非小细胞肺癌组织中K

作者：陈健，杨增，梁景仁，王鸿雁

【关键词】 免疫组织化学

Expression of Kras oncoprotein in human nonsmall cell lung cancer and its clinical significance

【Abstract】 AIM: To investigate the role of Kras oncoprotein in the occurrence, development and prognosis of nonsmall cell lung cancer （NSCLC）. METHODS: Thirtyseven specimens of resected, paraffin embedded NSCLC and 9 cases of normal lung tissues were examined by immunohistochemical technique(SABC methods)for the expression of Kras oncoprotein. RESULTS: Overexpression rate of Kras oncoprotein was 56.8%. Only histological type (r=0.529, P=0.021), smoking (r=0.582, P=0.003), tumour size （r=0.506, P=0.049） and lymph node involvement （r=0.521, P=0.018） had significantly positive correlation with the overexpression of Kras oncoprotein. The mean survival time was significantly shorter in patients with Kras high expression than in patients with Kras low expression (11.29 vs 34.31 mo, P<0.01). The estimated increased relative risk for patients with Kras overexpression was 4.107. The results of the proportional hazards regression model (Cox model) showed that Kras was independental factor that had correlation with prognosis （P=0.004）. CONCLUSION: The overexpression of Kras oncoprotein was closely related to the the occurrence、development and prognosis of NSCLC. The overexpression of Kras oncoprotein was found more frequently in smokers and patients suffering from the adenocarcinoma of lung or lymph node involvement. Kras, which is important prognostic cellular factor, may play an important role in early diagnosis for patients with NSCLC.

【Keywords】 lung neoplasms; Kras; Immunohistochemistry

【摘要】 目的： 探讨Kras蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其与NSCLC的发生、发展及临床预后的关系. 方法： 采用免疫组化SABC法，检测37例经手术切除、病理证实的NSCLC及9例正常肺组织Kras蛋白的表达. 结果： Kras蛋白在NSCLC中的高表达率为57%，Kras蛋白表达与组织类型（r=0.529, P=0.021）、吸烟史（r=0.582, P=0.003）、肿块大小（r=0.506, P=0.049）、淋巴结转移（r=0.521, P=0.018）间显著相关（P<0.05）. Kras高、低表达组平均生存时间分别为11.29和34.31 mo，前者生存期明显缩短（P<0.01）. Kras表达(P=0.004, RR=4.107)具有独立的预后意义. 结论：Kras蛋白高表达与NSCLC的发生、发展及预后密切相关. Kras蛋白高表达更易发生于吸烟者及肺腺癌患者，易发生淋巴结转移. Kras蛋白的表达程度可作为NSCLC早期诊断及预后评价指标.

【关键词】 肺肿瘤； Kras；免疫组织化学

0引言

Kras癌基因可编码胞质内G蛋白家族，参与生长因子对细胞作用的各个环节，与非小细胞肺癌（Nonsmall cell lung cancer, NSCLC）的发生、发展及预后关系密切［1,2］. 我们对37例手术切除的NSCLC标本Kras的表达及其与临床病理参数、预后的关系进行了研究.

1对象和方法

1.1对象石蜡包埋组织标本取自西安交通大学第一医院1994/1999经根治性切除、术后经病理证实的NSCLC病例37（男29，女8）例，年龄34~73（平均58.3）岁，生存时间3至73（平均21.2） mo. 术前未行放疗和化疗，无其他疾病及并发症. 病理类型(WHO)：鳞癌10例，腺癌27例；分化程度：Ⅱ级22例，Ⅲ级15例. 临床分期（pTNM）：Ⅰ期9例，Ⅱ期6例，Ⅲ期22例. 有淋巴结转移者25例. 正常肺组织标本9（男7，女2）例作对照，年龄28~69（平均47.6）岁. 兔抗人Kras mAb（浓缩型）、SABC试剂盒（即用型）均购于武汉博士德公司.

1.2方法标本制成4 μm厚的连续切片，脱水，透明，中性树胶封片. 经预实验确定Kras的浓度为1∶150. 采用免疫组化染色（SABC）法，按照试剂盒推荐方法进行染色. Kras阳性对照采用阳性表达的正常皮肤组织，空白对照采用PBS代替一抗. Kras阳性以细胞质中有棕黄色颗粒为阳性细胞，依阳性细胞百分比及着色强度综合计分做半定量分析，阳性细胞数量记0~4分，0为0分；≤25%为1分；26%-50%为2分；51%-75%为3分；>75%为4分. 着色强度记0~3分，染色的深度以多数细胞的显色反应为准，无色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分. 将两项指标的评分相加，根据总的分数分为4级，即阴性（-）为0~1分；弱阳性（+）为2~3分；中度阳性（）为4~5分；强阳性（）为6~7分.

统计学处理： 应用SPSS 10.0 For Windows统计软件进行分析. Kras的表达采用非参数检验Wilcoxon法检验，组间相关性应用非参数相关检验Kendalls taub法检验，生存期按KaplanMeier方法制作累计生存曲线. 结果均以P<0.05为差异有显著性.

2结果

2.1Kras在正常肺组织及NSCLC中的表达Kras蛋白位于细胞质内，免疫组化染色可见存在于胞质内的棕黄色颗粒（Fig 1，2）. Kras蛋白在正常肺组织中不易染出，正常对照肺组织无高表达者（0/9）. NSCLC组织中有16例为Kras蛋白低表达（16/37），21例高表达（21/37），高表达率为57%. Kras蛋白高表达在正常肺组织与NSCLC组织之间存在显著性差异（P<0.05, Wilcoxon法检验）.

