针灸对老鼠失眠的影响

本文作者：周艳丽 高希言 王培育 任珊 单位：河南中医学院针灸推拿学院

中医称失眠为“不寐”“不得眠”“不得卧”，以经常性不能够获得正常睡眠为特点。临床表现为不易入睡，或睡中反复易醒，或早醒不能入睡，甚至彻夜不能入眠，属睡眠障碍的一种［1］。随着社会的发展，竞争日趋激烈、自然环境变化、生活节奏加快，以及人口老龄化及疾病谱的改变，失眠的发病率急剧上升［2］。针灸治疗失眠症有悠久的历史，具有见效快及改善晨醒后伴随症状等非药物疗法的优点。且经过长期临床检验已经证实，针刺治疗失眠症疗效确切，作用持久而稳定。传统的体针疗法和耳穴疗法依然是针灸治疗失眠的主要选择［3－4］。针刺对失眠作用机制，许纲［5］认为可刺激星状神经节；皮敏［6］发现失眠者较正常人脑脊液γ－氨基丁酸（GABA）含量低，而针刺神门、三阴交后，脑脊液GABA含量有所提高。但目前研究也存在着诊疗标准不统一、治疗方法多样化、选穴组方差异较大、缺乏相关的研究依据等问题。本实验选取临床中最常用的申脉、照海、神门、内关、足三里和三阴交等穴位，观察针刺上述腧穴对失眠大鼠下丘脑内单胺类神经递质GABA及γ－氨基丁酸A受体（GABAAR）的影响，为临床治疗失眠选穴提供实验依据。

1材料与方法

1．1动物与分组健康清洁级Wistar大鼠70只，雌性，体质量（200±10）g，由华东科技大学同济医学院动物实验中心提供（SCXK鄂2010－0007）。将70只大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、“神门”组、“内关”组、“三阴交”组、“足三里”组、“申脉－照海”组。实验中对动物的处理过程符合科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1．2主要试剂及仪器对氯苯丙氨酸［PCPA，吉尔生化（上海）有限公司］；兔抗GABA、兔抗GABAA、SABC染色试剂盒、DAB显色试剂盒、枸橼酸缓冲液、PBS缓冲液（武汉博士德生物公司）；甲醛、H2O2、切片石蜡、二甲苯、乙醇等（天津市福晨化学试剂厂）；0．35mm×15mm针灸针（苏州医疗用品厂）；MP200A型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；电热恒温干燥箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）；KD－BM生物组织包埋机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；轮转式石蜡切片机（德国Leitz公司）；跳台仪、细棒为自制。

1．3造模方法PCPA用弱碱性生理盐水（pH7～8）配置成30mg／mL混悬液备用。每日上午腹腔注射PCPA混悬液（1mL／100g），连续注射2d，于第1次腹腔注射28～30h后，动物出现昼夜节律消失，白天活动频繁，与空白对照组有明显不同，表明模型复制成功［7］。空白对照组腹腔注射相同体积的弱碱性生理盐水。1．4针刺方法大鼠造模成功后次日开始每天早晨8：00～10：00进行针刺治疗，各组按分组针刺“神门”“内关”“三阴交”“足三里”“申脉－照海”，空白对照组及模型对照组只抓取，不治疗。针刺组腧穴均取双侧，参照《实验针灸学》［8］选取相应腧穴，平补平泻捻转1min出针。每日治疗1次，连续7d。于末次针刺治疗结束后60min对大鼠断头处死取脑。

1．5观察指标及检测方法抗疲劳实验：连续治疗7d后，取直径约为0．6cm、长约为100cm的细棒，垂直固定，置于一个注有水的圆盆中央，将大鼠放于距棒顶端约30cm的地方，使其头朝上抓住细棒，用秒表记录其由于疲劳而滑下之前在棒上的持续时间。每只大鼠实验3次，以3次平均值为准。抗疲劳实验在治疗结束取材前进行。免疫组化检测：大鼠断头后，迅速将脑取出，在冰床上操作，取下丘脑放入4％的甲醛溶液中，4℃条件下固定1周后，行梯度脱水，透明，石蜡包埋，切片，每张切片厚6μm，进行测定指标的免疫组织化学法染色。免疫组化染色用ABC法：切片常规脱蜡至水，用PBS（pH7．4）冲洗3次，每次3min。切片入3％H2O2溶液室温10min。蒸馏水洗涤3次。切片入0．01mol／L枸橼酸缓冲液（pH6．0）微波加热修复抗原，PBS（pH7．4）冲洗3次，每次3min。滴加正常羊血清封闭，室温下孵育30min。甩去血清，分别滴加一抗（兔抗GABA、兔抗GABAA），4℃过夜。PBS（pH7．4）冲洗3次，每次3min。滴加生物素化羊抗兔IgG，室温下孵育30min。滴加试剂SABC链酶亲和素－过氧化物酶复合物，室温下30min。滴加新鲜配制的DAB溶液，镜下控制反应时间。自来水冲洗后，苏木素复染，行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。阴性对照：用正常羊血清代替一抗。在400倍视野下，每张切片分别至少观察5个具有代表性的视野，显微镜观察，显示棕黄色颗粒者为阳性，计数每个视野中染色阳性的细胞数，取平均值。

