时间：2023-10-09 09:31:17
【关键词】 高效凝胶色谱法； 多花黄精多糖； 分子量及其分布
多花黄精多糖是从传统中药百合科植物多花黄精中发现并分离出一种低分子量活性多糖，为新药(中药)原二类,全国第一个治疗病毒性角膜炎的中药。多花黄精多糖抗单纯疱疹病毒i型的体外细胞培养试验结果结果表明,多花黄精多糖有明显的抗单纯疱疹病毒i型的作用。多糖为单糖的天然聚合物，多糖的性质和药理作用与其分子量大小，分子量分布及其结构密切相关。多糖的分子量不是均一的，具多分散性，需要用统计方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝胶色谱法测定多糖的分子量及其分布，具有快速，重现性好等优点，在国内外得到了广泛的应用[1]。多花黄精多糖为水溶性多糖，针对其单糖组成和空间结构与葡聚糖相似，在色谱柱的选择上倾向于更适合于水溶性多糖分离测定用的shodex ohpak sb803hq系列（对葡聚糖的排阻极限为1×105）。Www.133229.CoM有关多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布尚未见相关报道，本文应用凝胶渗透色谱（gpc）法测定多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布[2]，为考察生产工艺的稳定一致性及控制产品质量提供了科学依据，为多花黄精多糖分子大小和药理作用的相关性研究打下了一定基础。
1实验部分
1.1仪器与试药
agilent 1100型高效液相色谱仪（自动进样器），示差折光检测器。shodex ohpak sb803hq凝胶色谱柱。北京龙智达公司提供gpc专用软件。
供分子量测定用右旋糖酐分子量标准对照品（中国药品生物制品检定所提供，d0、d1、d2、d3、d5、d6、d8、d2000分子量依次为180、2500、4600、7100、21400、41100、133800、2000000）；其余试剂均为分析纯；高纯水用milliporeq超纯水系统制得。
试验用样品多花黄精多糖由四川泰华堂制药有限公司提供。
1.2方法与结果
1.2.1色谱条件色谱柱为shodex ohpak sb803hq，流动相为0.71%硫酸钠溶液（内含0.02%叠氮钠），柱温：35 ℃，示差折光检测器（检测器温度35 ℃），流速0.5 ml·min－1，取供试品溶液及对照品溶液各20μl注入液相色谱仪。
1.2.2溶液的制备取多花黄精多糖适量，加流动相制成每1 ml中约含10 mg的溶液，振摇，室温放置过夜，作为供试品溶液。另取d0，d2000及4～6个已知分子量的葡聚糖对照品，同法制成每1ml中各含10 mg的溶液作为对照品溶液。
1.2.2.5系统适应性试验取葡萄糖对照品溶液（d0），按1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，按葡萄糖峰计算理论塔板数n=5.54×trw1/2=16083；另取d2000对照品溶液，1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，计算分配系数，kd=trt0ttt0=0.52，kd在0～1之间，符合中国药典2005年版的要求。式中tr为供试品峰保留时间，t0为蓝色葡聚糖（d2000）峰保留时间，tt为葡萄糖（d0）峰保留时间。
1.2.3标准曲线的制备及样品测定
取上述右旋糖酐系列对照品溶液分别进样，记录洗脱峰的保留时间，由gpc专用软件绘制标准曲线，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得回归方程。该方法的标准校正曲线线性良好，相关系数达0.9997。根据gpc专用软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间采用gpc专用软件计算样品各组分的重均分子量及其分子量分布。 表1 右旋糖酐分子量标准对照品保留时间及其相应的对数值
1.2.4 精密度试验取供试品溶液20 μl，按“1.2.1”项下色谱条件，连续测定5次，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5018，5009，5009，5028，5017，rsd为0.16%，表明该系统测定样品分子量的精密度良好。
1.2.5重复性试验取批号为060701的样品，按“1.2.2”项下方法分别制备供试品溶液5份，按“1.2.1”项下色谱条件测定分子量及其分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5020，5028，5044，5054，5053，rsd为0.30%。表明该分析方法测定样品分子量精密度良好。
1.2.6稳定性试验取同一供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件，在0h、2h、4h、8h、12h和24h分别进样，测定分子量及分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5055，5090，5100，5126，5160、5046，rsd为0.84%。表明供试品溶液在24小时内稳定。
1.2.7样品的测定取不同批号的多花黄精多糖样品，按“1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，然后按“1.2.1”项下的色谱条件测定分子量及分子量分布，结果见表2。表2 3 批样品重均分子量及其分布情况表
2讨论
根据以上测定结果可见，测定的三批多花黄精多糖的重均分子量分布在2500～7500之间，分布宽度小于2.0。用本方法测定多花黄精多糖的分子量与分子量分布，准确可行，简便快捷，精密度好。
分布宽度的引入，使多花黄精多糖的分子量分布更具可控性，能够通过检测该指标反映生产该样品的工艺的变化以及样品质量的变化，使得样品的质量更具有可控性。
【参考文献】
关键词 间苯二甲酸二辛酯；气相色谱-质谱联用法；食品塑料；包装材料；检测；加标回收率
中图分类号 O657.7+1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）19-0273-02
为了改变材料的功能或性质，在食品包装材料和容器的生产过程中通常会添加一些化学助剂，其直接与食品接触后会迁移到食品中，这其中最引入关注的就是增塑剂[1]。目前，这类物质的主要代表就是邻苯二甲酸酯类增塑剂（Phthalate Esters，PAEs）化合物，它们对人类产生的影响，主要表现为改变人体内分泌系统的正常功能，并对人体内未受损的器官或其后代造成不利影响。该类物质发挥着类似雌性激素的作用存在于人体和动物体内，它不仅使女性患乳腺癌的几率增加，而且甚至还会危害她们将来生育男婴的生殖系统[2-3]；同时，它还可减少男性的量和数量，甚至导致癌。
