中国沙棘叶黄酮类成分与生态因子相关性及其生态适宜性研究

[摘要] 为了解决野生藏药资源日益濒危问题，推动藏药野生资源保护与适宜区的发展和提供人工栽培种植新方法，该文采用HPLC对不同产地中国沙棘叶中槲皮素、山柰素、异鼠李素进行含量测定，应用偏最小二乘回归法（PLSR），分析不同产地中国沙棘叶中黄酮类化学成分与生态因子间的相关性。该文基于Maxent模型结合运用ArcGIS软件，对中国沙棘进行适宜区区划研究。分析得出不同产地间中国沙棘叶中槲皮素、山柰素、异鼠李素含量差异明显，且影响槲皮素积累的主导因子为海拔高度、1月份均降水量和8月份均降水量，影响山柰素含量积累的主导因子为海拔高度、最冷季度降水量、12月份均降水量和3月份均气温，影响异鼠李素含量积累的主导因子为8月份均降水量、1月份均降水量、最冷季度降水量和海拔高度；实验结果表明中国沙棘在我国地区分布的适宜指数为0～0.708，适宜区面积59.05万km2，占全国总面积的6.13%，较适宜区面积达55.25万km2，占全国总面积的5.73%。对中国沙棘叶黄酮类成分与生态因子的相关性及中国沙棘生态适宜性研究，该法操作简单可行、结果可靠，为藏药资源现可持续开发利用提供了一种新思路。

[关键词] 藏药； 中国沙棘叶； 黄酮； 生态因子； 生态适宜性； Maxent模型

[Abstract] The study aims at providing a new suitable way to promote artificial cultivation， solving the problem of resources increasingly endangered wild medicine， and protecting the wild resources of Tibetan medicine. The content of quercetin，kaempferol and isorhamnetin was determined by HPLC. The correlation between flavonoids components and ecological factors was analyzed using partial least-squares regression （PLSR）. Based on Maxent model combining using ArcGIS software， suitable regionalization for H.rhamnoides subsp. sinensis was studied.The results showed that the difference of quercetin，kaempferol and isorhamnetin content in samples from different regions were obvious. The main factors effecting quercetin content accumulation were the altitude andthe average monthly precipitation in January and August. The main factors effecting kaempferol accumulation were the altitude andthe average monthly precipitation in the coldest quarter and December. The main factors effecting isorhamnetin accumulation were the average monthly precipitation in August， January and the coldest quarter.The regional distribution suitability index for H.rhamnoides subsp. sinensis was 0-0.708. The suitable area 590 500 km2， accounting for 6.13% of the total area. The preferably suitable area was 552 500 km2， accounting for 5.73% of the total area.The methods used in the study is simple and feasible， the result is reliable which provide a new approach for Tibetan medicine resources sustainable exploitation and utilization.

[Key words] Tibetan medicine； Hippophae rhamnoides subsp. sinensis leaf； flavonoids； ecological factors； ecological suitability； Maxent model

沙棘Hippophae rhamnoides L.，又名醋柳、黑刺、酸刺，系胡颓子科Elaeagnaceae沙棘属Hippophae Linn.灌木或乔木[1]。中国沙棘H. rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi是我国特有种，在国内分布最广、且用量最大，主要分布在西北、华北和东北各省[2-4] 的河流、山川以及丘陵沟谷两岸，分布资源量大[5]。目前对于中国沙棘的研究，多集中于化学成分[6]、药理活性、临床应用[7]、产品开发[8]和生态环境改造[9-10]等。黄酮类对癌症、糖尿病和心血管疾病等慢性疾病的预防和管理都有潜在的治疗作用[11-13]。沙棘中含有丰富的黄酮类化合物，主要以槲皮素、异鼠李素、山柰素的苷存在[14-15]。本研究应用偏最小二乘回归法[16-19]（PLSR）分析中国沙棘叶黄酮类成分与气候因子相关性，并进一步对影响中国沙棘叶化学成分主导生态因子范围进行确定。同时运用Maxent模型以及GIS技术[20-21]对中国沙棘进行适宜性区划研究，找出影响中国沙棘分布的主要生态因子以及生态适宜区，对其进行分布预测和适生等级划分，指导中国沙棘的野生资源保护和在适生区推广人工种植。

