原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用

摘 要 原生质体融合技术是微生物遗传育种中的一项重要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选育理想的融合株，便于操作等优点，在遗传育种中具有广阔的应用前景。文章从原生质体融合的特点以及融合技术应用等方面进行了综述。

关键词 原生质体；原生质体融合；遗传育种'

原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体。然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发生两次基因组之间的接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。

两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂作用下，两原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组的目的，最后对重组体进行生产性能，生理生化和遗传特性分析。

一、原生质体融合的特点

1.杂交频率较高

由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。

2.受接合型或致育性的限制较小

由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制就比较小。

3.重组体种类较多

由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触.有机会发生多次交换，可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体

二、原生质体融合技术的应用

在微生物育种中，常根据不同需求通过原生质体融合技术培育出优质、高产、抗逆性强等优点的微生物菌种。

1.标记菌株的筛选

用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以便于重组体的检出。常用营养缺陷型和抗性作为标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态作为标记。实际时究竟采用哪种遗传标记，要根据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是为了进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因的营养缺陷性或抗性菌株；如果从育种角度进行原生质体融合，由于大多数营养缺陷性菌株都会影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷性标记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷性菌株。

2.原生质体融合育种的应用

陈宁等以球形芽抱杆菌和苏云金芽泡杆菌H4为亲株（前者对淡色库蚊有高毒力，后者对粘虫、玉米螟有高毒力），在2-3 mg/ml溶菌酶浓度下，42°C酶解45分钟，获得了原生质体，其原生质体形成率和再生率分别为91.2%、37.6%及93.3%、31.2%，然后将获得的原生质体以l：1比例混合，加入40%的PEG于42°C保温5min，结果获得了既杀双翅目又杀鳞翅日幼虫的融合子。

3.在链霉菌原生质体融合育种方面

邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新留素产生菌的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产生原养型重组体的频率为10-4。其中有58%产生巴龙霉素，并从中获得了产量比原始菌株（300ug/ml）提高5-6倍的融合子。杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株进行融合，以自身抗生素抗性为标记选择种间融合子，从而获得了一株正定霉素产量较亲株提高了2.6倍的融合子。

4.优化菌发酵特性

许多种微生物能在45-65℃生存，有的甚至更高。有种耐热菌可在98℃温泉中生长繁殖。关于微生物耐热性的机理研究还不是很清楚，但其耐热性却有很重要的应用价值。如在酒精酿造中，酿酒酵母于40℃时产酒明显下降，为此必须消耗大量能源降低发酵液的温度。因此，将酿酒酵母396（能利用甘蔗糖蜜生产酒精）和假丝酵母C6（45℃生长良好）为亲本，进行原生质体融合筛选得到在40℃培养条件下原料利用率为94.3%、乙醇产量为59.7g/L的属间融合株。

5.菌种遗传特性的改良

通过原生质体融合技术使两个菌株的遗传物质得到重组，从而获得兼具两个亲本优良性状的新菌株。如苏云金杆菌以色列变种产生的杀虫毒素主要杀死双翅目昆虫，而苏云金杆菌库斯塔基变种产生的毒素蛋白主要杀鳞翅目昆虫。将这两个菌株的原生质体进行融合，筛选得到既杀鳞翅目昆虫、又杀双翅目害虫的重组菌株。

三、问题与展望

原生质体融合技术作为遗传育种的一个有效手段，已广泛应用微生物、植物育种中。但是由于融合子的筛选方法对亲本菌株要求较高，需要其自身具有或通过人为诱导使其具有某种特征型标记，若能发展出一种更为普遍的筛选方法，则能大大减少对亲本菌株的限制。微生物育种工作的各个方面。都只局限于两个菌之间的融合，没有扩展到3个以上的菌之间的融合，如果我们能够开展多个菌之间的融合，则有可能获得同时具多个优良性状的菌株，进一步扩宽这一技术的应用。并且原生质体融合技术运用否能成功仍受到客观因素的影响，这些都有待于我们进一步去研究和解决。如果将原生质体融合技术与代谢工程及各种分析方法相结合，即可阐明表型或代谢途径得到优化的分子机制，甚至发现代谢网络中一些未知的调节机制。相信随着原生质体融合技术的一步应用发展，以及与重组DNA技术、代谢工程及其分析方法等其它生物技术相结合，必将在功能基因组学的研究、揭示基因型和表型的关系以及工业微生物菌种的改进等方面发挥越来越重要的作用。

参考文献：

[1]林红雨等.欧文氏菌和棒杆菌的属间融合研究[J].微生物学通报，1999，（1）.

[2]黎永学等.双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合子筛选方法的探讨[J].食品科学，2006，（2）.

作者简介：杨其，长江大学生命科学学院生物工程系。