生物技术在黄瓜育种中的应用

1生物技术简介

生物技术是分子遗传学、生物化学、微生物学等基础学科发展的产物。作为一种高新技术,生物技术在整个科学领域中占据了越来越显著的地位。作为世界新技术革命的重要组成部分,生物技术已经成为人类彻底认识和改造自然界,克服人类自身所面临的人口膨胀、粮食短缺、环境污染、疾病危害、能源资源匮乏等一系列重大问题的有效手段和工具[1]。

目前在黄瓜育种中,广大科研工作者利用生物技术结合常规育种方法,创新了一大批含有优异基因的黄瓜育种材料,培育出多个丰产、优质、多抗品种。生物技术在黄瓜遗传育种上的应用非常广泛,下面介绍在这方面已取得的一些重要进展。

2分子标记技术在黄瓜遗传育种中的应用

2.1黄瓜基因的分子标记

开展基因分子标记研究是进行分子标记辅助选择育种、分离和克隆基因的基础。“十五”期间,我国科研工作者建立了适合黄瓜的RAPD、AFLP和SSR标记的优化反应体系,并对黄瓜的多个基因进行了分子标记。

钱忠英等[2]优化的黄瓜RAPD反应体系为:PCR程序94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,37 ℃复性30 s,72 ℃延伸2 min,循环40周,最后72 ℃延伸7 min为佳;模板DNA的适宜浓度为2.5～5 ng/μL,引物浓度为0.6 mol/μL,dNTPs浓度为0.25 mmol/L,Mg2+浓度为1.875 mmol/L。张桂华等[3]建立了适合黄瓜的AFLP反应体系:在50μL酶切连接体系中,取300 ng基因组DNA进行双酶切和接头连接,然后取4μL酶切连接产物进行预扩增,预扩增产物稀释30倍后,采用“2+3”选择性扩增引物组合用于选择性扩增可以得到很好的扩增效果。葛风伟[4]等摸索了适宜黄瓜的SSR反应体系,认为在25Μl PCR反应体系中,Mg2+的最适浓度为0.2 mmol/L;dNTP最适浓度为0.2 mmol/L;反应体系中Taq聚合酶宜加入1U,引物应加入30 ng;DNA最适浓度为5 ng/μL。另外,刘殿林[5]、张正奇[6]、孙敏[7]等也对黄瓜基因组DNA提取方法和RAPD反应体系进行了探索。

基因分子标记方面,陈劲枫等[8]利用RAPD技术获得了黄瓜全雌性特异的片段B111000。娄群峰等[9]筛选得到了与黄瓜全雌性F基因连锁距离为6.7 cM的AFLP标记TG/CAC234,并将该标记转化为SCAR标记SA166。张桂华等[10]找到2个与白粉病抗病相关基因连锁距离为5.56 cM的AFLP标记,目标片段的大小分别为238 bp和236 bp。张素勤等[11]研究并获得了与控制黄瓜霜霉病和白粉病的感病QTLs均紧密连锁的显性AFLP标记:E25M632-103。该标记从分子水平说明黄瓜霜霉病和白粉病的某个感病QTLs是连锁的。丁国华[12]筛选得到与抗霜霉病基因dm连锁不十分密切的CsRGA3标记。在dm和CsRGA3之间还检测到黄瓜白粉病抗病基因pm的存在,显示了dm和pm存在连锁关系。国艳梅[13]筛选到的AFLP标记E4M6和E5M5,分别与黄瓜营养部分苦味基因Bi连锁,距离15.0 cM;和不苦基因bi连锁,距离18.8 cM。顾兴芳等[14]找到了与黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的两个显性AFLP标记E23M662-101和E25M652-213,与Bt的遗传距离分别为5 cM和4 cM,且位于Bt两侧。Thomas等[15]以WⅡ983G×Strait8的55个F2+代个体和Iudm1×Strait8的90个F2+代为研究群体,从960对RAPD引物产生的135个多态性标记中筛选出5个与黄瓜霜霉病基因(dm)紧密连锁的标记:G14-800、X15-1100、AS5-800、BC519-1100和BC526-1000。

