高效液相色谱法在鱼药残留测定中的应用

【摘 要】为了防范和治疗疾病，在养殖过程中对鱼用药是不可避免的，但鱼体内的药物残留问题也受到大家的重视。人们建立了许多测定鱼药残留的方法，高效液相色谱法就是其中之一。本文结合具体试验，介绍了高效液相色谱法在鱼药残留测定中的应用。结果表明：该方法具有灵敏、准确、简便、快速等优点，适用于鱼药残留的检测。

【关键词】药物残留；测定；磺胺类药物；高效液相色谱法

近年来，我国水产养殖业发展迅速，其集约化的程度提高的很快，可是随着该产业的发展，水质渐趋恶化，疾病的预防与治疗问题变得颇为紧迫，因此，越来越多地对于鱼进行用药，但鱼产品中的药物残留状况不乐观。为了让消费者用上放心的鱼产品，就必须加强鱼药残留的测定工作。目前，动物性食品中兽药残留量的测定主要有分光光度法、示波极谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、气相色谱法和高效液相色谱-质谱法等。下面，就结合具体试验，介绍高效液相色谱法在鱼药残留测定中的应用。

1.试验部分

1.1仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪，配2487紫外检测器；ALLEGRATM 21R高速冷冻离心机；BuchiR-205 Advance旋转式蒸发仪。喹酸、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、萘啶酸、呋喃唑酮标准储备溶液：分别称取各标准品0.0100g，用乙腈（1+1）溶液溶解后定容至100ML，配成100mg・L-1标准储备溶液。用时用乙腈稀释配成所需浓度。乙腈、甲醇、乙酸均为色谱纯；其余试剂为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2色谱条件

Waters Symmetry C18色谱柱（250MM×4.6mm，5μm），柱温35℃，流量1.0mL・Min-1，检测波长265nM，进样量20μL。流动相A为乙腈，B为0.08mol・L-1乙酸溶液，梯度洗脱程序：0～10min，A由10%升至60%，保持10Min；20～20.05min，A由60%降至10%，保持9.95min。

1.3试验方法

1.3.1样品提取

称取鱼肉试样5.000g于50mL离心管中，加入乙腈20mL及经650℃烘干的无水硫酸钠10g，涡旋振荡2min，以10000r・min-1转速离心10min，上清液转移至125mL分液漏斗中。残渣中加入乙腈20mL，按上述方法再提取一次，上清液合并于分液漏斗中。

1.3.2脱脂

加正己烷30mL于分液漏斗中，加塞剧烈振荡5min，充分静置分液，收集乙腈层（下层）于250mL旋转蒸发瓶中，加入正丙醇5mL，于40℃水浴条件下减压旋转蒸发至干。

1.3.3净化

1）中性氧化铝柱净化：中性氧化铝柱使用前用乙腈-水（95+5）溶液10mL预洗并活化。测定磺胺类和呋喃唑酮药物时，将第1.3.2节中的残渣用乙腈-水（95+5）溶液5mL溶解，旋转蒸发瓶内试样稀释液过柱，收集稀释液至另一旋转蒸发瓶中，并于40℃水浴条件下减压旋转蒸发至干。往旋转蒸发瓶中加入乙腈-水（4+6）溶液1mL溶解残渣，以10000r・min-1转速离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过膜，滤液在色谱条件下进行分析。

2）C18柱净化：测定喹酸和萘啶酸药物时，取1.3.2节中的残渣用0.05mol・L-1磷酸二氢钠溶液5mL溶解，C18固相萃取柱先后用10mL甲醇和0.05mol・L-1磷酸二氢钠溶液10mL预洗并活化。旋转蒸发瓶内试样稀释液过柱，再用0.05mol・L-1磷酸二氢钠溶液10ML清洗C18柱，弃掉流出液。

2.结果与讨论

2.1色谱柱的选择

磺胺类、喹诺酮类和呋喃唑酮的分离通常采用C18反相柱，试验对Agilent SB C18柱、Agilent TC C18柱、Sunfire C18柱和Symmetry C18柱的分离效果进行了考察。结果表明：除Agilent TC C18柱的分离过程中有小的杂质峰出现外，其它3种色谱柱均可实现基质和药物的较好分离；比较基线的水平性和色谱峰的响应值，Symmetry C18柱的分离效果较好，试验选择Symmetry C18柱为色谱分离柱。

