高效液相色谱法测定人血浆中连翘苷含量

【摘要】 目的 建立高效液相色谱法，用于测定人血浆中连翘苷的质量浓度。方法 采用内标法， 以ThermoC18柱（4.6mm×250mm，5μm）为固定相，以乙腈-水-冰醋酸(17：83：0.4 ) 为流动相，流速为1mL／min，检测波长为277nm。 结果 血浆中连翘苷质量浓度在0.10～4.00μg／ml范围内与峰面积比值线性关系良好(R2= 0.999) ，最低检测浓度为0.05μg／ml，回收率达90％以上。结论 该方法具有较高的准确度，线性范围宽，方法灵敏，专一性好，操作简便，适用于连翘苷血药浓度的测定及临床药代动力学研究。

【关键词】 高效液相色谱法；连翘苷； 血药浓度

HPLC determination Of Phillyrin in Human Plasma

QIN Ying-pu1，MO Wu-ming2

1.Guangxi Wuzhou People’s Hospital, Wuzhou 543000, China; 2.Guangxi Wuzhou Sanjian Pharmaceutical Co., Ltd，Wuzhou 543001, China;

【Abstract】 Objective To determine the concentration of Phillyrin in human plasma by HPLC with ultraviolet detetion．Methods The internal standard method was used．The evaluation of Phillyrin was car ried out by ThermoC18 colum (4.6mm×250mm，5μm)with the mobile phase ofAcetonitrile - water - acetic acid (17：83：0.4 ) and the detection wavelength was 277nm．The flowrate was 1 mL／min．Results The calibration curve for plasma Phillyrin in range of 0.10～4.00μg／ml (R2= 0.999)．The detection limit of Phillyrin was 0.05μg／ml．The recovery was more than 90%．Conclusion This method is accurate，sensitive，specific and convenient，which could be used in the determination of plasma Phillyrin and its pharmacokinetic study in clinic．

【Key words】 HPLC；Phillyrin；blood drug concentration

连翘，又名旱莲子(《药性论》)、大翘子(《新修本草》) ，为木犀科植物连翘Forsythia suspense(ThunbVah1)的干燥果实。味苦微寒，归肺、心、小肠经，具有清热解毒、消肿散结的功效，主治痈疽、乳痈、丹毒风热感冒、湿病初起、高热烦渴、神昏发斑、热淋尿闭。主要分布于山东、山西、陕西、河南等省[1]。连翘苷是连翘中有效成分之一，研究表明连翘苷具有降血脂、减肥、抗菌等多种药理作用[2]。

为了深入研究连翘的药理活性机制，需要对连翘苷进行药物动力学的研究，而建立生物样品中连翘苷的定量分析方法是开展药物动力学研究的前提条件，因此本研究建立了一种检测人血浆中连翘苷的方法， 以便在此基础上进一步研究连翘苷的药物动力学特征。

1 仪器与试药

岛津20A液相色谱仪，岛津SPD20A紫外检测器，威玛龙色谱数据工作站；FA1004型分析天平(上海天平仪器厂)；

连翘苷对照品(批号171237-200304，中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用)。

黄芩苷对照品(批号110715-200815，中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用)。

乙腈为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ThermoC18柱（4.6mm×250mm，5μm）； 流动相：乙腈-水-冰醋酸(17：83：0.4 )；流速：1mL／min；检测波长：277nm；进样量：20μL；柱温：30℃。

2.2 对照液及内标溶液的配制 连翘苷对照品溶液：精密称取连翘苷对照品10.0mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为0.4mg/ml的连翘苷对照品贮备液。置冰箱4℃保存。内标液：精密称取黄芩苷对照品10.1mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为0.404mg/ml的黄芩苷对照品贮备液。临用前用相应溶剂稀释至所需质量浓度，即得。

2.3 血浆样品制备与测定 精密量取人血浆样品200μl，置离心管中，加入内标黄芩苷的甲醇溶液( 100μg／ml ) 20μl，旋涡混匀2min再加入200μl乙腈，以10000r／min离心5min，吸取上清液20μl进样，按拟订的色谱条件分离测定，记录色谱图和峰面积。