2.2黄瓜遗传图谱的构建与基因定位

1994年,Kennard等[16]以G421×H-19获得的F2+群体为材料,构建了一张总长为766 cM的遗传图谱,该图谱由10个连锁群组成,包含了58个位点标记,2个位点之间的平均距离为(21±8)cM。同时利用种间杂交GY14×PⅡ83967获得F2+群体构建了含有70个位点,10个连锁组群,总长480 cM的连锁图谱。1997年,Serquen等[17]以G421×H219杂交的100个F2+株系为试材利用RAPD技术构建了一个含有80个位点的连锁图谱,包含了77个RAPD标记,3个形态标记,分为9个连锁组群,整合长度628 cM,平均标记间隔7.8 cM。

2000年,Danin-Poleg等[18]以GY14×PⅡ83967为材料,用SSR标记技术构建了黄瓜的遗传图谱,将14个SSR标记定位到8个连锁组群中,整合图谱总长为783.2 cM,并发现其中有9个标记与甜瓜相同。Bradeen等[19]利用Joinmap软件,以G421×H219的杂交后代群体为研究对象,整合出含有10个连锁群,255个标记,总长为538.6 cM的遗传图谱,平均标记间隔为2.3 cM。又以GY14×PⅡ83967为材料,构建了一张包括了15个连锁组群,197个标记,整合图谱长度为450.1 cM的黄瓜遗传图谱。Park等[20]利用对番木瓜环斑病毒(PRSV-W)和南瓜花叶病毒(ZYMV)敏感的“Straight8”和对PRSV-W、ZYMV有抗性的TMG1(TaichungMouGua)的F6代重组自交系(RLs)为材料,构建了包含353个位点,12个连锁组群的连锁图谱。Fazio等[21]采用G421×H219获得的171个RLs和216个F2+单株构建了包含14个SSR标记、24个SCAR标记、27个AFLP标记、62个RAPD标记、1个SNP标记和3个重要形态学标记(雌性,有限生长和小叶),分为7个连锁组群,总长为706 cM的遗传图谱。Young等[22]以黄瓜抗病毒和感病毒的亲本组成的重组自交系进行AFLP、RAPD、RFLP标记,并构建了353个位点的黄瓜图谱。

“十五”期间,我国科研工作者构建了2张黄瓜遗传图谱,其一是张海英等[23]利用黄瓜重组自交系为作图群体,构建的包含9个连锁组群,共有234个分子标记的连锁图谱,其中包括141个AFLP标记、4个SSR标记和89个RAPD标记,覆盖基因组长度727.5 cM,平均图距3.1 cM。应用该图谱对控制黄瓜耐弱光的数量性状基因(QTL)进行了研究,将影响叶面积增长量的5个QTL分别定位在LG1、LG7和LG9连锁群[24]。其二为李效尊等[25]利用F2+代群体,构建的包含77个SRAP标记和79个RAPD标记的遗传图谱,分属4个大的连锁群和5个小的连锁群,总长度1110.0 cM,平均间距为13.7 cM。并将侧枝基因(lb)定位在一个大的连锁群上,其两侧标记是OP-Q5-1和OP-M-2-2,与lb的间距分别是9.3 cM和15.9 cM;将全雌性基因(f)定位在一个小的连锁群上,其两侧标记是OP-Q5-2和BC151,与f的间距分别是13.8 cM和13.6 cM。