2011年的“起云剂”和2012年的白酒“塑化剂”等重大食品安全事件都是由邻苯二甲酸酯类化合物引起的，因此人们对这类物质的关注都很高。与邻苯二甲酸酯结构相似的间苯二甲酸酯也是一类十分重要的化工原料，广泛用于生产塑料、涂料、油漆、化学纤维等。间苯二甲酸酯类物质被列为环境激素类物质，因为它可能具有致癌、致畸、致突变的作用。这类物质可以对动物的内分泌调节作用产生重大影响，从而导致动物不能正常生长和发育。间苯二甲酸酯类物质主要通过食品生产加工和包装过程所接触材料迁移进入食品。间苯二甲酸酯也是高脂溶物质，主要污染鱼、肉、蛋及含油脂等食品。但目前我国对此类苯二甲酸酯的检测方法标准却是空白，甚至也很少有人研究包装材料中这类物质的检测方法。因此，我国目前缺少对这类污染物进行监管的技术条件。但随着间苯二甲酸二甲酯限量的制定，欧盟将会逐渐重视这类污染物的检测，这将对我国今后的食品和食品包装材料出口贸易产生重要的影响。此外，食品接触材料中的这类环境内分泌干扰物在与食品接触之后将迁移到食品中，造成食品污染，直接危害我国人民的身体健康。因此，必须尽快建立测定这类化合物的系列检测方法标准，确保食品安全和降低出口风险，消除技术壁垒[4]。本文使用环己烷-乙酸乙酯混合溶剂作为提取溶剂，采用凝胶渗透色谱净化技术，首次对塑料食品包装材料中间苯二甲酸二辛酯的含量进行了测定。试验结果表明该方法准确、简便、快速，结果令人满意，为食品包装材料的质量安全监管提供了技术手段。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试试剂。环己烷、乙酸乙酯（HPLC级，美国Fisher公司）；间苯二甲酸二辛酯（纯度均≥98%，Dr. Ehrenstorfer标准品公司，CAS：137-89-3）；其他试剂均为分析纯（上海国药集团）。
1.1.2 试验仪器。由美国Thermo Fisher Scientific公司生产提供的TSQ Quantum GC串联四极杆气质联用仪、Xcalibur数据采集处理系统；由德国LC-Tech公司生产提供的凝胶渗透色谱仪（GPC）；由昆山市超声仪器有限公司生产提供的KQ5200DE数控超声波清洗器。
1.2 试验方法
1.2.1 制备间苯二甲酸二辛酯标准溶液。称取间苯二甲酸二辛酯标准品（要求精确至0.1 mg），再利用正己烷将其配制成 1 000 mg/L的储备液。用环己烷-乙酸乙酯（1：1，v/v）逐级稀释成10、50、100、200、500 μg/L的标准工作溶液[5]。
1.2.2 样品前处理。首先将食品塑料包装材料粉碎成细小颗粒，要求粉碎程度达到单个颗粒
1.2.3 GC-MS分析条件。使用Rtx-5 MS毛细管气相色谱柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气，不分流进样，气体流速为1.0 mL/min。柱箱初始温度为初始柱温70 ℃，以40 ℃/min的速度升温，直至将温度升至280 ℃，保持6 min；进样器温度为280 ℃，检测器温度为280 ℃。EI离子源，230 ℃，70 ev；质量扫描方式：选择离子监测（SIM），监测离子为167、279、149和261；其相对丰度比为167∶279∶149∶261=100∶32∶26∶9；定量离子为167。标准谱图调谐。
1.2.4 建立间苯二甲酸二辛酯标准曲线。标准工作溶液经过GC-MS分析测定后，以间苯二甲酸二辛酯的标准溶液浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，作校准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。最终确定间苯二甲酸二辛酯含量在10～500 μg/L范围内呈现良好线性关系，其线性方程为Y=4313 3.3X-13 025.3（r2=0.999 8）。
1.2.5 凝胶渗透色谱条件。凝胶渗透色谱柱：320 mm×25 mm （内径）玻璃柱，Bio-beads（S-X3），200～400目，50 g；流动相：环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v）；流速：5 mL/min；流出液收集时间：20～35 min。取上述提取液5 mL按照凝胶色谱条件净化，收集净化液直接用于GC-MS测定[6]。
2 结果与分析
2.1 萃取溶剂的选择
在试验过程，分别选择二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷和环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v）等5种溶剂，并比较它们的萃取效率，以提高食品塑料包装材料中间苯二甲酸二辛酯的萃取效率。结果表明，当间苯二甲酸二辛酯的浓度为 100 μg/kg时，二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷和环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v）等5种溶剂的加标回收率分别为92%、95%、95%、96%、97%，即5种溶剂的萃取效率相当。但使用二氯甲烷萃取聚氯乙烯塑料时，由于二氯甲烷的浓缩液为粘稠状，因此存在污染分析仪器的风险。为减少试验步骤，考虑到GPC使用的溶剂为环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v），最终将萃取溶剂定为环己烷+乙酸乙酯。
2.2 定性分析
间苯二甲酸二辛酯标准物质的总离子流色谱图见图1，待测成分的保留时间为9.01 min，而加标的样品中间苯二甲酸二辛酯与标准物质的保留时间相同，且峰形表现为尖锐对称，待测物的色谱峰周围很少看到干扰色谱峰。此外，间苯二甲酸二辛酯标样全扫描质谱图见图2，比较两者的全扫描质谱图可以发现，其离子碎片主要是167、279、149和261等，且相对丰度比基本上是100∶32∶26∶9。这说明该方法分离比较完全，且具有抗干扰能力强的优势，完全可以用于对间苯二甲酸二辛酯的准确定性分析[7]。
2.3 净化条件的优化
食品包装材料印刷油墨的成分较复杂，通常会含有较多有机杂质，存在较大的基质效应，需对样品的提取液进行净化处理。提取液的一般采用固相萃取小柱进行净化，但考虑到GPC是除油墨中大分子杂质的较理想的净化方法，且容易实现自动化[4]，因此试验净化处理方法采用GPC。同时，分别将收集时间设定为10～15、10～20、10～25、10～30 min，考察流出液收集时间对于目标化合物回收率的影响。试验结果表明，以10～25、10～30 min时间段的间苯二甲酸二辛酯的平均回收率较好，最终将GPC流出液的收集时间定为10～25 min，以利于节约溶剂。通过GPC净化和富集，样品基质的背景噪音得到降低，效果很好。
2.4 空白样品的加标回收率和精密度
向空白样品中添加间苯二甲酸二辛酯标准溶液，浓度分别为0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/kg，然后利用上述方法进行检测分析，获得间苯二甲酸二辛酯的平均回收率分别为108%、81%、79%、93%和92%（表1）。试验结果表明，对于间苯二甲酸二辛酯定量测定的要求，该方法的回收率和精密度均可满足。根据对空白样品进行试验测定的检出限，确定方法的检出限为0.05 mg/kg。
3 结论与讨论
试验结果表明，笔者建立的食品塑料包装材料中间苯二甲酸二辛酯残留检测的GC-MS方法具有简单、灵敏和快速的优点，而且笔者还优化了食品塑料包装材料的提取溶剂等前处理方法和GC-MS分析仪器条件[7]，最终说明该方法可应用于食品塑料包装材料中间苯二甲酸二辛酯的定性定量检测，填补了国内空白。
4 参考文献
[1] 陈志锋，潘健伟，储晓刚，等.塑料食品包装材料中有毒有害化学残留物及分析方法[J].食品与机械，2006，22（2）：3-7.
[2] 陈军，柳艳.残留的检测[J].检验检疫科学，2008，18（6）：45-47.
[3] 张伟亚，王成云，刘丽.固相微食品包装材料中邻苯二甲酸酯增塑剂萃取气相色谱-质谱法测定塑料浸泡液中己二酸酯类增塑剂的溶出量[J].塑料科技，2007，35（2）：74-76.
[4] 张居舟，李静，何俊，等.凝胶渗透色谱-气相色谱串联质谱法同时测定食品包装材料印刷油墨中8种光引发剂[J].中国印刷与包装研究，2014，6（6）：118-123.
[5] 张磊，吴青，梁健华，等.高效液相色谱法同时测定食品塑料包装材料中8种邻苯二甲酸酯的含量[J].食品科学，2012（20）：184-188.
