超高效液相色谱―串联质谱测定土壤中磺胺类药物残留

[摘 要] 建立了固相萃取-超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法测定土壤中痕量的18种磺胺类残留的方法，土样提取液经过固相萃取富集净化后由液相色谱分离、三重四级杆质谱检测。该方法在10 min内完成对18种目标化合物的分析。磺胺类线性范围为1～100?g/L，相关系数均大于0.995，6次空白加标重复测定的相对标准偏差（n=6）为1.8%～15.9%。l8种目标化合物的方法检出限在0.05～0.48 ?g/kg之间，实际样品的加标回收率为64.9%～104%。该方法操作简便，重现性好，可用于土壤中磺胺类的检测。

[关键词] 磺胺类；液质联用；固相萃取

中图分类号：O657 文献标识码：B 文章编号：2055-5200（2014）02-051-07

磺胺类（sulifonamides，SAS）药物为广谱抑菌药，因其具有抗菌谱广、高效、低毒、价格低廉等特点，在畜牧、水产等养殖生产中广泛使用[1-9]。磺胺类药物用于预防和治疗细菌性感染疾病[8，10-13]，但过量使用有可能在人体内蓄积，蓄积浓度超过一定值时对人体有害，并导致病原体产生耐药性[7，10，14-16]。与其它常用抗生素相比，这些药物性质更加稳定，但其在动物源性食品中的残留可通过食物链对人体健康构成危害[4，9，11]。

抗生素摄入后大部分以原药和代谢产物形式随粪尿排出体外，成为新的环境污染物，并以多种途径进入河水、地表水甚至饮用水及土壤中[6，12，17]。有调查表明，磺胺药物在人体中长期存在会导致许多细菌对其产生抗药性，且有潜在的致癌性，已被多个国家规定限量或禁止使用[18-19]。

SAS药物及其代谢物的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS） [4，7-9，18]。HPLC的灵敏度较低且无法提供结构信息，一般作为筛选方法；HPLC-MS/MS灵敏度高，选择性和特异性好，抗干扰能力强，能够对目标化合物含量较低的样品进行很好的定性确认，是目前较为先进和常用的动物源性食品中药物残留检测方法。液质联用法由于其较高的灵敏度被广泛应用于环境中抗生素类药物的检测[8-10，19-20]。本文采用了固相萃取超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法测定18种磺胺类抗生素，优化了前处理条件和分离检测条件，并应用于实际土样、污泥的分析，该方法具有操作简单、试剂少、分离速度快、灵敏度高、定量准确、线性范围宽，等优点[21-25]。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

ACQUITY UPLC XevoTM TQ MS 超高效液相色谱仪串联质谱仪（美国Waters公司）； 固相萃取仪（美国Supelco公司）；离心机（Sigma公司），超声波清洗器（美国Cole―Parmer公司），Oasis HLB固相萃取柱（6mL/500 mg，Waters公司）。甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher Scientific），甲酸（纯度为99%，Acros Organics），氨水、盐酸（优级纯，北京化学试剂公司）；实验室用水均为超纯水，电阻率l8.2 MQ・cm（Millipore超纯水机制备）。18种磺胺类购自Dr.Ehrenstorfer公司（Augsburg，Germany），纯度均高于97%。

1.2 标准溶液配制

以甲醇为溶剂，分别配置质量浓度为1000mg/L的标准储备液，于-18℃保存。临用时用0.1%甲酸水溶液稀释上述标准储备液，配制成不同浓度的标准工作液。

1.3 样品采集

土壤样品于2013年3月采自宁波，将不同土壤污泥样品分别风干后，研磨混匀，转移至密闭玻璃瓶中-20℃保存。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取 称取10g样品于50mL离心管中，用乙腈+水+2%甲酸（49+49+2，v/v/v）20mL超声提取10min，振荡10min，4℃离心10min（9500 r/min），将上清液转入50mL容量瓶中，重复上述步骤，合并提取液，定容。分取25mL，氮气条件下35℃水浴吹去大部分乙腈，剩余提取液待过柱。

1.4.2 净化 依此用6mL甲醇和6mL水条件化小柱，将上述提取液上样，再用5mL水淋洗，真空抽干10min后，用10mL甲醇洗脱收集，氮气条件下35℃水浴吹干，1mL甲醇定容，过0.22?m滤头，待上样。

1.5 LC-MS/MS测定条件

1.5.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18 2.1×100mm，1.7?m；进样量：5?L；柱温：30℃；梯度洗脱及流动相参数设置如表1：

表1 淋洗溶剂及参数设置

时间/min 流速/ml/min 0.1%甲酸水溶液+10mmol/L乙酸铵 甲醇/%

0 0.3 90 10

1.0 0.3 90 10

2.5 0.3 80 20

8 0.3 60 40

8.1 0.3 20 80

9.2 0.3 20 80

9.5 0.3 90 10

10 0.3 90 10

1.5.2 质谱条件 源温：150℃；雾化温度：500℃；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；电喷雾电压：2.0KV；雾化气：1000L/h；各化合物的定性离子、定量离子、去簇电压和碰撞能见表2。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件优化

本文采用了含甲酸的水溶液加入适量有机溶剂作为提取液。有机溶剂选择了和水互溶的甲醇和乙腈，鉴于甲醇提取液中杂质较高，并且乙腈比甲醇有更好的除蛋白质效果，所以选择乙腈+水+甲酸作为提取溶液。在此基础上考察了乙腈+水+甲酸（24/74/2，v/v/v）、乙腈+水+甲酸（49/49/2，v/v/v）、乙腈+水+甲酸（74/24/2，v/v/v）3种提取液系统对提取效果的影响，结果显示当使用乙腈+水+甲酸（49/49/2，v/v/v）和乙腈+水+甲酸（74/24/2，v/v/v）提取时，各组分回收率均在60%～126%之间，考虑到环境安全问题，选择含有机溶剂更少的乙腈+水+甲酸（49/49/2，v/v/v）作为本文的提取溶剂。相比单独采用超声或者振荡提取，还是超声和振荡同时进行提取更快速完全。