图1Kras在非小细胞肺癌中高表达　（略）

2.2Kras蛋白在NSCLC中的表达与临床参数之间的相关性病理分级、TNM分期与Kras蛋白的表达间无显著差异（P>0.05），对Kras蛋白的表达无显著影响；而组织类型、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结转移与Kras蛋白的表达间有显著差异（P<0.05, Tab 1）. 相关检验表明，Kras蛋白的表达与病理分级、TNM分期之间无显著相关（P>0.05）组织类型、吸烟史、肿块大小及淋巴结转移其与Kras蛋白的表达间显著相关（Tab 2）.

图2Kras在非小细胞肺癌中低表达 (略)

表1Kras蛋白表达与NSCLC临床病理参数之间的关系 （Wilcoxon法检验）　(略)

2.3Kras蛋白表达与预后的关系Kras高、低表达者的平均生存时间分别为11.29和34.31 mo. 结合Kaplanmeier生存曲线（Fig 3）分析提示，Kras高表达者生存期明显缩短. 进一步行Cox比例风险模型分析显示，Kras表达对预后影响的相对危险度RR=4.107， P=0.004，说明Kras表达具有独立的预后意义.

表2Kras蛋白表达与NSCLC临床病理参数之间的相关性（Kendalls taub非参数相关检验）　(略)

图3Kras表达对生存期的影响（Kaplanmeier生存曲线）　(略)

3讨论

在肺癌中，kras被认为是“启动”癌变的关键基因之一. kras基因编码蛋白由188~189个氨基酸组成，分子量为21 ku. 肺癌细胞可能对kras癌基因的细胞增生作用特别敏感. kras癌基因表达表示癌细胞增生和浸润能力增强，是肺癌恶性程度高的表现. kras癌基因可因12，13，61密码子发生突变而活化，可以在包括肺癌在内的许多肿瘤细胞内表达. 我们的研究显示：在正常肺组织及NSCLC中Kras的表达有显著性差异，表明Kras的表达与NSCLC的发生有关.

研究表明，kras突变与吸烟、肺腺癌及淋巴结转移关系密切. 大部分肺癌患者都是以前或现在的吸烟者，Kras基因突变在肺腺癌中普遍存在［3］. Graziano等［4］认为，kras突变在腺癌中比鳞癌中更常见，Kras突变与肺腺癌之间关系密切. 我们的研究也显示：Kras高表达在吸烟和不吸烟者的发生率有差异显著，Kras高表达与吸烟史关系密切（r=0.582, P=0.003）. Kras在肺腺癌和鳞癌的高表达率也有显著性差异，Kras高表达与组织类型关系密切（r=0.529, P=0.021），Kras的突变在吸烟的肺腺癌患者中可能与谷胱甘肽转移酶（Glutathione Stransferase μ1, GSTM1）的缺乏有关，可能是由于GSTM1缺乏而不能很好地解毒，导致二乙醇环氧苯芘堆积所致［5］. Kras高表达更易出现于肺腺癌中，影响其生物学行为. 我们的研究结果表明，有淋巴结转移者Kras高表达（r=0.521, P=0.018），支持上述观点.

发生kras突变的NSCLC患者预后较差. Heather等［6］研究表明，发生kras突变的NSCLC患者的生存期短、预后差，其肿瘤复发和死亡的风险显著增加. Nemunaitis等［7］报道，kras突变及其蛋白的高表达与患者预后密切相关. 我们的研究显示：Kras高表达者的平均生存期较低表达者明显缩短，预后差. Kras的表达水平具有独立的预后意义（P=0.004, RR=4.107），与上述观点相一致. Todd等［8］认为Kras突变与手术治疗的NSCLC患者的生存情况无明显关系，在分析其与多数观点不同的原因时认为，可能是由于偶然因素、人群选择不同以及一些其他因素所致.

【参考文献】

［1］ Johnson L, Mercer K, Greenbaum D. Somatic activation of the Kras oncogene causes early onset lung cancer in mice ［J］. Nature, 2001;410 (26):1111-1115.

［2］ Sagawa M, Saito Y, Fujimura S. Kras point mutation occurs in the early stage of carcinogenesis in lung cancer ［J］. Br J Cancer, 1998;77 (5):720-723.

［3］ Ahrendt SA, Anthony DP, Alawi EA. Smoking is strongly associated with mutation of the Kras gene in patients with primary adenocarcinoma of the lung ［J］. Cancer, 2001;92:1525-1530.

［4］ Graziano SL, Gamble GP, Newman NB. Prognostic significance of Kras codon 12 mutations in patients with resected stage Ⅰ and Ⅱ nonsmallcell lung cancer ［J］. J Clin Oncol, 1999; 17(2):668-675.

［5］ Matsuzoe D, Hideshima T, Iwasaki A. Glutathione stransferase u 1 null genotype is associated eith Kras gene mutation in lung adenocarcinoma among smokers ［J］. Carcinogenesis, 2001;22 (8):1327-1330.

［6］ Heather H, Nelson DC, Christiani EJ. Implication and prognostic value of Kras mutation for earlystage lung cancer in women ［J］. J Nati Cancer Inst, 1999;91:2032-2038.

［7］ Nemunaitis J, Klemow S, Tong A. Prognostic value of Kras mutations, Kras oncoprotein and cerbB2 oncoprotein expression in adenocarcinoma of the lung ［J］. Am J Clin Oncol, 1998;21(2):155-159.

［8］ Todd M, Greatens Gloria A, Niehans Jeffrey B. Do molecular markers predict survival in nonsmallcell lung cancer? ［J］. Am J Respir Crit Care Med, 1998;157:1093-1097.