[6] 方姚，沙万忠.食品及食品包装材料中邻苯二甲酸酯类增塑剂检测技术研究进展[J].刑事技术，2016（1）：20-24.
关键词： 凝胶色谱法；凝胶电泳法； 血红蛋白
G633.91
DNA和蛋白质技术包括DNA的粗提取与鉴定、PCR技术和血红蛋白的提取和分离等，是开展分子生物学研究的基本技术。蛋白质是生命活动不可或缺的物质。血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中的氧气和二氧化碳的运输。
一、 血红蛋白蛋白质提取和分离的原理
血红蛋白蛋白质提取和分离的原理是根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以分离不同种类的蛋白质。
二、 血红蛋白蛋白质提取和分离技术方法有凝胶色谱法和电泳法。
凝胶色谱法是根据分子量的大小来分离蛋白质的，而电泳法是根据各种分子带电性质的差异以及分子本身形状、大小的不同来把蛋白质分离开的。
1. 凝胶色谱法
凝胶色谱法分离蛋白质的原理：在多孔球体的凝胶内，蛋白质相对分子质量的大小不同，大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子通过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。相对分子质量的不同蛋白质因此得以分离。凝胶材料是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。
2.凝胶电泳法
电泳法是带电颗粒在电场中向电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳法原理是：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向和阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同，因而可聚集形成不同的条带，因而达到分离的目的。影响蛋白质分子运动速度的因素中，蛋白质的电荷性质决定蛋白质运动方向，蛋白质带电荷量的多少决定电场作用力的大小，分子形状和大小形成阻力大小，蛋白质的运动速率由电荷量、分子形状和分子大小共同决定。
实验探究 蛋白质为什么带有带电荷？
蛋白质是由氨基酸组成的，还有一个羧基和一个氨基，在一定的PH下，蛋白质可解离的基因会带上电荷。
三、实验操作步骤
蛋白质的提取和操作一般分为五个阶段：材料的选择和预处理、粗分离（细胞的破碎）、提取、纯化（包括盐析，层析，有机溶剂提取，有机溶剂沉淀等）和浓缩干燥及保存。我们取哺乳动物红细胞（猪的新鲜血液）为材料，来进行血红蛋白的分离方法。
1.样品处理及粗分离
⑴ 样品前处理 包括细胞的破碎有机械方法、物理方法和化学及生物化学方法。
⑵ 细胞器的分离 从样品水溶液中提取、用有机溶剂提取、利用表面活性剂提取和对提取物进行保护。
①样品分离器材：离心机，0.9%的NaCl溶液和20mmol/L的磷酸缓冲液。
②步骤包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心（500r/min离心2min），然后用胶头吸管吸上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的0.9%的NaCl溶液，缓慢搅拌10min，低速短时离心，如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色为止。将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。然后转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min，就可以明显看到试管中溶液分四层，从上往下数，第一层为无色透明的甲苯层，第二层为白色波层固体，是脂溶性物质沉淀层，第三层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的分层液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，静置后分出下层的红色透明液体。取1mL血红蛋白溶液装入透析袋子中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度20%mmol/L的磷酸缓冲液中（PH为7.0），透析12h即可。
⒉ 凝胶色谱操作
⑴凝胶色谱柱的制作 取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端磨平。玻璃管两端色上合适的橡皮塞，中间打孔，孔径为0.5mL插入移液管，在色V柱下端用移液管头部作出口部位，连接一细的尼龙管，用螺旋塞控制尼龙管的打开与关闭，尼龙管的另一端放入收集色谱液的收集器内。
⑵ 凝胶色谱柱的装填凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成配成凝胶悬浮液，在于下端连接的
尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，轻轻敲动色谱柱使凝胶装填均匀。并立即用20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤，使凝胶装填紧密。
⑶血红蛋白样品的加入和洗脱 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平，关闭出口。用吸管小心地将透析后的样品加到色谱柱的顶端，并打开下端出口，是样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，并加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当的高度，连接洗脱瓶，打开下边出口，进行洗脱。待红谱柱接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，连续收集。
⒊ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
⑴原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。
聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。
⑵具体操作包括：①红细胞的洗涤 ；②色谱柱填料的处理；③凝胶色谱柱的装填；④蛋白质的分离。
⑶ 小结
【关键词】天然药物；强极性化学成分；亲水作用色谱；反相色谱；高速逆流色谱
长期以来，由于条件的限制和方法的不成熟，对天然产物化学成分的研究多局限于脂溶性成分，关于天然药物中非极性、低极性化合物的分离纯化均有相关专著，然而根据传统用药习惯，天然药物大多用水煎服，许多有效成分如生物碱、有机酸、多糖类等都较亲水，极性强。强极性化合物的分离一直是天然产物分离工作中的难点之一，本文综述了天然药物中各类亲水性、强极性化学成分的分离纯化技术，归纳各类强极性化学成分分离纯化方案，以期系统、快速、有效的提取、分离纯化以及制备高纯度的天然化合物，为全面研究天然药物化学成分提供一定的参考。
一、层析分离
层析分离是一种经典的传统分离手段，具有分离效能高，快速简便等特点，被广泛用于黄酮类、生物碱、挥发油、蒽醌类等天然产物中化合物的分离和纯化。根据分离机理，大致可以将强极性化学成分分离层析方法归纳为以下几种。