1 材料

1.1 植物 样品来源于四川省、自治区、甘肃省和山西省，共17批次，实地采集新鲜叶片，用硅胶干燥，并记录采集地海拔及经纬度，见表1。经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定均为胡颓子科沙棘属植物中国沙棘H. rhamnoides subsp. sinensis的干燥叶片，凭证标本保存于成都中医药大学民族医药学院标本室。

1.2 中国沙棘地理分布数据 中国沙棘在中国的分布数据，主要来源于中国数字植物标本馆（http：//.cn/），以及文献整理与实地采样调查。野外采集的中国沙棘标本，由成都中医药大学张艺研究员鉴定。初步收集中国沙棘分布点161个，包括物种名、经度和纬度等准确信息，主要分布于四川、甘肃、山西、青海、陕西等地区。

1.3 生态因子数据 本文所使用的气候和高程数据来源于全球气候数据库（Worldclim；http：///），由中国医学科学院药用植物研究所资源中心提供，包含海拔、月平均降水量、月平均气温等44个生态因子。

2 方法

2.1 中国沙棘叶中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量测定 采用高相液相色谱法（HPLC）测定中国沙棘叶黄酮类成分（槲皮素、山柰素、异鼠李素）。精密称定样品粉末（过3号筛）1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入乙醇50 mL，称重，水浴加热（80 ℃）回流60 min，冷却，再称重，用乙醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，加盐酸4 mL，水浴加热（80 ℃）水解30 min，立即冷却，滤过。取续滤液过微孔滤膜作为供试品溶液。色谱条件为：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，柱温30 ℃，流速 1.0 mL・min-1，进样量10 μL，检测波长370 nm，流动相甲醇-0.4%磷酸溶液（54∶46）。方法学考察结果显示精密度、稳定性和重复性良好。

2.2 适宜性分布区域划研究 本文从44个生态因子中初步筛选出19个贡献率较高的生态因子，再基于Maxent模型ROC评价曲线，同时运用ArcGIS软件，选取总贡献率≥90%的11个生态因子作为主要生态因子，再加载到ArcMap中。加入从国家基础地理信息系统网站下载的中国地图，采用人工（manual）分级方法分析，划分出中国沙棘适宜性分布区域，分为适宜区、较适宜区和不适宜区。

2.3 偏最小二乘回归法分析 应用SIMCA-P 11.5 软件检验方法进行PLSR分析，分析不同地区中国沙棘叶化学成分及其影响因子的相关变化趋势。将有效成分作为因变量，生态因子值作为自变量建立回归模型。各自变量纵坐标为正，则因变量与该自变量呈正相关；纵坐标为负，则表现负相关。最后通过变量投影重要性指标 （variable importance in projection，VIP）来测量，其值越大，说明自变量的重要程度越大。

3 结果与分析

3.1 不同产地中国沙棘叶中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量比较分析 本文分为4个产地，分别是四川、、甘肃和山西。不同产地间中国沙棘叶的化学成分含量存在差异。其中，各产地槲皮素平均含量大小为四川>甘肃>>山西；各产地山柰素平均含量大小为甘肃>>四川>山西；各产地异鼠李素平均含量大小为四川>>甘肃>山西，见图1。

3.2 中国沙棘适宜性区划分析 根据Maxent模型预测结果，用GIS软件空间分析工具，得到中国沙棘在我国的适宜指数为0～0.708。再根据中国沙棘资源调查以及已知的分布情况，采用人工分级方法分析，分为3个等级：适生性概率（即适合中国沙棘生长的可能性概率）0～0.2为非适宜区，适生性概率0.2～0.4较适宜区，适生性概率0.4以上为适宜区，见图2。