2.4 分析方法验证

2.4.1 线性范围 取连翘苷储备液分别稀释成0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，2.00，4.00μg／ml系列标准液，向6支具塞离心管中分别准确加入200μl连翘苷标准液，将离心管于45℃水浴中氮气流吹干。再向上述每个离心管中各加入200μl空白血浆， 按照“2.3项下血浆样品制备与测定” 处理后进样分析。以峰面积比A样／A内为纵坐标、连翘苷质量浓度 (μg／ml) 为横坐标进行线性回归，得标准曲线方程Y= 1.9646C + 0.008，R2= 0.999( n= 7 ) 。 结果表明，连翘苷质量浓度线性范围是0.10～4.00μg／ml。人空白血浆、血浆样品色谱图见图1、图2。检测限约为0.05μg／ml (S／N≥3 ) ，定量限为0.10μg／ml。

图1 人空白血浆色谱图

图2 （连翘苷+黄芩苷）血浆样品色谱图

1 连翘苷色谱峰 2 黄芩苷色谱峰

2.4.2 回收率试验 取0.1ml血浆，分别配制成高、中、低3种质量浓度(0.10，0.80，4.00μg／ml)的连翘苷血浆样本各6份。按“2．3”项下操作，测定药物峰面积。另流动相配制相应等浓度的连翘苷溶液，测定药物峰面积。将血浆样品的峰面积除以相应等浓度对照品溶液峰面积，即得绝对回收率。低、中、高3种浓度的平均绝对回收率分别为98.34％、95.27％、97.05％，RSD均小于15％。连翘苷在血浆中的回收率达90％以上，说明该药物在人血浆中回收率较好，符合检测要求(见表1)。

2.4.3 精密度试验 按回收率项下方法配制连翘苷碱血浆，提取后测定。以1 d内5次测定的连翘苷浓度计算日内精密度。另在1周内取上述连翘苷血浆每日各测定1次，计算日间精密度。结果低、中、高血浆日内RSD分别为6.217％，5.554％，4.871％(n=5) ，日间RSD分别为7.677％，8.234％，8.524％(n=5) 。日内、日间RSD均小于10％，说明精密度符合检测要求(见表1)。

表1 精密度和回收率实验结果

2.4.4 稳定性试验 同上配制成高、中、低3种质量浓度(0.10，0.80，4.00μg／ml)的连翘苷血浆样本，于-40℃～室温冻融1、2次、室温下放置4 h、-40℃保存4周、37℃保温4 h及样品处理后室温放置24 h，结果连翘苷的RSD分别为4.25％，8.37％，9.35％，6.81％，8.74％和9.62％，表明样品在上述情况下均稳定。

3 讨论

采用HPLC法测定连翘苷或黄芩苷含量的方法较为成熟[3]，连翘苷的紫外吸收为277nm，黄芩苷的紫外吸收为280nm，两者紫外吸收接近，同为苷类物质，性质相似，试验表明，黄芩苷提取率高，且具有与药物分离良好、对药物无干扰、出峰时间早、峰形好等优点，故选择黄芩苷作为内标物。

常用于血浆中蛋白沉淀的有机溶剂有乙醇[4]、乙腈[5]、乙醚[6]等，因本试验流动相含有乙腈，故首选乙腈作为沉淀剂，结果表明用乙腈沉淀时，血浆中杂质对药物测定无干扰，药物峰形好，回收率高。

本研究建立了一种简便、快速、灵敏准确的人血浆中连翘苷的检测方法，方法学验证结果表明其符合有关生物样品检测的要求，为其进一步的药代动力学研究奠定了良好基础。

参考文献

[1] 段文娟，耿岩玲等. 中药连翘化学成分和分析方法的研究进展. 山东科学，2010，23（2）：33-37,66

[2] 王金梅，许启泰等. 连翘化学成分及药理研究进展. 天然产物研究与开发，2007，19：153―157

[3] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典2010年版（一部）.中国医药科技出版社，2010：159,282

[4] 万丽丽，张剑萍等. HPLC法测定大鼠血浆中橙皮素和柚皮素的浓度. 中国药师，2009，12（11）：1521-1523

[5] 何成章，陆华等. 高效液相色谱法测定人血浆中帕尼培南的浓度.2010，32（10）:1271-1273

[6] 李丽，高运军等. 高效液相色谱法测定人血浆中盐酸伪麻黄碱质量浓度.中国药业， 2010，l9（l4）：28-29