蛋白干预对气阴两虚2型糖尿病大鼠氨基酸代谢谱的影响

[摘要] 该文研究植物蛋白和动物蛋白对气阴两虚2型糖尿病大鼠氨基酸代谢谱的影响。将110只雄性SD大鼠随机分为空白组（10只），糖尿病模型组（20只），病症结合组（80只），正常组大鼠给予普通饲料，其余给予高糖高脂饲料全程喂养，期间病症结合组灌服青皮附子（15.75 g・kg-1）每日1次，5周后，腹腔注射小剂量链脲佐菌素（40 mg・kg-1）建立实验性糖尿病大鼠模型，将病症结合成模的大鼠按照血糖随机分为病症结合1组（气阴两虚糖尿病组，15.75 g・kg-1）， 病症结合2组（植物蛋白组，0.5 g・kg-1）， 病症结合3组（动物蛋白组，0.5 g・kg-1），病症结合4组（黄连素组，0.1 g・kg-1），连续灌胃给药4周。蛋白干预4周后，腹主动脉采血分离其血清，运用AQC柱前衍生高效液相色谱法，利用荧光检测器对血清中游离氨基酸进行分析。蛋白干预4周后，植物蛋白、动物蛋白与黄连素对2型糖尿病大鼠体重和血糖无明显影响。植物蛋白组与动物蛋白组相比较，气阴两虚2型糖尿病大鼠血清中组氨酸和脯氨酸（P

[关键词] 蛋白； 气阴两虚； 2型糖尿病； 氨基酸

Effect of protein intervention on amino acid metabolism spectrum of

Qi and Yin deficiency type 2 diabetic rats

MA Lina1， MAO Xinmin1， MA Xiaoli2， LI Linlin3， WANG Ye3， TAO Yicun3，

WANG Jingwei3， GUO Jiajia3， LAN Yi4*

（1. Institute of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China；

2. Analytical&Testing Center of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China；

3. Department of Pharmacology， Basicl Medicinal College of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China；

4. Department of Cadres No.2 of Traditional Chinese Medicine Hospital in Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000， China）

[Abstract] To study the effect of plant protein and animal protein on amino acid metabolism spectrum of Qi and Yin deficiency type 2 diabetic rats. 110 male SD rats were randomly divided into blank group （n=10）， diabetic model group （n=20）， diseasesymptoms group （n=80）. The rats of blank group received ordinary feeding， while other groups were fed with high sugar and fat diets. During the whole process of feeding， rats of diseasesymptoms group were given with QingpiFuzi （15.75 g・kg-1） once a day through oral administration. Five weeks later， the rats were given with a low dose of STZ （40 mg・kg-1） by intraperitoneal injection to establish experimental diabetic models. Then the models were randomly divided into diseasesymptoms group 1 （Qi and Yin deficiency diabetic group， 15.75 g・kg-1）， diseasesymptoms group 2 （plant protein group， 0.5 g・kg-1）， diseasesymptoms group 3 （animal protein group， 0.5 g・kg-1）， diseasesymptoms group 4 （berberine group， 0.1 g・kg-1）. The drugs were given for 4 weeks by gavage administration. After 4 weeks of protein intervention， the abdominal aortic blood was collected and serum was isolated to analyze its free amino acid by using AQC precolumn derivatization HPLC and fluorescence detector. Four weeks after the protein intervention， plant protein， animal protein and berberine had no obvious effect on body weight and blood sugar in type 2 diabetic rats. As compared with animal protein group， histidine and proline（P

[Key words] protein； Qi and Yin deficiency； type 2 diabetes； amino acid

doi：10.4268/cjcmm20162223

糖尿病，中医学多以“消渴”，“三消”论之。消渴是以烦渴多饮，多食善饥，尿频且多，久则身体消瘦，疲乏无力，或尿有甜味等为主要症状的一类病症。《内经》明确指出：“甘美肥胖，易患消渴”，这些理论与现代医学研究认为饮食失控可诱发糖尿病的理论十分吻合。消渴的病机主要在于阴津亏虚，燥热偏胜，而以阴虚为本，燥热为标，两者互为因果，阴愈虚则燥热愈盛，燥热愈盛则阴愈虚。阴虚日久伤气，燥热伤气，故出现气阴两虚。故糖尿病中最常见的中医症候就是气阴两虚。这与现在许多中医学者的观点一致[17]。目前，膳食营养干预已被国内外公认为是预防和控制糖尿病的重要措施。