由图2可知，中国沙棘在我国分布范围涉及山西、陕西、甘肃、宁夏、青海、四川、、内蒙古、河北、辽宁10省（自治区）。适宜区主要集中于黄土高原以及青藏高原东北至东南的边缘地区，从西南向东北方向呈带状分布在横断山脉东北侧与太行山脉之间。适宜区包括四川省的阿坝藏族羌族自治州红原、若尔盖以及甘孜藏族自治州甘孜、德格、石渠地区；青海省的西宁、黄南藏族自治州、海北藏族自治州以及海东地区；甘肃省南部的兰州、甘南藏族自治州、定西、临夏、天水、陇南、平凉、庆阳地区；宁夏回族自治区的固原以及中卫、吴忠的南部地区；陕西省的榆林、延安，以及宝鸡、汉中、咸阳与甘肃交界地区；

山西省中部的太原、吕梁、晋中、长治、临汾地区；自治区东部的拉萨、林芝、昌都地区。适宜区面积59.05万km2，占全国总面积的6.13%。较适宜区域主要位于极高适生分布区域的外缘，向北延伸至河北、辽宁、内蒙古地区。较适宜区面积55.25万km2，占全国总面积的5.73%。

3.3 生B因子与化学成分含量的PLSR分析 选取总贡献率≥90%的11个生态因子，对不同产地的中国沙棘叶与其进行PLSR分析，其中11个生态因子包括：海拔X1、最冷季度降水量X2、最暖季度降水量X3、1月月均降水量X4、最干季度平均温度X6、8月月均降水量X7、11月月平均气温X8、3月月平均气温X9、2月月平均气温X10和1月月平均气温X11。结果表明，中国沙棘叶中槲皮素含量（Y）与11个生态因子间的PLSR模型为：Y=0.765X1+0.297X2+0.073X3+0.504X4+0.003X5-0.006X6-0.432X7-0.002X8+0.007X9+0.026X10-0.063X11；中国沙棘叶中山柰素含量（Y）与11个生态因子间的PLSR模型为：Y =0.473X1-0.125X2+0.046X3-0.061X4-0.236X5-0.002X6+0.007X7+0.025X8-0.199X9-0.049X10+0.010X11；中国沙棘叶中异鼠李素含量（Y）与11个生态因子间的PLSR模型为：Y=0.831X1+0.273X2-0.163X3+0.640X4-0.074X5-0.004X6-0.961X7-0.034X8+0.287X9+0.133X10-0.135X11，见图3。

由图3（A）可以看出，海拔高度与中国沙棘叶中槲皮素含量呈极显著正相关，其次为1月份均降水量和最冷季度降水量；8月份均降水量与槲皮素含量呈极显著负相关。VIP直方图结果表明：海拔高度（1.575），1月份均降水量（1.441）和8月份均降水量（1.143）的权重系数>1，是影响槲皮素含量的最主要因素；最冷季度降水量（0.998），最暖季度降水量（0.831）的权重系数>0.8，是影响槲皮素含量的次主要因素；其余6个生态因子对槲皮素含量基本不具备解释意义。

由图3（B）可以看出，海拔高度与中国沙棘叶中山柰素含量呈极显著正相关，其次为最暖季度降水量；12月份均降水量与山柰素含量呈极显著负相关，其次为3月份平均气温和最冷季度降水量。VIP直方图结果表明：海拔高度（1.713），12月份均降水量（1.437），3月份平均气温（1.322）和最冷季度降水量（1.098）的嘀叵凳>1，是影响山柰素含量的最主要因素；1月份均降水量（0.922），最暖季度降水量（0.885）和2月份平均气温（0.817）的权重系数>0.8，是影响山柰素含量的次要主要因素；其余4个生态因子对山柰素含量基本不具备解释意义。