1．亲水作用色谱。亲水作用色谱（Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）是采用极性固定相、高含量极性有机溶剂－水相缓冲液为流动相的一种分离技术，它能有效地保留反相色谱中保留弱或者不保留的强极性化合物。HILIC作为一种分离极性化合物的液相色谱模式，其概念最早是由Alpert于1990 年提出。其主要特征是使用类似于正相色谱的极性固定相和水/有机溶剂流动相与正相色谱类似，在HILIC模式下化合物的保留时间随化合物极性的增强而增加。但是，由于HILIC使用含水流动相，这就可以解决正相色谱中水溶性物质不溶于流动相的问题。近年来随着强极性化合物的分离问题引起了各个研究领域的重视及HILIC自身的优势，使得HILIC逐渐引起人们的关注。Min Liu等以Atlantis HILIC 硅胶住为固定相，乙腈/50mM甲酸铵为流动相，调pH3，梯度洗脱，成功的分离强极性化合物2-氨基咪唑（2-AMP）及其类似物3-AMP、4-AMP。
2．反相色谱。反相色谱是以表面非极性载体为固定相，而以比固定相极性强的溶剂为流动相的色谱分离模式。天然产物化合物的分离常用的反相层析柱固定相为十八烷基（ODS）。ODS反相柱可减少死吸附，有效的实现中到大极性化合物的分离。日本学者Shiji Yahara采用反复硅胶柱层析和ODS层析对新疆一枝蒿Astragalus shikokianus 40%甲醇洗脱物进行化学成分分析，得到黄酮苷astrasikokioside I。ODS柱对于极性较大的糖苷类化合物具有很好的吸附与解吸能力。多用于正丁醇部位、水部位化学经大孔树脂、硅胶等粗分后所得组分细分时所用材料。
3．正相色谱。正相色谱是采用极性固定相和相对非极性流动相，由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液－液色谱系统一般可用于分离极性化合物，化合物保留时间随着极性的增强的加长。主要用于分离甾醇类、类脂化合物、磷脂类化合物、脂肪酸以及其他有机物。A.E. Borgund采用正己烷、二氯甲烷、甲醇混合溶剂为流动相，正相液相色谱模式分离、富集油中的有机酸，建立的方法既可以用于分离，也可以用于制备。正相色谱虽然多用来分离弱极性或非极性的烃类化合物，但条件适当，可用于分析分离苷类化合。
4．凝胶过滤色谱。凝胶色谱也叫凝胶渗透或分子筛过滤。固定相是具有一定大小孔径的多孔凝胶制成。各组分在柱内的保留时间和从柱中流出的次序决定于分子的大小，分子量大、体积大的，不能进入凝胶颗粒内部而被排阻在凝胶粒子外部，只能在颗粒间移动，较早地被溶剂冲出来，因此大分子首先从柱底流出，分子量小、体积小的化合物可自由渗入微孔扩散到凝胶颗粒内部，故通过色谱柱时阻力增大，流速变慢，最后从柱底流出，因此，各组分在凝胶柱色谱被洗脱出柱的先后顺序基本是按分子大小排列的，不受化合物极性大小的限制，故可用于强极性化合物的分离纯化。天然产物化合物分离中，用的较多的是Sephadex LH-20。在国外，很多学者采用凝胶进行分段，国内很多实验室Sephadex LH-20 用于除去色素和最后的细分。
二、高速逆流色谱
高速逆流色谱（High-speed counter current chromatography，HSCCC）是利用溶质在两相无不相容的溶剂系统中分配系数的不同，从而进行分离的色谱法。由于其无不可逆吸附，回收率两大特点，逆流色谱从逆流分配、液滴逆流色谱到现在的HSCCC历程十年，技术和设备日臻成熟，受到不同学者的关注，广泛用于中药及天然产物的研发。HSCCC在天然产物分离中成功应用在于两相溶剂系统的选择和优化。当前，HSCCC广泛的被用于分离生物碱类、黄酮类、蒽醌类等化合物。
三、膜分离技术
膜分离技术是现代分离技术领域先进的技术之一，使用膜技术(包括半透膜、超滤膜、微孔滤膜、反渗透膜等)可以在原生物体系环境下实现物质分离，可以高效浓缩富集产物，有效去除杂质。超滤法是上世纪六、七十年展起来的一种膜分离技术，是以超滤膜作为分离介质的一种膜分离技术，具有分离不同分子量分子的功能。超滤法的工作原理是含有两种或两种以上溶质的溶液，通过滤膜分离流动时，其中分子体积小的溶质，经滤膜流出，而分子体积较大的溶质，不能通过滤膜而被截留；含有一种溶质的溶液，通过滤膜可将溶质全部截留，经滤膜流出的是纯净的溶剂。超滤法的特点是有效膜面积大，分离效率高，滤速快，不易形成表面浓度极化现象，无相态变化，能耗小，可在常温下进行操作，对分离热敏性、保味性的药物更为适用。这种分离方法应用于中药有效成分的分离纯化中已显示出极大的优越性，以超滤为代表的膜分离技术曾被列为医药领域国家“八五”重点科技项目，目前，国家中医药管理局又将膜分离技术列为“十五”新药研究研发中的支持项目，相信此技术将有良好的应用前景。
四、小结与展望
天然产物开发及新药的发现经常要面对化学成分的分离问题，天然产物的化学成分极其复杂，要获得大量高纯度的单一有效成分，常要综合性地利用各种溶剂提取法及层析方法。所有的层析方法包括亲水作用色谱、反相色谱、正相色谱、凝胶色谱（Sephadex LH-20）、高速逆流色谱、膜分离，均具有选择性高、载量大、有机溶剂用量少等特点。利用这些层析纯化概念，希望能够更系统、快速、有效的提前、制备天然产物中亲水性、强极性化合物。
综上所述，纵然各种方法在天然产物开发中取得了很好的效果，但由于天然产物种类繁多，性质各异，必须针对各类甚至各个化合物的性质综合考虑提取、分离、纯化中的各个环节。针对不同的化合物性质制定特异性的分离方案，结合现代化的分析手段与药效学评价，阐明化合物结构与药效之间关系，才能更好的开发更多的具有价值的先导化合物。
参考文献
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[关键词] 妇舒保凝胶；TLC；盐酸小檗碱；大黄酸；大黄素甲醚；HPLC
[中图分类号]R944 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0142-05
[Abstract] Objective To establish the quality standard of Fushubao Gel. Methods Phellodendri Chinensis Cortex， Sophorae Flavescentis Radix， Rhei Radix et Rhizome were identified by TLC. The contents of Hydrochloric acid Berberine， Rhein and physcion were determined by HPLC. Results The TLC spots were clear and the blank test showed no interference. The linear ranges of Hydrochloric acid Berberine， Rhein and physcion were 5-30， 4.19-25.14， 14.58-174.99 μg/mL respectively. The content were 0.0277， 0.0249， 8.709 mg/g. The recoveries were 98.37%， 98.1%， 97.9% respectively. Conclusion The method is reliable and accurate，and can be applied as the quanlity control method for Fushubao Gel.
