乳腺癌细胞凋亡指数、PCNA、PgP与乳腺癌预后相关性的研究

【摘要】目的探讨乳腺癌中细胞凋亡指数（AI）及增殖细胞核抗原（PCNA）、P糖蛋白（PgP）对乳腺癌预后的影响及相关性的表达。方法用免疫组化方法检测80例乳腺癌细胞凋亡指数（AI）及PCNA、PgP相关基因。结果细胞凋亡指数（AI）阳性部位在细胞核，PCNA阳性定位在细胞核，PCNA与AI的表达呈正相关，Pgp效应产物为棕黄色颗粒。定位于细胞膜上，部分胞浆亦着色。P糖蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达的患者占28.7%；PgP阳性表达与病理类型相关性不显著，有转移组阳性率明显高于无转移组。结论肿瘤的发病与细胞凋亡、增殖密切相关，增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达与组织分级、淋巴结转移有关，我们发现Pgp在乳腺癌组织中有一定程度的表达；Pgp阳性表达与乳腺癌患者生存期的缩短有关，检测乳腺癌中P糖蛋白（PgP）临床用药有指导意义，AI、PCNA、PgP成为判断乳腺癌患者预后有用指标。

【关键词】乳腺癌；细胞凋亡指数（AI）；PCNA；P糖蛋白

作者单位：130011长春，一汽总医院乳腺癌是妇女最常见的肿瘤。近年来，乳腺癌的发病率呈迅速上升趋势，其治疗和预后一直是人们关注的热点，肿瘤的发病与细胞的凋亡、细胞的增殖的失衡密切相关，凋亡作为一种细胞自主的有序性死亡，与肿瘤发生、发展之间的关系越来越受到重视。化疗是治疗乳腺癌的手段之一，化疗效果差也是困扰临床医生问题，肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药，是造成肿瘤化疗失败的原因。用免疫组化方法检测AI、 PCNA、 PgP在乳腺癌组织中的表达，探讨在乳腺癌预后中的作用具有重要意义。

1资料与方法

1.1一般资料选取2005～2010年手术的80例乳腺癌石蜡包埋病理标本，患者均为女性，年龄33～82岁，平均49.2岁，将组织标本修整后，制成4 μm厚的石蜡切片。在检测细胞凋亡的同时，取一套重复切片，进行常规的HE染色，请病理高级医师阅片.核实原病理诊断，并确定病程组织学分类及分化程度，所有病例均采用WHO制定的乳腺癌组织学分级标准进行组织学分级，术前患者未经药物及其他辅助方法治疗。

1.2方法应用免疫组化技术，用原位细胞凋亡检测（TUNEL）试剂盒，对单细胞水平的凋亡进行免疫组化检测和量化分析。TUNEL试剂盒购于福建迈新生物技术开发公司，用PBS做阴性对照，用已知的阳性切片作为阳性对照。具体操作步骤简述如下：二甲苯脱脂，梯度酒精水化后，用蛋白酶K消化，然后加入0.3%的H2O2甲醇溶液室温下孵育，在37℃与TUNEL反应液反应60 min，37℃孵育盒中与辣根过氧化酶抗体结合后发色，苏木精复染，光镜下观察。

1.3PCNA、PgP免疫组化检测所有标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋、常规连续切片，免疫组织化学染色采用SP法，检测程序按试剂盒说明书进行，DAB显色。用已知乳腺癌组织阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗做阴性对照。

1.4判定标准细胞凋亡阳性的判断：AⅠ以肿瘤细胞核内出现光镜下观察，阳性细胞的胞核为棕黄色或棕褐色，呈均匀染色或颗粒状。观察阳性细胞的数量和分布，以40×10倍显微镜计数一个视野内的阳性细胞数，随机计数5个高倍视野，求出每个高倍视野内阳性细胞百分率，即AⅠ。规定AⅠ30%为强阳性+++。细胞凋亡指数的测定（apoptotic index AⅠ）：每张切片选择5个阳性染色最明显高倍视野（×400）计数500个肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比。PCNA免疫组化染色阳性部位在细胞核，PgP效应产物为棕黄色颗粒，定位于细胞膜上，部分胞浆也着色，少数癌旁正常组织也见PgP表达，较癌组织染色浅，分布范围少不均匀。

2结果

乳腺癌凋亡细胞的形态特征：①乳腺癌凋亡细胞的形态学特征：染色质定位于细胞核，呈棕黄色，浓缩的核质紧贴余核，部分凋亡细胞核明显缩小，但核膜完整。②乳腺癌中细胞凋亡的发生率，80例乳腺癌中，仅7例未发生凋亡，73例有不同程度的凋亡发生，凋亡发生率为91.2%。③凋亡细胞指数和腋窝淋巴结转移的比较：凋亡指数的高低与腋窝淋巴结有关，54例凋亡指数在0～0.21的患者中，仅4例出现淋巴结转移，26例凋亡指数在0.25～0.57的病例中，仅3例现淋巴结转移，PCNA阳性率（78.6%），组织学分级Ⅲ级乳腺癌PCNA指数高于IⅡ级组，淋巴结转移组高于未转移组，分化低的癌组织中癌细胞增殖活性强，容易发生淋巴结转移。PgP阳性表达率为（28.7%），高表达的肿瘤患者对化疗敏感性差，生存期有不同程度缩短。