2.3分子标记在黄瓜亲缘关系和遗传多样性上的研究

分子标记技术以其准确性高、速度快、周期短而较多地应用于黄瓜种质亲缘关系分析和种质资源多样性检测方面。利用RAPD标记进行研究的报道有:张海英等[26]分析了华北型与欧洲温室型品种的杂交后代的遗传漂移情况,进行了初步的遗传分析以及F2+个体的基因型分析。刘殿林等[27]分析了39份黄瓜材料的遗传差异,不同材料间的遗传距离(D)在0.0642～0.592之间,并根据遗传距离,按UWPGA法进行了聚类分析。夏立新等[28]计算出黄瓜亲本间分子遗传距离,研究了田间园艺性状与分子遗传距离间各种相关曲线的相关系数。陈劲枫等[29]对黄瓜属的22份材料的亲缘关系进行了研究,聚类分析为2群:CS群(黄瓜、西南野黄瓜及野黄瓜)和CM群(甜瓜、菜瓜、野生小黄瓜及非洲角黄瓜)。庄飞云等[30]也将23份材料按亲缘关系聚类为黄瓜、近缘野生种、种间杂交种和甜瓜亚属种4类。李锡香等[31]分析了66份黄瓜种质基因组DNA,将供试种质分为8个组群。另外,利用RAPD标记可以从分子水平上探测黄瓜亲本自交系与其杂种F1代的遗传差异[32]。

AFLP技术也经常用在亲缘关系和遗传多样性研究上面。王志峰等[33]利用AFLP技术对包括80份山东黄瓜地方品种和24份其他地区品种的遗传亲缘关系进行了研究,聚类分析结果显示:山东黄瓜地方品种与日本品种和欧美品种分属不同类群或亚类群,山东地方品种分为8组,各组内生态类型基本一致。AFLP分析计算出15份密刺类黄瓜品种的遗传距离在0.033～0.686之间,聚类分析分为8类,新泰密刺和山东密刺遗传差异较小,与长春密刺遗传差异较大[34]。李锡香等[35]以8对引物对70份不同来源的野生和栽培黄瓜种质基因组DNA进行AFLP分析,将供试种质聚类为3大种群:西双版纳黄瓜组群、印度野生黄瓜组群和栽培黄瓜组群。Zhuang等[36]用RAPD和SSR分析黄瓜野生种、半野生种的亲缘关系,二者的遗传分析结果具有很高的协调性,二者遗传距离的相关系数为0.94。

另外,李俊英等[37]发现在不同黄瓜品种的线粒体中存在类质粒分布的差异,其存在有一定随机性,不同品种中的同一种类质粒间具有同源性。

2.4黄瓜基因的克隆与表达

黄瓜基因克隆有多篇报道。康国斌等[38]克隆得到了在黄瓜冷敏型品种低温锻炼异表达基因的cDN段(ccr18),大小为639 bp。在基因组中以单拷贝或低拷贝形式存在。ccr18基因与黄瓜低温锻炼相关,与拟南芥染色体IIIBAC库中的F14P3基因组序列具有88 %的同源性。白吉刚等[39]扩增出黄瓜生长素结合蛋白基因(ABPl)cDN段,大小约为800 bp,该基因在开花前1 d的子房中表达信号较弱,在授粉后2 d、4 d和6 d的幼果中表达增强。丁国华等[40]利用简并引物从黄瓜基因组DNA中分离得到15条同时具有特征保守域结构的NBS类型抗病基因同源序列(RGA),翻译产物与许多抗病蛋白有较高的同源性。

牛林海[41]克隆了黄瓜HMG(high mobility group proteins)基因,并认为该基因是单拷贝,具有组织特异性表达,在根中表达最强。叶青静[42]测定了黄瓜果实组织中的与细胞分裂相关的精氨酸脱羧酶(ADC)基因cDNA序列(约1.83 kb)、与细胞膨大有关的扩张蛋白基因cDNA序列(约786 bp)以及一条酸性转化酶的cDNA全长序列(约2.25 kb)。李志英[43]获得了正常和“花打顶”黄瓜之间的2个差异片段所在基因的全长cDNA序列,分别定名为CUATP和CuADC。“花打顶”植株中CUATP的表达明显减少,而CuADC表达量增加。梅茜[44]构建了黄瓜幼果的cDNA文库,得到139个表达序列标签(ESTs),其中有97条与已知基因高度相似,36条为低度相似序列,在GenBank中未找到匹配同源序列的ESTs为6个。娄群峰[45]从中国弱雌性黄瓜中克隆出了全长为1024 bp的ACC合酶基因,包含6个开放阅读框,不同生态型黄瓜中ACC合酶基因序列保守性很强。不具有性型特异性,但在植株不同部位表达程度存在明显差异。