新疆各民族的膳食结构主要受环境、经济、宗教习俗等因素的影响，具有显著特性。本课题组对维吾尔族2型糖尿病患病率进行了流行病学调查，显示患病率高达14%，作为新疆主要少数民族，其膳食结构特点以细粮，鸡蛋为主副食品，97.2%的人喜欢吃蔬菜水果；哈族的膳食结构则以肉类，奶制品摄入为主，几乎不吃蔬菜和瓜果。在疾病表型上两民族也显示了极大地差别，即同一体重指数下，维吾尔族2型糖尿病高发而哈萨克2型糖尿病低发（1.47%），但高血压高发（41%）[8]，认为可能是肠道菌群失调影响蛋白质等营养物质的消化与吸收，从而影响体内氨基酸水平[9]。作为新疆地区的特高发疾病，2型糖尿病的发生与膳食结构密切相关，因此有必要深入研究两民族膳食蛋白代谢产物――氨基酸表达谱的特征，结合近来发展的代谢组学技术及统计方法评价其在2型糖尿病发病中的作用。

本实验选择大豆蛋白作为植物蛋白干预，因为其含有最为丰富蛋白质，而且容易被吸收；牛奶蛋白作为动物蛋白干预，其含有酪蛋白和乳清蛋白比较符合哈族膳食结构[10]。

1 材料

1.1 动物 雄性SD大鼠，SPF级，体重180～200 g，新疆医科大学动物实验中心提供，生产许可证SYXK（新）20110001；饲养环境光照12 h/d，温度（21±2） ℃，湿度40%～45%。

1.2 药物及试剂 青皮（新疆和济中药饮片有限公司，批号150701）；黑顺片（黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号D5050501）；盐酸小檗碱（东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号2150116）；链脲佐菌素（STZ）（Sigma， 批号4361710）；戊巴比妥钠（美国Amresco公司，批号20151225）；柠檬酸（上海山浦化工有限公司，批号20150701）；柠檬酸三钠（上海山浦化工有限公司，批号20150701）；多聚甲醛（天津光复精细化工研究所，批号20120820）；氯化钠（天津永晟精细化工有限公司，批号20151128）；氟化钠（天津市福晨化学试剂厂，批号20140922）；葡萄糖氧化酶（GOD，100 mg G714110ku）；过氧化物酶（POD，100 mg，156 U・mg-1）；无水葡萄糖（天津永晟精细化工有限公司，批号20120725）；苯酚（天津市盛淼精细化工有限公司，批号20080415）；4氨基安替比林（天津永晟精细化工有限公司，批号20120725）；雪莲龙大豆分离蛋白粉（山东禹王生态食业有限公司）；牛奶蛋白（原产地法国，INGREDIA FR 62.767.030 CE，批号151224）。

1.3 仪器 Model 680型酶标仪（BIO RAD）；CT15RE离心机（HITACHI CENTRIFUGE）；AB104N型分析天平（梅特勒托勒德）；SL502N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；高效液相色谱仪（Waters e2695）；荧光检测器（Waters 2475）。

2 方法

2.1 分组及给药 将110只雄性SD大鼠随机分为空白组（10只），模型组（20只），病症结合组（80只），正常组大鼠给予普通饲料，其余给予高糖高脂饲料全程喂养，期间病症结合组灌服青皮附子（15.75 g・kg-1）每日1次，5周后，腹腔注射小剂量STZ（40 mg・kg-1）建立实验性糖尿病大鼠模型，注射STZ 2周后，禁食不禁水12 h，尾尖采血测定空腹血糖，FBG≥11.1 mmol・L-1为造模成功，造模后出现饮水增多、尿量增多、 生长迟缓、身体消瘦、拉尾排便、排尿等糖尿病大鼠共同特征；病证结合组大鼠则出现精神萎糜，倦怠懒动，舌胖大，舌红少津或舌暗淡，苔白润或腻。