[Key words] Fushubao Gel； TLC； Hydrochloric acid Berberine； Rhein； Physcion； HPLC
妇舒保凝胶处方来源于江苏省中医院临床验方，处方组成为：黄柏、苦参、大黄、虎杖、五倍子、冰片等10味中药。经过长期的临床实践，证明本方具有清热燥湿、凉血活血、祛腐生肌、收敛止血之效，临床用于治疗衣原体、支原体感染以及宫颈炎、宫颈糜烂、阴道炎等[1-2]。妇舒保凝胶是采用水溶性基质，将中药饮片经过提取精制的药粉，加适宜附加剂而制成的中药凝胶剂[3-5]。凝胶剂是一种适用于中药外用的理想剂型，有较好的生物相容性，无油腻感，有利于药物的释放。我们对该制剂进行开发研究，本试验建立了该制剂的质量标准。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Waters2695 高效液相色谱仪，Waters 2998 紫外检测器，Empower 色谱工作站；AUX220 分析天平（SHIMADZU）；800型电动离心沉淀机（江苏省江阴市保利科研器械有限公司制造）；薄层色谱成像系统（大昌华嘉商业（中国）有限公司）；Drict-Q5超纯水机（法国Millipore公司）。
1.2 材料
盐酸小檗碱（批号：110713-200911），苦参碱（批号：111575-200502），大黄素（批号：110756-200110），大黄酸（批号：110757-200206），大黄素甲醚（批号：110758-201013），芦荟大黄素（批号：110795-200605），大黄酚（批号：110796-200309），以上对照品均购买自中国食品药品检定研究院。处方中所有中药饮片均来自于张家港市中医医院药剂科，符合2015年版《中国药典》一部项下规定。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自德国默克；水为超纯水；其余所用化学试剂均为分析纯。
2 方法及结果
2.1 薄层鉴别
2.1.1黄柏的鉴别
2.1.1.1对照品溶液 用甲醇配制盐酸小檗碱对照品，制成约0.5 mg/mL的标准品溶液。
2.1.1.2供试品溶液 分别精密称取妇舒保凝胶（3个不同批号）各0.5 g，用10%NaCl溶液1 mL进行沉析后加甲醇10 mL，超声10 min（频率为40 kHz，功率为250 W），取出，滤过，溶剂蒸干，残渣加1 mL甲醇配制成供试品溶液。
2.1.1.3阴性对照液 按照处方配比取除黄柏以外的其他药材共0.2 g，用与供试品制备相同方法，制备阴性对照液。
2.1.1.4 薄层鉴别 吸取上述各种溶液5 μL，在同一块硅胶G板点板，展开剂为苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5），并置氨蒸气饱和缸内展开，置365 nm紫外灯下检视[6]。结果黄柏供试品与其对照药材、对照品在相对应位置处显同样荧光斑点，而阴性对照液在相应位置无此斑点。
2.1.2 苦参的鉴别
2.1.2.1对照品溶液 取苦参碱对照品，加甲醇制成约1.0 mg/mL的标准品溶液。
2.1.2.2供试品溶液 分别精密称取妇舒保凝胶（3个不同批号）各1 g，加入10%NaCl溶液1 mL，沉析，再加入氯仿30 mL和浓氨试液0.6 mL，超声20 min（频率为40 kHz，功率为250 W），过滤得续滤液，取20 mL挥干，残渣加氯仿1 mL制成供试品溶液。
2.1.2.3阴性对照液 按照处方配比取除苦参以外的其他药材共0.2 g，用供试品相同方法制备阴性对照液。
2.1.2.4薄层鉴别 吸取上述各种溶液5 μL，在同一块硅胶G板点板展开，展开剂为苯-醋酸乙酯-丙酮 -浓氨（2∶4∶3∶0.1），取出晾干，喷碘化铋钾显色，检视[7]。结果供试品、对照品在同一位置显红褐色斑点，阴性对照在相应位置没有此斑点。
2.1.3大黄的鉴别
2.1.3.1对照品溶液 分别取对照品（大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素和大黄素甲醚）适量，加甲醇配制成约0.5 mg/mL的标准品溶液。
2.1.3.2供试品溶液 分别精密称取妇舒保凝胶（3个不同批号）各1 g，加入10%NaCl溶液1 mL，沉析，转移至10 mL容量瓶，超声10 min（频率40 kHz，功率250 W），取出，过滤得续滤液，将其中溶剂蒸干，残渣加水10 mL、盐酸1 mL，加热30 min后置冰水中迅速冷却，加乙醚萃取（2次，10 mL/次），合并乙醚液，继续蒸干，残渣加1 mL氯仿制成供试品溶液。
2.1.3.3阴性对照液 按照处方配比取除大黄以外的其他药材共0.2 g，用供试品相同方法制备阴性对照液。
2.1.3.4薄层鉴别 吸取上述各种溶液5 μL，在同一硅胶H薄层板上点样，薄层板以羧甲基w维钠为黏合剂，展开剂为石油醚-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1），展开，取出晾干，检视[8-9]。结果大黄供试品、对照药材在同样位置显5个同样的橙黄色斑点；并与对照品在同样位置上显同样的橙黄色斑点。
2.2含量测定
2.2.1盐酸小檗碱的含量测定
2.2.1.1色谱条件 SunFire C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为乙腈（25%）-0.05%磷酸二氢钾（75%），检测波长为345 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃[10]。
2.2.1.2 供试品溶液制备 取妇舒保凝胶样品1.0 g，精密称定，置具塞平底烧瓶中，加入10%的NaCl 10 mL，用力振摇，使沉析，过滤得续滤液，加入10 mL 1%盐酸甲醇溶液，超声10 min（频率为40 kHz，功率为250 W），定容于50 mL量瓶中，滤过，取续滤液1 mL，挥去溶剂后加甲醇定容至10 mL量瓶中，即得供试样品溶液[11-12]。
2.2.1.3对照品的制备 取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制得291.65 μg/mL的对照品溶液。
2.2.1.4线性关系的考察 精密吸取上述盐酸小檗碱对照品溶液适量，加甲醇配制成盐酸小檗碱浓度为14.58、29.16、58.33、87.49、116.66、174.99 μg/mL的对照品溶液，分别吸取上述溶液5 μL注入HPLC色谱仪中按“2.2.1.1”项下色谱条件测定，以峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程：A=16 144C-40 321，r=0.9994，结果表明盐酸小檗碱在14.58～174.99 μg/mL浓度范围内线性关系良好。
2.2.1.5精密度考察 精密吸取291.65 μg/mL对照品溶液5 μL，按色谱条件在24 h内连续进样6次和6 d内同一时间进样6次，测定峰面积，并计算RSD。结果RSD（日间）=1.28%，RSD（日内）=1.21%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.2.1.6稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液5 μL，按“2.2.1.1”色谱条件分别在0、2、4、6、8、12 h测定，并计算相对标准偏差（RSD）。结果盐酸小檗碱的峰面积RSD值为1.41%（n=6），试验结果说明样品溶液在12 h内稳定。
2.2.1.7重复性考察 精密称取6份妇舒保凝胶（同一批号）1.0 g，按“2.2.1.2”方法制备，在“2.2.1.1”项下色谱条件下分别精密吸取10 μL进行测定并计算。结果盐酸小檗碱的平均含量为8.731 mg/g，RSD为1.23%（n=6）。结果表明该方法重复性良好。