采用超声振荡提取，土壤样品中磺胺类可完全提取出来，提取效率为62%～116%，明显高于其他提取条件下的提取效率。由于磺胺类药物在土壤表面的吸附机理包含离子键作用和氢键作用，故提取液中加入甲酸[1-5，8，26-28]，目标药物显示弱碱性，在提取液中加入甲酸更有利于破坏氢键，利于药物与污泥解离，且在酸性溶液中解离效果更佳，因此，在酸性条件下的提取效果更好。

2.2 固相萃取条件优化

土壤中的天然有机质（如腐败酸，等）含量较高，在液相色谱-质谱分析过程中，会产生基质抑制，造成被测化合物的灵敏度降低。因此，本文采取固相萃取技术对提取液中的目标药物进行富集净化。影响固相萃取富集效率的因素有固相萃取小柱类型、样品pH值及上样速度等，采用空白加标对上述因素进行优化。基于目标药物磺胺类组分较多，本实验比较了HLB柱、MAX柱、MCX柱、C18柱、活性炭及纳米管等的富集效果。实验结果表明，磺胺类药物经过HLB柱后的绝对回收率均高于66%，而其他柱子均有组分回收率偏低。因此，选用HLB柱对污泥样品进行富集。

同时还比较了样品提取液加与不加甲酸时目标化合物空白加标回收率的差异，结果发现甲酸提取液的回收率可达70%以上，符合预期目标，于是选择加酸。上样流速控制在连续滴但不成线即可。由于甲醇的洗脱能力很强，目标化合物当即被洗脱出来[4，8，10-14，29]。

2.3 方法验证

2.3.1 方法线性范围和检出限 将标准储备液1000mg/L用0.1%甲酸水溶液稀释至标准工作溶液系列1～100?g/L（1、5、10、20、50、100），按之前摸出仪器条件进行分析测试。以定量离子对的响应面积（Y）和对应浓度（X，?g/L）进行线性回归，得到标准曲线，其线性方程和相关系数等见表3。以2-5倍基线噪音响应对应的浓度进行空白加标，以3倍信噪比（S/N）估算出方法检出限，18种目标化合物的检出限在0.05?g/kg～0.48?g/kg之间，详见表4，相关对应色谱图见图1。与已有的文献相比，本方法的检出限处于较低或相当的水平[4，10-14，30-32]。

表3 目标化合物的回归方程、线性范围、相关系数

序号 组分 回归方程 线性范围

/?g/L 相关系数

r

1 磺胺醋酰 Y=96.59X-38.23 1～100 0.9989

2 磺胺吡啶 Y=106.1X+63.34 1～100 0.9992

3 磺胺嘧啶 Y=64.54X+8.703 1～100 0.9983

4 磺胺甲唑 Y=82.17X+11.45 1～100 0.9956

5 磺胺噻唑 Y=209.2X+60.58 1～100 0.9997

6 磺胺甲基嘧啶 Y=77.87X+36.45 1～100 0.9971

7 磺胺恶唑 Y=93.71X+57.05 1～100 0.9990

8 磺胺二甲异恶唑 Y=152.8X+51.23 1～100 0.9991

9 磺胺甲噻二唑 Y=589.4X-104.7 1～100 0.9973

10 磺胺苯甲酰 Y=873.8X+26.27 1～100 0.9998

11 磺胺二甲嘧啶 Y=336.9X+43.79 1～100 0.9986

12 磺胺甲氧哒嗪 Y=159.5X+22.18 1～100 0.9997

13 磺胺间甲氧嘧啶 Y=87.57X+22.82 1～100 0.9977

14 磺胺氯哒嗪 Y=472.8X+183.0 1～100 0.9993

15 磺胺喹恶啉 Y=93.59X+320.3 1～100 0.9969

16 磺胺邻二甲氧嘧啶 Y=156.4X+107.8 1～100 0.9996

17 磺胺间二甲氧嘧啶 Y=170.9X-7.316 1～100 0.9990

18 磺胺苯吡啶 Y=630.1X+528.6 1～100 0.9957

2.3.2 精密度试验 以1?g/kg、5?g/kg、10?g/kg三个浓度的污泥加标回收试验，每个浓度平行测定6次，结果见表4。由表可见目标化合物的平均回收率为64.9%～104%，批内相对标准偏差（RSD）为1.8%～15.9%，批间相对标准偏差RSD为2.1%～9.4%这些数据说明，该方法具有较好的灵敏度、准确性和重现性，详见表4。

2.4 方法应用

应用本方法对宁波某沼泽池采集的30多个污泥样品进行检测，发现检出最多的是磺胺间甲氧嘧啶，具体见图2（检出组分标准品与检出土壤样品的选择离子色谱图），由此可见，本方法实用可行。

3 结论

本文建立了土壤中磺胺类抗生素药物的超高效液相色谱三重四级杆质谱联用的分析方法。该方法可快速对污泥样品进行提取，采用HLB柱富集净化后，对目标物进行分析测试，该方法检出限最高可达0.08?g/kg，外标法定量准确性也比较好，可同时测定18中磺胺类药物甚至更多，满足土壤中污染物痕量分析的要求[4，10-12，31-33]。

参 考 文 献

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