将73只成模的雄性SD大鼠随机分为：糖尿病模型组（12只），病症结合1组（气阴两虚糖尿病组，13只，15.75 g・kg-1）， 病症结合2组（植物蛋白组，17只，0.5 g・kg-1）， 病症结合3组（动物蛋白组，16只，0.5 g・kg-1），病症结合4组（黄连素组，15只，0.1 g・kg-1），连续灌胃给药4周。

2.2 血糖的测定 采用葡萄糖氧化酶法测定血浆葡萄糖。葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）利用氧气和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。过氧化物酶（peroxidase，POD）在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧气，并使色原性氧受体4氨基安替比林和苯酚缩合为红色醌类化合物，即Trinder反应。红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比，可在波长505 nm比色测定。

2.3 血清收集和处理 干预4周后，各组大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉；腹主动脉取血，用普通采血管采血，静置30 min后，4 ℃，3 000 r・min-1离心10 min，分离血清，-80 ℃保存。

样品前处理：取200 μL血加入400 μL乙腈除蛋白，涡旋静置10 min后以12 000 r・min-1离心10 min，取其上清液至卵管，氮吹（40 ℃水浴），100 μL蒸馏水超声复溶，经0.22 μm滤膜过滤后，进样10 μL进行色谱分析。

2.4 HPLC条件 有机相（A）为甲醇水乙腈（100∶100∶300），缓冲盐相（B）为无水乙酸钠7.4 g、蒸馏水940 mL、乙腈70 mL，加冰乙酸调pH 6.5。线性梯度洗脱：0 min，100% B；5 min，98% B；6 min，94% B；15 min，91% B；19 min，79% B；32 min，55% B。方法学考察参考文献[11]。

2.5 数据分析 将每个样品18种氨基酸峰面积依次输入Excel中，依据对照品的已知浓度求出每个样本的浓度，再带入SPSS 17.0统计软件中，采用OneWay ANOVA方法处理分析。

3 结果

3.1 SD大鼠体重的变化 干预前，各组大鼠体重无显著性差异，从干预后第1周到第4周，2个模型组老鼠体重持续下降，跟正常组比较具有显著性差异（P

3.2 SD大鼠血糖的变化 干预前2模型组大鼠FBG水平明显高于正常对照组（P

3.3 SD大鼠血清氨基酸的代谢谱 本实验采用AQC柱前衍生结合HPLC测定糖尿病大鼠血清中游离氨基酸含量，18种氨基酸混合对照品与各组样品在30 min内得到有效地分离，并且衍生试剂峰对血清中氨基酸的测定没有干扰，见图1。

3.4 蛋白干预对SD大鼠血清氨基酸代谢产物的影响 应用已成熟的HPLC技术检测正常组，模型组，各给药组老鼠血清中氨基酸代谢谱，根据18种氨基酸对照品的浓度算出每个样本浓度导入到SIMCAP+11软件中进行模式识别分析。PLSDA（正交偏最小二乘法）分析结果见图2，其可以有效区分SD大鼠正常组，模型组和各个给药组，说明这几组氨基酸的代谢存在着一定的差异。其中牛奶蛋白组与黄连素组样品分布散点比较接近，提示牛奶蛋白可能与黄连素有着相同的氨基酸代谢过程。