2.5黄瓜杂种纯度及品种指纹图谱分析

黄瓜种子纯度鉴定的常规方法是根据田间表现性状进行鉴定,后来发展为利用同工酶的方法,但二者都有一定的缺陷。利用分子标记技术鉴定黄瓜种子纯度,可以在苗期甚至种子阶段进行,高效快速、稳定可靠。克服了传统田间检验要根据植株园艺性状进行而导致的费时、费力等缺点。但相关报道比较少。

王和勇[46]研究表明,黄瓜不同组织器官的DNA对RAPD扩增无影响,均可获得一致的指纹图谱,并建立了种子纯度鉴定的RAPD的反应体系。孙敏[47]等通过RAPD标记鉴定和分析了黄瓜品种真实性,也建立了适宜黄瓜种子纯度鉴定的RAPD指纹图谱。金红等[48]研究了抗除草剂基因在黄瓜杂种纯度快速鉴定上的应用,摸索出田间抗性鉴定和室内种子抗性鉴定的除草剂临界浓度,建立了一套在种子发芽阶段或2片真叶期进行黄瓜杂交种纯度鉴定的新技术。

2.6分子技术鉴定黄瓜病害

王惠哲等[49]以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,对75份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果从感病组织中扩增出与预期的425 bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物;29份材料检测到TMV,检出率达38.67 %。同样的方法,也检测到黄瓜上的西瓜花叶病毒2号(WMV22)[50]。李淑菊等[51]利用RT-PCR对黄瓜病毒毒原种类进行检测。陈洁云等[52]用同样技术明确了ZYMV和CMV是浙江及其周边地区侵染葫芦科植物最主要的病毒种类,夏季CMV普遍发生,ZYMV主要发生在秋季。

3黄瓜组培技术与单倍体和三倍体培养

利用对黄瓜离体组织的培养,通过愈伤组织和胚状体两条途径均可获得再生植株。何晓明等[53]建立了子叶及下胚轴离体培养体系,通过愈伤组织分化出的不定芽获得再生植株。郭德章等[54]将分离纯化的黄瓜子叶原生质体,培养于mKM8p液体培养基中,原生质体可持续分裂至愈伤组织形成。当再生的愈伤组织直径达0.5～1.5 cm时,及时转入改良的MS附加不同生长激素的培养基上诱导分化及再生,结果产生大量体胚并再生成植株。

不少报道对黄瓜组织培养的影响因素做了探讨。侯爱菊等[55]认为外植体类型、基因型及植物生长调节剂对诱导黄瓜直接器官发生有显著影响,子叶节是最佳的外植体类型。杨爱馥等[56]研究认为愈伤组织诱导阶段和胚胎发生阶段分别采用9 %和6 %的蔗糖浓度,可促进体细胞胚胎发生;胚诱导培养基中添加6-BA 0.5 mg/L,以及愈伤组织诱导阶段甘露醇与蔗糖配合使用,可提高体细胞胚胎发生率。梅茜等[57]研究表明,苗龄和ABA是影响子叶分化形成不定芽的显著因素;加入适量的AgNO3可改善黄瓜愈伤组织的质地、促进芽的形成。与曹利仙等[58]试验结果相同。郭德章等[54]认为Ca2+浓度对黄瓜原生质体的稳定和细胞分裂有重要影响。李云等[59]研究后认为赤霉素处理离体黄瓜子叶不能诱导花芽分化,萘乙酸的促进作用不明显,激动素KT1.0诱导花芽分化的频率最高。但周俊辉等[60]认为l/2 MS培养基中附加0.10 mg/L 6-BA能显著提高离体黄瓜子叶的开花率,White培养基中附加2.00 mg/L的KT开花率也有明显提高。相同浓度的L-丙氨酸和L-酪氨酸均明显促进黄瓜子叶开花,而甘氨酸对黄瓜子叶开花则有一定的抑制。