2.2流动相组成及洗脱程序的选择

磺胺类药物含有氨基、苯磺酰胺结构，具有弱碱性；喹诺酮类药物是两性化合物；呋喃唑酮结构中也含有两性基团，因此调节流动相的pH值可抑制弱碱的离解，从而改变色谱峰的保留时间。结果表明：酸度过高，磺胺类药物较难完全分离，且对色谱柱有所损伤；酸度过低，色谱峰会出现明显拖尾现象，试验选择0.08mol・L-1乙酸溶液控制流动相酸度。

乙腈与乙酸溶液以不同体积比组成的混合溶液影响保留时间和峰形。由于萘啶酸极性较小，C18色谱柱对其吸附较强，以乙腈-0.08mol・L-1乙酸（15+85）混合溶液为流动相等度洗脱，萘啶酸在73.3Min时出峰，大大延长分析时间，且由于药物在流动相中的扩散作用，峰形也较差。以乙腈-0.08mol・L-1乙酸（30+70）混合溶液为流动相等度洗脱，虽能缩短分析时间，但磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的分离度不够理想，各峰的峰形较宽，且磺胺嘧啶出峰时间过早，与杂质峰较难完全分离。

为了保证各目标物具有较好的分离效果和色谱峰形，试验采用乙腈和0.08mol・L-1乙酸溶液作为流动相，采取合适的梯度淋洗条件，不但较好地实现了7种药物的分离，而且各峰分离度较大，峰形尖锐，对称性好。7种兽药的色谱图见图1。

图1 7种兽药的色谱图

2.3提取液的选择

所测定的目标物大部分属于酸碱两性化合物，含有氨基、羧基等极性基团，因此目前用于提取这些药物的试剂主要有乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇以及按照一定比例组成的混合溶液，试验结果表明：二氯甲烷和乙酸乙酯的溶解性较强，会提取出类脂物，浓缩后不容易脱脂；乙腈对动物蛋白具有良好的变性作用，在能够有效提取出目标药物的同时，与其它有机溶剂相比，对脂类的溶解度也较小，且在沉淀样品中蛋白质方面要优于甲醇和丙酮，因此，试验选用乙腈作为提取剂。由于水产动物中水分含量较高，加入无水硫酸钠能够有效防止组织中水分及水溶性蛋白质进入乙腈相，同时硫酸钠的存在可促使蛋白质变性分散，以及防止样品形成块状影响提取。

2.4净化的选择

试验发现在低浓度药物检测时，有些基质的存在干扰了对目标药物峰的定性定量分析、降低了检测灵敏度。仅仅通过正己烷脱脂净化是不够的，只是去除大部分的非极性杂质成分，许多极性物质如磷脂、糖蛋白等仍然存在于提取溶剂中，需采用固相萃取柱进行净化。试验通过不同类型、不同种类填料和不同填料量的固相萃取柱对7种目标化合物净化效果的比较，得出了针对不同目标化合物采取不同的固相萃取柱净化方法。中性氧化铝柱适合对磺胺类和呋喃唑酮药物的净化。因为中性氧化铝柱（PH 7.5）是强极性吸附剂，表面呈中性，容易保留杂环类，芳香烃和有机胺等富电化合物，如食品中色素等杂质的去除多用此机制。试验还选用了C18固相萃取柱对喹酸和萘啶酸进行净化。

2.5标准曲线和检出限

分别移取一定量的1.0mg・L-1标准中间液，用乙腈稀释成0.05，0.1，0.2，0.5，1.0mg・L-1混合标准工作溶液，按色谱条件进行测定。以各化合物的峰面积A对其质量浓度ρ（mg・L-1）进行线性回归，线性范围均为0.05～1.0mg・L-1，所得线性回归方程和相关系数见表1。以3倍信噪比（S/N）对应的浓度计算方法的检出限，结果见表1。

2.6 方法的回收率和精密度

取6份罗非鱼、鳙鱼及对虾空白样品，添加不同浓度水平的7种化合物进行加标回收试验，结果见表2。

3.结束语

试验结果表明：鱼药的质量浓度与其峰面积均在0.05～1.0mg・L-1范围内呈线性关系，检出限（3S/N）为0.01～0.04mg・kg-1。采用高效液相色谱法的回收率在68.2%～97.3%之间，相对标准偏差（n=6）在1.6%～14%之间，在准确度、精密度方面能满足要求，适合日常检测鱼药残留的需要。

参考文献

[1] 李孟玻；张德云；彭之见；赵谋明.高效液相色谱法测定鱼肉中残留磺胺类药物[J].理化检验（化学分册），2006年08期

[2] 赵亚华；李勇；何学芳.高效液相色谱法同时测定动物源食品中22种兽药残留技术研究[J].中国卫生检验杂志，2009年 第8期