，所花费的时间和金钱可能超过使用NHPs。此外，单抗在啮齿类的胎盘转移也不同于人类。而且由于缺乏经验，难以确定该模型是否对人具有预测意义。

4转基因动物模型在生物技术药物DART评价中的应用

当受试物仅在人和NHPs上表现生物学活性时，还可使用转基因动物进行DART评价。用于DART评价的转基因动物通常为携带人类靶标或疾病特征的小鼠。基因改造包括选择性剔除特定基因(基因敲除，knock-outs，KO)或选择性插入特定基因(基因敲入，knock-ins，KI)，如何改造取决于受试物的作用机制。KO小鼠可用于评价抑制特定受体、通路的生物技术药物或拮抗型单克隆抗体，前者可使用相应基因存在缺陷的小鼠，后者可使用基因改造后缺乏相应靶抗原的小鼠。然而到目前为止还没有仅用基因缺陷动物进行DART评价的药物获批，主要是因为由基因缺陷动物获得的信息代表的是最坏的情况而非治疗可能产生的影响。如表皮生长因子受体α4整合蛋白基因敲除的小鼠无生育能力[21,22]，但对应的拮抗型单克隆抗体应用于NHPs时未发现F1代异常。此外使用基因改造动物进行DART研究也很难确定安全范围，因为没有定量的暴露。因此，使用基因缺陷动物进行生物技术药物DART的评价时需谨慎。此外，基因缺陷动物可能产生代偿机制，从而使怀孕期间相应通路的抑制比正常动物有所降低。KI小鼠可表达人类的靶蛋白，可使用标准的DART研究方案在一定剂量范围下进行研究。如靶向CD4的单克隆抗体keliximab[23,24]只与人和黑猩猩发生交叉反应，DART研究建立了相应的转基因小鼠模型，将小鼠的CD4基因敲除并插入人类的CD4基因，药理学研究表明，受试物在该模型上表现出了CD4抑制作用。使用该转基因小鼠模型已进行了一套完整的DART研究，但由于该产品还没有获批，这种方法是否得到监管机构的认可还未可知。KI小鼠虽可表达人的靶蛋白，但与靶蛋白相互作用的其他辅助蛋白仍是鼠源的，因此还需研究人-鼠蛋白的相互作用以确定使用该模型是否可行。此外，人源化生物技术药物对啮齿类动物可能仍存在免疫原性，因此可能限制KI小鼠的长期研究。转基因动物模型的优点在于可使用传统种属进行研究，KO小鼠不需要给予受试物，KI小鼠可使用拟用于临床的药物(即人源化蛋白)。但这类模型本身存在不稳定性，如可能难于繁育、体征不稳定、寿命有限、基因敲入后的表达量可能不同于目标基因的正常表达。此外，与替代分子一样，由于缺乏经验，难以确定该模型是否对人具有预测意义。

5展望

生物技术药物本身结构复杂，因此DART评价应根据药物作用机制、预期的人体暴露水平、免疫原性、药物动力学特性、胎盘转运和胚胎-胎仔暴露水平选择合适的研究种属并合理设计实验方案，采取灵活、个案处理和基于科学的方法。目前FDA批准的生物技术药物中，DART评价使用传统种属的占多数，其次是NHPs动物模型。使用这两种模型进行DART评价已积累了较多的经验，方法较成熟，目前仍是生物技术药物DART评价的主流。同时，对NHPs实验设计的优化也在不断进行，包括将生殖毒性研究与标准的慢性毒性研究合并，将PPND试验与EFD试验合并为ePPND试验。目前，ePPND实验设计已得到ICHS6(R1)的认可，今后这一方法如能得到广泛应用，将大大减少NHPs的使用。替代方法(包括针对传统种属开发的替代分子和转基因动物模型)目前在生物技术药物的DART评价领域的应用很有限，仅有3例使用替代分子进行的妊娠药物分级，转基因动物模型仍有待官方认可。虽然使用替代方法进行生物技术药物的DART评价目前经验有限，但替代方法可大大减少生物技术药物DART评价所需的动物数、研究时间及费用，具有广阔的应用前景。随着研究的不断深入，相信替代方法将得到更广泛的认可和应用。