由图3（C）可以看出，海拔高度与中国沙棘叶中异鼠李素含量呈极显著正相关，其次为1月份均降水量和最冷季度降水量；8月份均降水量与异鼠李素含量呈极显著负相关。VIP直方图结果表明：8月份均降水量（1.858），海拔高度（1.245），1月份均降水量（1.121）和最冷季度降水量（1.077）的权重系数>1，是影响异鼠李素含量的最主要因素；3月份平均气温（0.957），最暖季度降水量（0.821）的权重系数>0.8，是影响异鼠李素含量的次要主要因素；其余5个生态因子对异鼠李素含量基本不具备解释意义。

4 讨论

4.1 中国沙棘叶黄酮类成分与生态因子相关性研究 在含量测定中，发现了来自四川省阿坝州红原县阿木乡的1批次中国沙棘叶中异鼠李素质量数为0.62%，明显高于其他16个批次的含量。原因可能为红原县海拔高，温度常年偏低，对异鼠李素的积累有促进作用。来自山西4个批次的中国沙棘叶中槲皮素、山柰素和异鼠李素均比来自四川、和甘肃的含量低，山西海拔不到1 000 m，降水，温度均和其他3个地区有明显差异，其含量差异也因有一定相关性。

确定了影响中国沙棘叶中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量积累的主导生态因子具体如下：影响槲皮素积累的主导因子为海拔高度、1月份均降水量和8月份均降水量；影响山柰素含量积累的主导因子为海拔高度、最冷季度降水量、12月份均降水量和3月平均气温；影响异鼠李素含量积累的主导因子为8月分均降水量、1月份均降水量、最冷季度降水量和海拔高度。

采用HPLC对17批次不同产地中国沙棘叶黄酮类成分进行了分析，评价比较了其质量差异，发现来四川、、甘肃等不同产区的中国沙棘叶品质存在差异性，同时也有一定的相关性。同时，结合PLSR探讨了经纬度、温度、降水等生态因子对其化学成分的影响，最终明确影响槲皮素、山柰素和异鼠李素含量积累的主导因，为藏药中国沙棘的栽培、采收以及适宜性推广提供了科学依据。

通过SIMCA-P分析对生态因子研究时，发现对于降水量的考察有不足之处，比如四川省阿坝州红原县阿木乡等藏区，12月份时沙棘叶已经大部分凋落，此时研究雨水量对中国沙棘化学成分积累的影响就与实际情况不相符，所以应注重实际情况的考察，注重数据来源的科学性和合理性。

4.2 根据Maxent生态位模型分析结果 中国沙棘在我国地区分布的适宜指数为0～0.708，适宜区主要集中于黄土高原以及青藏高原东北至东南的边缘地区，从西南向东北方向呈带状分布在横断山脉东北侧与太行山脉之间，面积59.05万km2，占全国总面积的6.13%，涉及山西、陕西、甘肃、宁夏、青海、四川、、内蒙古、河北、辽宁10省（自治区）；较适宜区域主要位于极高适生分布区域的外缘，面积55.25万km2，占全国总面积的5.73%，涉及河北、辽宁、内蒙古等省（自治区）。

根据Maxent生态位模型的检验结果，并结合课题组前期资源调查及文献中对中国沙棘分布情况的记载，得到Maxent模型的适宜区区划结果的可信度高，而对于分布区研究还有GARP，ENFA，Bioclim，Domain等生态位模型，后期可结合各种生态位模型综合分析，进一步推进中国沙棘资源进行可持续开发利用。

从结果看，适宜区所涉范围为采集的地点和标本记录地点，然而研究者之前没有调查过的地点，是否有沙棘还未知。Maxent生态位模型是根据已有的数据进行分析和预测，对没有数据记录的省无法分析和预测，在以后的研究中，会涉及多个省市，确保我们的数据包含所有中国沙棘生长区域，确保数据的全面性和科学性。

[参考文献]

[1] Rousi A. The genus Hippophae L. A taxonomic study[J]. Ann Bot，1971， 8（3）： 177.