3.5 SD大鼠血清中氨基酸的模式识别分析 由图3～8可得到模型的拟合程度依次为X轴R2=0.886， Y轴R2=0.647，Q2=0.442；X轴R2=0.881， Y轴R2=0.852，Q2=0.811；X轴R2=0.867， Y轴R2=0.755，Q2=0.708；X轴R2=0.967，Y轴R2=0.382，Q2=0.147；X轴R2=0.932， Y轴R2=0.954，Q2=0.938；X轴R2=0.949， Y轴R2=0.796，Q2=0.742。首先糖尿病模型组，气阴两虚糖尿病模型组与正常组比较具有显著性差异，Q2>0.4，说明造模成功，模型可信度较高，有利于后面给药组与模型组的分析；糖尿病模型组和气阴两虚糖尿病模型组比较Q2=0.708，表明这2种模型有着本质的区别，氨基酸代谢水平不相同；气阴两虚糖尿病组与大豆蛋白组相比，Q2=0.147，说明这2组氨基酸代谢无显著性差异；气阴两虚糖尿病组分别与牛奶蛋白组，黄连素组比较，Q2=0.938和Q2=0.742，表明其差异性氨基酸具有很好的预测能力，作为气阴两虚2型糖尿病标志性差异化合物。为了更加明确的观察大豆蛋白和牛奶蛋白对气阴两虚2型糖尿病氨基酸代谢的影响，将其进行OPLSDA 分析，见图9。在有监督的OPLSDA模式识别下分析大豆蛋白组与牛奶蛋白组氨基酸代谢情况，这2组样品区分明显，见图10。此模型得到的拟合程度为X轴R2=0.871， Y轴R2 =0.699，Q2=0.474，其中R2和Q2理论上数值越接近1说明拟合准确性越好，通常Q2大于0.4则认为此模型具有很好的拟合效果和良好的预测能力，所有样品的数据点均落在95%的置信区间，可信度较高。因此为了能更好的寻找这2组间差异性化合物，采用OPLSDA负载图进行差异性化合物的寻找。

从OPLSDA的载荷图中可以看出大豆蛋白组与牛奶蛋白组可能存在的差异性化合物，离中心原点越远的点为差异性代谢化合物，可以作为潜在生物标记物，为后续研究提供参考依据。结合SPSS 17.0软件分析可以得出，组氨酸和脯氨酸， 丝氨酸，甘氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，亮+异亮氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，见表3。

4 讨论

据文献统计，目前中医临床上将糖尿病主要分为阴虚火旺、气阴两虚、阴阳两虚型，分别代表着糖尿病发展的早、中、晚3个时期，各阶段出现的并发正常组、糖尿病组、气阴两虚糖尿病组和大豆蛋白组、牛奶蛋白组、黄连素组明显分居3D图两侧，说

明这两部分有着明显的氨基酸代谢差异。其中牛奶蛋白组与阳性药黄连素组的代谢轮廓十分接近，提示着可能牛奶蛋白与阳性药黄连素有着相似的氨基酸代谢，从而间接解释了新疆哈萨克族2型糖尿病低发（1.47%）的原因，是因为哈萨克族常年的膳食结构为肉类，奶制品摄入为主。为了能更加准确的对比大豆蛋白组与牛奶蛋白组之间氨基酸的代谢差异，本实验采用OPLSDA负载图结合SPSS软件一起分析。

此实验得出，大豆蛋白与牛奶蛋白对气阴两虚2型糖尿病大鼠的体重没有显著影响，但从数据可以看出牛奶蛋白具有抑制体重负增长的趋势。Young Eun Choi等[1418]将糖尿病造模成功的老鼠分成2组：DM组和大豆蛋白组，在干预1周后，模型组与大豆蛋白组的血糖都非常高，但是4周以后，大豆蛋白组的血糖明显下降，与DM模型组相比具有显著性差异（P

从大豆蛋白组与牛奶蛋白组血清样本的HPLC氨基酸代谢谱与OPLSDA结果中发现多种差异氨基酸：组氨酸和脯氨酸（P

中医学理论体系的基本特点是整体观念与辨证论治，整体观念认为人是一个有机的整体，人与自然环境，社会环境相统一；辨证论治，即用四诊搜集症状等其他资料，在中医指导理论下分析，辨清病因，病机，从而判断为某种性质的症候，最终依据辩证的结果，来确定相应的治疗方法。代谢组学技术则通过分析某种疾病相关特定组分的共性，来更好的有助于人们了解疾病病变过程及体内代谢水平的异常。将中医药与代谢组学相结合，是一个极具创造性意义及将中医药推向现代化的重要之举。

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