药物缓释灵芝多糖载体:工艺优化和自由基清除能力评价

摘要：目的 优化灵芝多糖的制备工艺并评价其清除自由基能力。方法 使用热水浸提法从灵芝中提取醛基化天然多糖，根据Fenton反应原理对灵芝多糖清除自由基的能力进行分析。结果 料液比为1︰25，在70℃下浸提2.5h，提得率达到最高值2.6%。灵芝多糖对·OH的 IC50 最高可达1.58 mg·ml-1，对·O-2的IC50达2.83 mg·mL-1。结论 优化的最佳制备工艺为：料液比为1∶25，热水浸提的时间为2.5h，提取的温度在70℃左右。所制备的灵芝多糖具有良好的清除自由基能力。

关键词：灵芝多糖；自由基；热水浸提法

灵芝多糖具有提高机体免疫力、抑制肿瘤、延缓衰老等多种药理活性[1]。近年来，国内学者发现天然植物多糖修饰的聚阳离子作为基因药物载体具有无毒、无免疫原性、可降解性等特点[2-3]。灵芝多糖的发现与药理研究，为灵芝用作癌症化学治疗与放射治疗的辅助剂提供了重要的理论依据。

自由基不仅是生体多种生理功能的启动因素和生化反应的介导者，同时也在免疫细胞因子网络中起调节、信号转导作用[4]。现代医学认为，人类机体内自由基随着年龄的增长其自稳态平衡性下降，从而导致自身免疫功能下降，容易引发肿瘤、动脉粥样硬化、原发性高血压等自由基疾病[5]。有研究表明真菌提取物对自由基有一定的清除作用[6]。而多糖是真菌中的主要活性成分，因此多糖对自由基可能也具有一定的清除作用，但这些需要进一步的实验研究。

1 实验方法

1.1灵芝多糖的制备 本研究采用热水浸提法提取灵芝多糖，具体方法是：将破壁灵芝孢子粉与去离子水配制成不同料液比的悬液，在不同温度下浸提一段时间；以Sevage试剂[氯仿：正丁醇=5∶1（V/V）]除蛋白6、7次，直至蛋白质除尽。用旋转蒸发仪在60℃蒸馏浓缩，并用离心机取沉淀物（灵芝粉）。将灵芝粉配成重量比为5%的灵芝粉水溶液，在65℃～75℃搅拌下反应4h。静止沉降后取上层清液，再重复提取1～2次。将该浓缩液体放入95%乙醇中纯化、干燥。将提取的灵芝多糖配成质量分数为2%的水溶液加入高碘酸钠，避光磁力搅拌下反应24h，随后加入乙二醇终止反应15min，终止液加入NaCl，混匀5min，按体积比1：5倒入无水乙醇中沉淀、析出，将沉淀物干燥后得终产物醛基化灵芝多糖。

1.2性能测试

1.2.1对羟自由基（oOH）的清除作用 根据Fen-ton反应原理， H2O2在Fe2+存在时生成·OH，反应式如下：Fe2++ H2O2Fe3++·OH +OH-。·OH可使番红花T褪色。反应体系终体积4.5mL，其中含150mmol·L-1硫酸钠盐缓冲溶液（pH值7.4）、114 μmol·L-1番红花T、1.927 mmol·L-1 EDTA·Na2、1.0 mmol·L-1 硫酸亚铁、3% H2O2 以及不同浓度的样品，在37℃恒温水浴30min后，加入0.3mmol·L-1 EDTA·Na2终止反应，以缓冲溶液作参比检测其OD值。空白组以0.1mL蒸馏水替代样品，对照组以1.5mL蒸馏水替代样品和 EDTA·Na2。清除率=（A样品-A空白）/A对照×100%。

1.2.3对超氧阴离子自由基（·O-2）的清除作用 邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化生成有色中间物和·O-2，依据有色中间物的生成量可判断·O-2的生成量。将0.1mL不同浓度的样品，在25℃水浴20min后加入3mL浓度为7 mmol·L-1的邻苯三酚，反应4min后加入10mmol·L-1的HCl终止反应，以Tris-HCl缓冲溶液作参比，在420nm处测OD值。对照组以0.1mL蒸馏水替代样品，空白组为不加邻苯三酚。按下式计算清除率：清除率=（A'样品-A'空白）∕A'对照×100%。

2 结果与讨论

2.1热水浸提法提取工艺的优化 首先确定热水浸提法的最适温度。称取2g灵芝孢子粉，分别于温度在80℃，70℃和60℃浸提，料液比控制在1∶25，测试不同温度下不同时间的浸出率，其结果如图1所示。可以看出不同温度下，提出的速率不同，但温度过高会导致多糖的水解。因此，在80℃下随着时间的推移吸光度和浸提率也没有明显的变化趋势。而当温度为60℃、70℃时，随着时间的变化吸光度和浸提率都明显上升趋势，比较两个温度，70℃下吸光度变化更明显，因此70℃为更适宜温度。从图中还可看出，反应时间超过2.5h时浸出率出现了下降或者维持不变，表明最佳浸提时间当为2.5h左右。

料液比是热水浸提法提取灵芝多糖的另一个重要参数。选配料液比分别为1∶15，1∶20，1∶25，1∶30的灵芝孢子悬液，在70℃下浸提，每30min测定多糖吸光度A490并计算浸出率。结果如图2所示，料液比在1∶25的样品浸提2.5h后，多糖浸出率最高，达到2.63 %，故最佳料液比应选为1∶25。

1.2.2多糖清除自由基能力的评价 由表1可知，随着灵芝多糖浓度的增加，对Fen-ton反应体系产生的羟自由基·OH和邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子自由基·O-2的清除率相应增大。在相同浓度下，提取的灵芝多糖对·OH的清除效果明显强于·O-2。对两种自由基的清除值IC50分别高达1.58mg·mL-1和2.83mg·mL-1。样品浓度和清除率基本呈现正相关关系，说明量效关系非常明显。此外，灵芝多糖清除羟自由基·OH的能力强于超氧阴离子自由基·O-2。

3 结论

3.1控制料液比在1∶25，温度70℃，保温2.5h，有利于多糖浸提。

3.2对不同自由基的清除能力进行比较，结果表明提取的灵芝多糖清除羟自由基·OH的能力和超氧阴离子自由基·O-2均较好，并且清除能力和多糖浓度存在明显的正相关量效关系，相对而言，灵芝多糖清除羟自由基·OH的能力优于清除超氧阴离子自由基·O-2的能力。

参考文献：

[1]Y. H. You， Z. B. Lin. Protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of macrophages induced by reactive oxygen species [J]. Acta Pharmacol Sinica， 2009， 23（9）： 787-791.

[2]W. R. Gombotz， S. F. Wee. Protein release from alginate [J]. Adv Drug Deliver Rev，2009，31（3）：267-285.

[3]V. Lenaerts， Y. Dumoulin， M. A. Mateescu. Controlled release of theophyline from crosslinked anylose tables [J]. J Control Release，2008，15（1）：39-46.

[4]李荣芷，何云庆.灵芝抗衰老机理与活性成分灵芝多糖的化学与构效研究[J].北京医科大学学报，2004，23（6）：473-475.

[5]游育红，林志彬.灵芝多糖肽的抗氧化作用[J].药学学报，2003，38（2）：85-88.

[6]肖建辉，蒋侬辉，梁宗琪，等.食药用真菌多糖研究进展[J].生命的化学，2005，22（2）：148-151.