[2] 中国科学院西北高原生物研究所. 藏药志[M]. 西宁： 青海人民出版社 1991 ： 104.

[3] 李书心. 辽宁植物志[M]. 沈阳： 辽宁科学技术出版社，1988： 1162.

[4] Rongsen L. Seabuckthorn： a multipurpose plant species for fragile mountains[M]. Kathmandu： International Centre for Integrated Mountain Development，1992.

[5] 刘川， 文检， 苏永文， 等. HPLC法测定藏药“巴尔达尔”黄酮类成分含量及指纹图谱的研究[J]. 中国中药杂志， 2016， 41（4）： 586.

[6] Kumar M S Y， Tirpude R J， Maheshwari D T， et al. Antioxidant and antimicrobial properties of phenolic rich fraction of Seabuckthorn （Hippophae rhamnoides L.） leaves in vitro[J]. Food Chem， 2013， 141（4）： 3443.

[7] Lee H， Kim M， Lee K， Mi， et al. Anti-visceral obesity and antioxidant effects of powdered sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） leaf tea in diet-induced obese mice[J]. Food Chem Toxicol，2011， 49（9）： 2370.

[8] ⒀┝瑁 权永荣， 陈旭华. 沙棘产品的开发及应用前景[J]. 安徽农业科学，2012， 40（16）： 8960.

[9] 陈玉芳. 沙棘林学特性及造林技术[J]. 现代农业科技，2015 （5）： 183.

[10] 张瑞， 白凤林， 贾利红， 等.晋陕蒙砒砂岩区十大孔兑沙棘种植抗旱措施[J]. 中国水土保持，2015， 1（4）： 3.

[11] Andrae-Marobela K， Ghislain F W， Okatch H， et al. Polyphenols： a diverse class of multi-target anti-HIV-1 agents[J]. Curr Drug Metab，2013， 14（4）： 392.

[12] Johnson M H， de Mejia E G， Fan J， et al. Anthocyanins and proanthocyanidins from blueberry-blackberry fermented beverages inhibit markers of inflammation in macrophages and carbohydrate-utilizing enzymes in vitro[J]. Mol Nutr Food Res，2013， 57（7）： 1182.

[13] Jacques P F， Cassidy A， Rogers G， et al. Higher dietary flavonol intake is associated with lower incidence of type 2 diabetes[J]. J Nutr，2013， 143（9）： 1474.

[14] Teleszko M， Wojdyo A， Rudziska M， et al. Analysis of lipophilic and hydrophilic bioactive compounds content in sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） berries[J]. J Agric Food Chem，2015， 63（16）： 4120.

[15] Ma X， Laaksonen O， Zheng J， et al. Flavonol glycosides in berries of two major subspecies of sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） and influence of growth sites[J]. Food Chem，2016， 200： 189.

[16] 王惠文. 偏最小二乘回归方法及其应用[M]. 北京： 国防工业出版社， 1999.

[17] 贾光林， 黄林芳， 索风梅， 等.人参药材中人参皂苷与生态因子的相关性及人参生态区划[J]. 植物生态学报，2012， 36（4）： 302.

[18] 李文涛， 黄林芳， 杜静， 等.基于 PLS 分析石斛品质与生态因子的相关性[J]. 应用生态学报，2013， 24（10）： 2787.

[19] 侯美亭， 胡伟， 乔海龙， 等.偏最小二乘 （PLS） 回归方法在中国东部植被变化归因研究中的应用[J]. 自然资源学报，2015， 30（3）： 409.

[20] 胡忠俊， 张镱锂， 于海彬. 基于 MaxEnt 模型和 GIS 的青藏高原紫花针茅分布格局模拟[J]. 应用生态学报，2015， 26（2）： 505.

[21] Cao B， Bai C K， Zhang L L， et al. Modeling habitat distribution of Cornus officinalis with Maxent modeling and fuzzy logics in China[J]. J Plant Ecol，2016， doi： 10.1093/jpe/rtw1009.