1．6统计学处理统计分析采用SPSS13．0软件进行。所得数据以均值±标准差（x珚±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0．05作为差异有统计学意义的标准。

2结果

2．1各组大鼠脑内GABA、GABAAR阳性细胞表达的比较（见图1）光镜下免疫组织化学切片背景呈浅黄色，免疫阳性细胞呈不同程度的棕黄色，海马组织GABA免疫阳性神经元呈卵圆形、圆形或多角形，大小不等，细胞突起数量不等，多为1～3个。针刺干预后，与空白组相比，模型组大鼠下丘脑内GABA阳性细胞数量明显下降（P＜0．05）。同模型组相比，针刺各组大鼠下丘脑内GABA阳性细胞数量明显增多（P＜0．05，P＜0．01）。“申脉－照海”组和“神门”组的GABA阳性细胞数明显高于“足三里”组（P＜0．05）和“三阴交”组（P＜0．01）。与空白组相比，模型组大鼠下丘脑内GABAAR阳性细胞数量明显下降（P＜0．05）。同模型组相比，针刺各组大鼠下丘脑内GABAAR阳性细胞数量明显增多（P＜0．05，P＜0．01）。“申脉－照海”组和“神门”组的GABAAR阳性细胞数明显高于“足三里”组、“三阴交”组和“内关”组（P＜0．01）。

2．2各组大鼠抗疲劳时间的比较由图2可见，与空白组比较，各造模组大鼠爬杆时间明显降低（P＜0．01）。提示造模后由于大鼠睡眠觉醒周期消失，大鼠白天、夜晚均活动不停，各造模组大鼠体力消耗大，大鼠抗疲劳指数下降，说明造模成功。治疗后，模型组与空白组比较，爬杆时间明显降低（P＜0．01）。与模型组比较，“三阴交”组、“足三里”组、“申脉－照海”组爬杆时间明显升高（P＜0．05），“神门”组、“内关”组与模型组的差异无统计学意义（P＞0．05）。各治疗组组间比较，“申脉－照海”组与“三阴交”组、“足三里”组、“神门”组、“内关”组比较差异均有统计学意义（P＜0．05），提示针刺“申脉”“照海”对改善失眠模型大鼠抗疲劳能力的效果最好。

3讨论

睡眠在人类及哺乳动物的生命活动中具有十分重要的生理意义，但迄今为止，睡眠发生的确切机制尚未完全阐明。现代医学认为，睡眠是中枢神经系统内发生的一个主动过程，与脑内神经递质的动态变化密切相关［9］。与睡眠密切相关的中枢神经递质有5－羟色胺（5－HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）和GABA等。睡眠调节的机制非常复杂，一般来讲，脑内主要有两个系统调节正常的觉醒和睡眠过程。一个是主要由单胺类神经递质系统组成的网状上行激活系统，另一个是由视交叉腹外侧核发出的抑制性投射纤维组成的抑制系统，其主要由GABA神经递质系统组成，发出纤维投射到下丘脑和脑干的促觉醒核团，抑制这些核团的活动从而起到助眠的作用［10］。GABA是中枢神经系统特有的物质，对神经元具有普遍的抑制作用，具有抗焦虑、抗惊厥、镇痛、调节内分泌等功能［11］。GABA是脑内重要的抑制性神经递质［11］，其作用机制是通过GABA受体而发挥抑制作用。GABA主要通过离子型受体（GABRA和GABRC）和代谢型受体（GABRB）发挥抑制。GABAA受体作为脑内最重要的抑制性受体，表面有配体门控氯离子通道蛋白，与GA－BA结合后，可以增加胞膜对氯离子的通透性，使氯离子内流，胞膜超极化，形成抑制性突触后电位，发挥GABA的抑制性作用［13］。研究发现在基底前脑、脑干、丘脑网状上行结构及蓝斑区域均有GA－BA的兴奋表达，GABA受体亚型中GABRA1激活氯离子通道开放，突触后膜超极化后产生抑制性突触后电位，抑制神经元放电，可直接抑制大脑内促觉醒类神经元、神经递质的兴奋性作用，达到镇静、催眠作用［14］。PCPA造成的失眠鼠模型是目前公认的并广泛用于研究5－HT及其与其它递质之间关系的经典动物模型。研究发现，PCPA除可耗竭脑内5－HT外，还可引起中缝背核和尾状壳核NE和DA水平下降［15］。腹腔注射PCPA的方法操作简单、成功率高、成本相对较低，具有良好的可重复性。本实验结果提示，针刺可使腹腔注射PCPA所致失眠大鼠脑内的GABA、GABAAR的阳性细胞数增加，通过增强GABA和GABAAR安神镇静的功能，达到治疗失眠的目的。针刺亦可改善各组失眠大鼠抗疲劳的能力，增强体力。根据本实验结果，申脉、照海、神门可作为临床治疗失眠的必选穴位，内关、三阴交、足三里可作为符合辨证的首选穴位。