2.2.1.8专属性试验 按处方比例，不加黄柏的药材，按照工艺路线制得缺黄柏制剂，再按照供试品的制备方法进行阴性供试样品的制备，并进样测定，结果发现，阴性供试样品溶液色谱图在盐酸小檗碱处无吸收，说明阴性样品无干扰。结果见图1。
2.2.1.9加样回收率试验 精密称定同一批号妇舒保凝胶0.5 g，分别加入盐酸小檗碱对照品，按“2.2.1.2”方法制备，在“2.2.1.1”项下色谱条件下测定并计算。结果平均回收率为97.9%（n=6），RSD=0.98%。
2.2.1.10样品含量测定 分别精密称取三批中试样品（批号：20130921、20130923、20130925）1.0 g，平行三份，按照“2.2.1.2”方法制备，在“2.2.1.1”项下色谱条件下测定，并计算每克凝胶中含有指标成分盐酸小檗碱的量，结果见表1。
由表1可得，每克妇舒保凝胶中所含的盐酸小檗碱的平均值为8.709 mg。根据样品含量测定结果，考虑到药材的来源有一定的不稳定性，为了保证产品的稳定性，以含量测定结果的80%作为下限，即妇舒保凝胶中每l g凝胶所含盐酸小檗碱的含量不得低于6.967 mg。
2.2.2大黄酸和大黄素甲醚的含量测定
2.2.2.1色谱条件 色谱柱 SunFire C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇-0.1%磷酸（85∶15），检测波长为254 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。
2.2.2.2供试品溶液制备 精密称定妇舒保凝胶样品约1.0 g，置具塞平底烧瓶中，加入10%的NaCl 10 mL，用力振摇，使沉析，过滤得滤液，加8%盐酸溶液10 mL，再加CHCl3 10 mL，超声20 min（频率为40 kHz，功率为250 W），用CHCl3萃取（3次，10 mL/次），合并CHCl3液，减压回收溶剂至干，用甲醇定容至10 mL，得供试样品溶液，备用。
2.2.2.3对照品的制备 精密称取对照品适量，加甲醇溶解分别制成含50 μg/mL大黄酸和41.9 μg/mL大黄素甲醚的混合对照品溶液。
2.2.2.4线性关系的考察 精密配制大黄酸和大黄素甲醚的质量浓度分别为5.0、10、15、20、25、30、4.19、8.38、12.57、16.76、20.95、25.14 μg/mL的混合对照品溶液，按上述色谱条件测定，得标准曲线方程。大黄酸：A=24 140C-11 695，r=0.9992；大黄素甲醚：A=3873.8C+54 547，r=0.9992。
2.2.2.5精密度考察 精密吸取6 μL混合对照品溶液，按色谱条件在24 h内连续进样6次和6 d内同一时间进样6次，测定大黄酸和大黄素甲醚的峰面积值并计算相对标准偏差（RSD），结果大黄酸RSD分别为0.70%、0.74%（n=6），大黄素甲醚RSD分别为0.61%、0.54%（n=6）。试验结果表明该仪器精密度良好。
2.2.2.6稳定性考察 精密吸取6 μL供试品溶液，按色谱条件在0、2、4、6、8、12 h进样，测定峰面积并计算相对标准偏差（RSD）。结果大黄酸和大黄素甲醚峰面积RSD值分别为0.86%和0.64%（n=6），表明样品溶液在12 h内稳定。
2.2.2.7重复性考察 取6份同一批妇舒保凝胶样品2.5 g，精密称定，按“2.2.2.2”方法制备，精密吸取10 μL，在“2.2.2.1”色谱条件下测定，结果大黄酸的平均含量为0.0273 mg/g，RSD为0.51%（n=6）；大黄素甲醚的平均含量为0.0246 mg/g，RSD为2.22%（n=6）。表明该方法重复性良好。
2.2.2.8专属性试验 按“2.2.2.2”项制得缺大黄制剂，并进样测定，结果发现，阴性供试样品溶液色谱图在大黄酸和大黄素甲醚处无吸收，说明阴性样品无干扰。结果见图2。
2.2.2.9加样回收率试验 精密称定妇舒保凝胶1.25 g（批号20130921），分别加入大黄素甲醚和大黄酸对照品适量，按上述“2.2.2.2”方法制成供试品溶液，测定并计算加样回收率，结果大黄酸平均回收率为98.37%（n=6），RSD=0.98%；大黄素甲醚平均回收率为98.1%（n=6），RSD=0.99%。
2.2.2.10样品含量测定 精密称取三批中试样品（批号：20130921、20130923、20130925）2.5 g，平行三份，按照上述制备供试品溶液的方法制备，测定峰面积，并计算每克凝胶中含有大黄酸和大黄素甲醚的量，结果见表2。
由表2可得，妇舒保凝胶中每1 g凝胶所含大黄酸和大黄素甲醚的含量分别不得低于0.0222 mg和0.0199 mg（以含量测定结果的80%作为下限）。
3 讨论
本方为黄柏、大黄等10味中药组成的复方制剂，其中黄柏和大黄为方中的君药，黄柏的主要活性成分以具有显著的抗菌消炎作用盐酸小檗碱为主；蒽醌类是大黄的主要活性成分，药理研究表明游离蒽醌类具有明显的抗菌消炎作用。故在含量测定部分，选择了黄柏中的盐酸小檗碱以及大黄中的大黄酸和大黄素甲醚等游离蒽醌类为指标成分[13-16]。
本实验建立了妇舒保凝胶中黄柏、苦参、大黄3味药材的TLC方法，专属性强，重现性好，并且建立了君药中盐酸小檗碱、大黄酸和大黄素甲醚的含量测定HPLC法，规定了妇舒保凝胶中每1 g凝胶所含盐酸小檗碱、大黄酸、大黄素甲醚的含量分别不得低于6.967、0.0222、0.0199 mg。本试验初步建立了妇舒保凝胶质量标准草案。
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关键字 蛋白质组；蛋白质组学；研究技术；分离技术
中图分类号 Q-0 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2013）107-0135-02
0 引言
近几年基因组学的不断发展与壮大，推动了生物学技术的快速发展，使得我国在生物技术方面的研究走向成熟，大部分的病毒和原核生物等简单生物的基因组工作已经完成，而且高等生物的基因组工作也取得了很大的进步，人类的基因组研究已经顺利完成。随着科技的不断发展，在生物学界产生了许多新的技术，新的基因组研究手段与方法，可以实现对数以万计的基因表达进行检测。但是，这仅仅在生物功能的静态分析上取得了很大的进步，却依然不能达到对基因组学研究的目的。正因如此，越来越多的专家将研究矛头指向了蛋白质组的研究。只有研究基因编码和翻译的蛋白质，才能真正的了解到生物的活动特征。
1 蛋白质组概念和蛋白质组学研究的范围
在20世纪90年代根据蛋白质和基因组的技术提出了蛋白质组的概念，蛋白质组指的是一组基因或者细胞所有的蛋白质表达的情况，与基因组类似，但是与基因组不同的是，蛋白质组更注重于对研究体代谢的一系列动态过程进行研究。从蛋白质组的名称上可以了解到，蛋白质组不是针对于单一的蛋白质进行研究，而是把一组蛋白质的整体作为研究对象，最后分析出每个蛋白质的表达信息。蛋白质组学是由于蛋白质组的出现而兴起的一门生物技术学科，蛋白质组学，即一个基因组，一个细胞或组织，一种生物在一定时间，一定条件下所表达的全部蛋白组成，存在形式，活动方式及时空动态。目前蛋白质组学主要研究生理、病理或不同发育阶段下蛋白质的表达情况，对表达存在差异的蛋白质进行进一步研究，分析蛋白质之间的相互作用，蛋白质的组成结构，以及蛋白质的翻译和定位情况等。
2 蛋白质组研究的主流技术
蛋白质组研究的进展与蛋白质组研究技术的发展是不可分开的，二者之间起到相互促进的作用。随着科学的进步，对于使用生物技术进行研究的结果要求越来越高，对数据要求也越来越精确，所以蛋白质组研究的技术也在不断创新与更新，目前针对于蛋白质的分离来说，蛋白质组研究的主流技术包括双向凝胶电泳技术、差异凝胶电泳技术、质谱技术以及多维液相色谱技术等。
2.1双向凝胶电泳技术