在黄瓜单倍体和多倍体培养方面,杜胜利等[61]在国内首次建立了一整套通过未受房离体培养产生黄瓜单倍体植株的技术体系,再生频率达25 %。雷春等[62]通过射线辐射花粉授粉并结合胚培养从3个基因型中获得了单倍体植株。陈劲枫等[63]研究了异源三倍体黄瓜的离体繁殖的培养基配方最佳的不定芽诱导培养基为:MS + 6-BA 2.2 mg/L和MS + 3.0 mg/L KT + 0.2 mg/L NAA,然后丛生芽在MS + 0.2 mg/L 6-BA的培养基上伸长大约10 d后取整齐一致的芽在1/2 MS + 0.2 mg/L 6-BA培养基上生根。

4黄瓜遗传转化体系建立及基因工程改良

基因工程技术是现代生物技术改良作物品种的关键技术之一,在农业生产中有着广泛的应用前景。可应用于黄瓜上的转基因方法有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法和电激法等,目前以农杆菌介导法为主要方法。近几年来,广大科研工作者研究和建立了黄瓜高效遗传转化体系,并通过农杆菌介导将CMV-CP、CBF3、Cor15A、Chi、Glu、CTB/CS3、RS等基因导入黄瓜基因组。

陈峥等[64]的研究表明,在共培养的菌液中添加乙酰丁香酮,明显提高外植体的愈伤组织诱导率;延长农杆菌与外植体的共浸染时间至40 min,外植体的存活率和出芽率显著提高。姚春娜等[65]试验表明,超声波处理可以明显提高农杆菌对外植体的转化频率。侯爱菊等[66]建立了一套黄瓜遗传转化体系,适宜的选择压力为卡那霉素30 mg/L。金红等[67]也对影响遗传转化体系的因素进行了摸索。于静[68]、孙兰英[69]、赵隽等[70]均认为子叶节是黄瓜遗传转化体系的最佳外植体,最适宜的芽诱导培养基为MS + 6-BA 0.5 mg/L;子叶节预培养1～2 d,在添加6-BA 0.5 mg/L、乙酰丁香酮100μmo1/L,pH 5.2的MS培养基上进行培养,遗传转化效率最高。利用TDZ从子叶节上诱导出再生芽,效果优于BA。

金红等[67]将抗除草剂基因bar导入到黄瓜子叶中,获得落地转化株系。邓小燕等[71]构建成植物表达载体Pbinp-35S-CBF3。通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。张兴国[72]等也将冷cbf3基因和corl5a抗寒基因导入黄瓜基因组,创制出耐寒黄瓜新材料。白吉刚等[73,74]将拟南芥生长素结合蛋白基因转化黄瓜,获得的转基因植株单性结实能力增强。通过黄瓜离体子叶不定芽再生体系,陈丽梅[75]和林建丽[76]已分别将荧光素基因(luc)、ATT1基因和花生白黎芦醇合酶(RS)基因导入黄瓜,获得了阳性转基因植株。柏锡[77]获得了转组织型纤溶酶原激活剂基因的黄瓜植株。张国广[78]将来源于菜豆的几丁质酶(Chi)基因和克隆自烟草的β-1,3-葡聚糖酶(Glu)基因导入3个基因型的黄瓜基因组中。侯爱菊[66]、孙兰英[69]和杨成德[79]也利用农杆菌介导法将菜豆几丁质酶基因导入黄瓜。

5存在问题及展望

黄瓜有7对染色体,染色体组总长度750～1 000 cM,高饱和的分子连锁图应具有7个连锁群。目前构建的遗传图谱相对不饱和,整合后的连锁图谱虽然密度增加,但是不能覆盖整个基因组。被定位到图谱上的分子标记不多,与重要性状紧密连锁的标记就更少。因此,仍需对黄瓜分子标记进行研究,找到与性状紧密连锁的标记,为分子标记辅助育种和基因的定位克隆奠定基础。黄瓜组织培养以二倍体的研究居多,单倍体和多倍体的研究较少,黄瓜单倍体组织培养的技术在国内仍未成熟,黄瓜转基因技术也还停留在研究阶段,与实际应用还有相当差距,今后尚需进一步研究。

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