3讨论

细胞凋亡是恶性肿瘤的自发现象[1]，是在多种基因调控下细胞程序性死亡过程，无论是肿瘤的发生、发展，还是治疗与预后，均与细胞凋亡有密切关系[2，3]，乳腺是雌激素作用的靶器官，正常乳腺在月经周期束期，细胞凋亡发生最明显[4]；在泌乳乳腺退化时，细胞凋亡也很常见，可见乳腺细胞凋亡和内分泌因素有关。肿瘤从正常细胞转为肿瘤细胞的过程中，发生浸润、转移是多阶段的，转移是一个逐渐发展的过程，肿瘤的一部分细胞还处在癌前细胞阶段，另一部分细胞已经浸润转移、走向凋亡，肿瘤的新陈代谢越快，出现凋亡细胞越多，凋亡与增殖呈正相关，而非想像的那样，凋亡与增殖呈负相关，其机制可能是同一肿瘤中的不同细胞亚群为竞争更好的增殖因素而发生的克隆性清除[5]。认为AI乳腺癌预后的一个参数，对凋亡细胞做为预后因子的意义以及对凋亡细胞的判定，AI高的病例，有着预后好的倾向。本实验的结果表明，AI高的病例，淋巴结的转移度低，从而有可能成为判断乳腺癌患者预后的有用指标。PCNA是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，其合成、表达与细胞周期有关，免疫组化方法显示PCNA表达阳性细胞是处于DNA合成期细胞，表达程度能客观反映肿瘤细胞的增殖活性，PCNA 指数越高，说明肿瘤细胞的增殖活性越高，瘤细胞转移的就大，PCNA在肿瘤的良恶性划分、恶性程度的确定等方面有广泛的应用[6]，PCNA的表达与肿瘤的大小无关，结论与一些报道结果一致[7]。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现抗药的同时，对结构不同、作用机制迥异的另外一些抗肿瘤药物产生交叉耐药，肿瘤耐药与多种耐药相关基因有关，说明在部分初治的乳腺癌病例中确已存在原发性多药耐药（MDR）现象。国内李杰等[8]研究后认为，PgP表达阳性与腋窝淋巴结转移，肿瘤远处转移和术前化疗密切相关，Pgp表达与月经状况、肿瘤大小、淋巴结转移个数、组织学分级之间均不具相关性，间接预示多药药是乳腺癌的内在表型。在有关Pgp表达与乳腺癌预后方面，PgP阴性表达无病生存期及总生存期均明显优于Pgp阳性表达组。Pgp表达与无病生存期和总生存的缩短均有关，Pgp表达是除了肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、组织学分级等证明的预后因素外。又一独立的乳腺癌预后不良因素，通过本组实验，我们发现Pgp在乳腺癌组织中有一定程度的表达；Pgp阳性表达与乳腺癌患者生存期的缩短有关，是判断乳腺癌预后的有用指标。

参考文献

[1]张淑群，王西京，纪宗正，等.乳腺癌中端粒酶活性与细胞凋亡的研究.西安交通大学学报（医学版），2003，24（3）：230248.

[2]范宇，傅西林，王颖，等.细胞凋亡及其相关基因与乳腺癌预后关系的研究.中国肿瘤临床，2000，27（7）：524529.

[3]MikamiT， Yanagisawa NBaba H， et al. Association of bcl2 proetin expression With gall bladder carcinoma differentiation and progression and its Relation to apoptosis.Cancer，1999，85：318329.

[4]Ferguson DJD， Anderson TJ Morphological evaluation of cell turnover in relation to the menstrual cycle in the “resting” human breast Breast.Br Cancer，1981，44：177179.

[5]Zheng WQ， ZhanRZ， Quantitative， comparison of apoptosis to cell proliferation and P53 protein in breast carcinomas. Analyt Quant Cytol histol，1998，20（1）：16.

[6]韩静绮，王峰梅，冶俊玲.乳腺癌中的ER，PR，P53，CerbB2和PCNA的表达及临床意义.第四军医大学学报，2008，29（7）：663665.

[7]田斌，孙涛，牛虎，等.PTEN，PCNA，IV型胶原在乳腺癌中的表达及临床意义，第四军医大学学报，2008，29（5）：457.

[8]李杰，许良中，吴昊.三种耐药基因蛋白表达在乳腺癌中的临床意义.癌症，2001，20（8）：866868.