传统的双向凝胶电泳技术由1975年建立，采用双向凝胶电泳技术进行蛋白质组分离大大的提高了分辨率，因此，在蛋白质组研究技术中一直被广泛采用。其产生双向的原理是：第一向为等电聚焦，使得带有不同电荷量的蛋白质产生电泳分离，第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使得具有不同分子量的蛋白质产生电泳分离。
随着技术的提高，双向凝胶电泳技术也进行了完善，目前所使用的双向凝胶电泳技术中第一向利用固相pH梯度等电聚焦电泳技术来达到蛋白质组分离的效果，这样可以在保证在高分辨率的前提下，提高重复性，而且可以获得蛋白质具有的分子量多少以及其等电点信息，但是，这种方法难以实现对于极大蛋白质、极小蛋白质、极碱性蛋白质和疏水性蛋白质进行有效分离分析与研究。
2.2差异凝胶电泳技术
差异凝胶电泳技术是在双向凝胶电泳技术上发展起来的，差异凝胶电泳技术在一定程度上弥补了双向凝胶电泳技术的不足，不但提高了蛋白质组的分离效率，而且降低了劳动强度，最重要的是提高了电泳的灵敏程度。差异凝胶电泳技术的原理是对两份不同的蛋白质组研究样品做不同的标记，然后放在同一环境下进行凝胶电泳，可以直观的观察到正常的基因组和癌变的基因组的凝胶电泳结果的区别，继而可以对两种不同的蛋白质表达结果进行进一步分析与研究。
2.3质谱技术
采用质谱技术对蛋白质组进行分离的原理是：首先将蛋白质组研究样品的分子进行离子化，然后根据不同离子的质荷比不同来确定其分子量，最后实现对其进行分离。在进行蛋白质组样品分子进行离子化的时候，需要保证分子的完整性，尽量不要形成碎片离子。质谱技术通过与其他高端技术的配合，可以实现对多肽的序列进行测量。
2.4多维液相色谱技术
多维液相色谱技术是蛋白质组研究过程中最常用的色谱分离技术之一，主要是通过多种色谱分离技术的联合使用来达到多维的效果，由于科学技术的更新速度比较快，而且生物技术研究的数据量越来越多，蛋白质组研究的样品复杂程度越来越高，所以实现蛋白质组自动化分离成为必然趋势，目前，蛋白质组自动化分离系统已经形成，就是将多维液相色谱技术与串联质谱技术联合使用便可以达到快速、高效、精确的蛋白质组自动化分离。但是，这种蛋白质组分离技术依然存在一定的不足，譬如，不能实现将分子量过小的蛋白质进行分离以及不能对蛋白质的差异表达进行分析等。
3 蛋白质组生物信息学
近几年来，蛋白质组研究技术已经得到了生物信息学的高度重视，甚至大部分国家政府已经大力支持蛋白质组的研究，蛋白质组的研究为生物学和医学做出了很大的贡献，蛋白质组研究技术的发展推动了我国生物学与医学的快速发展，同时生物信息学的发展也为蛋白质组的研究工作提供有力的保证，生物信息学是在生命科学、计算机技术与严密、精确的数学科学计算上发展的交叉型学科，通过对生命科学样本的研究，以及运用数学分析与计算，利用计算机技术手段实现将得到的数据和结论信息进行收集、加工和存储。
4 结论
由于生物学科学技术的提高，蛋白质组学得到了广泛的重视，同时也受到了许多政府的大力支持，成为了基因组计划研究的核心，蛋白质领域的建立为生物学家进行蛋白质结构的研究提供了新的角度与新的研究理念。蛋白质组技术的发展，对一些细菌蛋白质的研究和对分析疾病的产生原因与治疗起着深远的影响与重要的意义。
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摘要:目的 研究吡喹酮水凝胶栓剂经直肠给药后在家兔体内的药动学及相对生物利用度。方法 取家兔12只,随机分为口服给药组和直肠给药组二组,给药后采用HPLC法测定血药浓度。 结果 经3p97药动学程序处理吡喹酮水凝胶栓剂经直肠给药的药-时数据符合一房室开放药代动力学模型,其相对生物利用度为173.2%。 结论 吡喹酮水凝胶栓剂的生物利用度是口服给药的1.7倍,具有一定的开发价值。
关键词:吡喹酮水凝胶栓剂;高效液相色谱法;药动学;生物利用度
吡喹酮(praziquantel,PZQ)是人工合成的吡嗪异喹啉衍生物,为一种高效、广谱的抗血吸虫和抗绦虫药。目前临床应用的吡
喹酮制剂主要是片剂和胶囊,但口服用药首过效应大,生物利用度低,使用受到一定限制。温敏水凝胶是一种智能高分子材料,能随环境温度的变化发生可逆性的膨胀-收缩,高温收缩型水凝胶在温度低于低温临界溶解温度(lower critical solution temperature,LCST)时,凝胶在水中形成良好的水化状态,温度升高,凝胶脱水收缩[1-3],利用此性质可以控制药物的释放。经查阅国内外有关文献,未见有吡喹酮水凝胶栓剂的报道,本文采用泊洛沙姆P407/P188[4-5]制备了吡喹酮水凝胶栓剂,并采用HPLC法[6]检测其经直肠给药后家兔体内的血药浓度、药动学和生物利用度。
1 仪器、试药与实验动物
1.1 仪器与试药
美国Agilent公司1100高效液相色谱仪,DAD检测器,色谱柱ZORBAx SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),BF―2000氮气吹干仪(上海八方世纪科技有限公司)。吡喹酮原料药(上海菱玉贸易有限公司,9917%,批号0410031);吡喹酮标准品(中国药品生物制品检定所);吡喹酮水凝胶栓剂(2%,本室研制);地西泮对照品 (中国药品生物制品检定所提供);泊洛沙姆(德国,BASF公司提供);乙腈、甲醇均为色谱纯;其他试剂均为分析纯。
1.2 实验动物
大白兔(由武汉大学医学院实验动物中心提供),体质量(2.1±0.3) kg,雌雄各半。
2 实验方法及结果 1 色谱条件
色谱柱ZORBAxSB C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) ,Agilent色谱工作站,DAD检测器; 流动相: 乙腈水(体积比70∶30);内标: 地西泮;检测波长:220 nm;灵敏度:0.02AUFS;流速:1.00 mL?min-1;纸速:0.25 cm?min-1。 2 标准溶液的制备
精密称取干燥至恒重的吡喹酮5.0 mg于100 mL量瓶中,加流动相溶解后用流动相稀释配成5 μg?mL-1的标准液。精密称取干燥至恒重的地西泮5.0 mg于100 mL量瓶中,加流动相溶解后用流动相稀释配成0.5 μg?mL-1的内标液。 3 血浆的处理
取空白血浆2份,各0.5 mL,置于10 mL具塞离心管中,其中1份加入适量吡喹酮标准液和20 μL内标液;各加入醋酸乙酯3 mL提取,振荡2 min,以3 000 r/min离心,取有机层经氮气吹干,残留物用100 μL流动相溶解,取20 μL进样。药物及内标物的保留时间分别为4.17和5.06 min,见图1。 4 标准曲线的制备
取空白血浆0.5 mL,分别置于6只10 mL具塞离心管中,加入不同量吡喹酮标准液和内标液20 μL,配成每1 mL含吡喹酮0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg的溶液,按“2.3”项下,以吡喹酮与内标峰面积比值(A)对吡喹酮质量浓度(ρ)作线性回归,得标准曲线方程:A=-6.214 7+11.579 4ρ(r=0.997 3),最低检测浓度(S/N≥3)为0.05 μg?mL-1。
2.5 回收率测定
取空白血浆精密加入已知量的吡喹酮,然后按“23”项下操作,测得吡喹酮与内标峰面积比值,代入标准曲线求出各样品的浓度,将求得的浓度与已知加入的浓度相比,计算相对回收率,结果见表1。表1 回收率试验结果(略) 6 精密度测定
取空白血浆,精密加入低、中、高3种浓度的吡喹酮,按“2.3”项下操作,进行日内和日间精密度考察,日内各浓度测定5次,连续测定5天,计算日内、日间精密度结果见表2。表2 精密度试验结果(略) 7 血药浓度的测定
取雌、雄各半的健康家兔12只,禁食24 h,分为2组,每组6只。口服给药组以配制的2%ρ吡喹酮CMC-Na混悬液灌胃给药。直肠给药组以吡喹酮水凝胶栓剂经直肠给药,封闭肛门以免溢出。两组给药剂量均为40 mg/kg。给药后,于0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10 h自耳缘静脉采血2 mL。血液用肝素抗凝,离心10 min(3500 r/min)分离血浆。然后按“2.3”项下操作制备血样,进样20 μL进行含量测定,药时曲线见图2。 8 药动学分析
利用3p97药代统计数据包对药时曲线进行不同的代谢模型拟合,直肠给药和口服给药均与一房室模型较为接近。分别对两组家兔的药代动力学参数进行计算,结果见表3。表3 药物动力学参数(略)
3 讨 论 1 将吡喹酮作为治疗药物,以高温收缩型水凝胶为载体,制备得吡喹酮水凝胶栓剂。其具有以下优点:在体外呈凝胶,在体温下很快胶凝;易于从肛门给药而无异物感,从而提高患者用药顺应性;对直肠有生物黏附性,给药约数分钟后即凝固成固体,不易遗漏;无首过效应,可大大提高其生物利用度;同时可减少对胃肠道刺激,降低不良反应的发生率。 2 从表3可知,直肠给药组的吸收速率常数Ka为2.598 h-1,其最高血药浓度Cmax为3.1073 μg?mL-1,达峰时间Tmax为3.078 h;口服给药组吸收速率常数Ka为1.278 h-1,其最高血药浓度Cmax为1.7258 μg?mL-1,达峰时间Tmax为2.146 h。这表明吡喹酮水凝胶栓剂的吸收优于吡喹酮溶液;由于吡喹酮水凝胶栓剂处方中加入生物黏附剂,当直肠给药时栓剂不向前滑动,药物不会经直肠上端静脉吸收入肝门静脉而被破坏,而经直肠下端静脉充分吸收后直接进入大循环,减少了药物的首过作用而提高了生物利用度[7],其相对生物利用度为173.2%,是口服给药组的1.7倍。
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关键词：纳米复合水凝胶；紫外辐射；纳米Ag；平衡溶胀率
中图分类号：TQ427. 1文献标志码：A文章编号：1672-1098（2016）01-0006-07
Abstract：In order to study the effect of the content of Ag particles on the swelling ratio， temperature response and pH response of Ag/P （DMAEMA-co-AMPS） nanocomposite hydrogels， Ag/P （DMAEMA-co-AMPS） nanocomposite hydrogels were successfully prepared by UV irradiation. The structure， morphology and interfacial interactions of the composite hydrogels were characterized by using the Fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR）， X ray diffraction （XRD）， scanning electron microscopy （SEM）， transmission electron microscopy （TEM） and X ray photoelectron spectroscopy （XPS） and other analytical tools. The results showed that the cubic structure of Ag nanoparticles is evenly distributed in the three-dimensional network structure of the hydrogel. Ag nanoparticles are basically spherical， and the particle size distribution is narrow and the average particle size is about 4 nm. There is a strong coordination interaction between Ag nanoparticles and polymer matrix. Compared with the P （DMAEMA-co-AMPS） hydrogel， the equilibrium swelling ratio of Ag/P （DMAEMA-co-AMPS） nano composite hydrogel decreased from 171.6% to 41.49%， and the swelling rate also decreased significantly. In addition， the equilibrium swelling ratio change of Ag/P （DMAEMA-co-AMPS） nanocomposite hydrogels was also explained by the change of the content of Ag nanoparticles. Ag/P （DMAEMA-co-AMPS） nano composite hydrogel can control the temperature and pH sensitivity， which can maintain a higher equilibrium swelling ratio and a higher temperature response. In the pH range （pH= 12 ～ 2）， it can maintain a higher equilibrium swelling ratio， and the maximum equilibrium swelling ratio is 350%.
Key words：nanocomposite hydrogels； UV irradiation； nano-Ag； equilibrium swelling ratio
水凝胶是一类由亲水性聚合物交联形成的三维网络，含有大量水，可在水中溶胀但不溶解[1]。环境敏感性水凝胶是一类随温度、pH、离子强度、电场、磁场等外界信号的变化，其体积、吸水率和弯曲程度等发生显著变化的智能水凝胶，其中温度和pH敏感性水凝胶研究较多[2-3]。尤其，近年来随着工业、农业领域对水凝胶温度响应要求的提高，开发一类具有高吸水率和较高的低临界溶解温度（LCST）的水凝胶成为目前的一个研究热点[4]。
聚甲基丙烯酸-N，N’-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）的分子结构中同时含有亲水和疏水基团，且两类基团在空间结构上互相匹配，使其具有温度和pH双重敏感性，LCST约为50 ℃[5-6]。一般来讲，水凝胶的LCST 与分子链中疏水基与亲水基的种类及比例密切相关，凝胶分子链中亲水基所占比例越大，则水凝胶的LCST越高[7]。因此，为进一步提高PDMAEMA水凝胶的LCST，将亲水性单体2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸（AMPS）与DMAEMA共聚制备P（DMAEMA-co-AMPS）水凝胶。
金属银（Ag）纳米粒子由于其特殊的电子结构和巨大的比表面积使得它在催化、生物标记、抗菌等领域有着重要的应用[8-10]。因此，将纳米Ag粒子引入聚合物水凝胶网络中，有望制备一类功能纳米复合水凝胶材料。然而，目前Ag/聚合物纳米复合水凝胶的化学合成过程存在步骤繁琐、Ag纳米粒子在水凝胶基体中分布不均匀和杂质难处理等问题[11-13]。因此，探索一种绿色、简易的方法制备纳米Ag/聚合物复合水凝胶成为目前的一个重要研究方向。辐射法可以克服传统化学合成方法的不足，但γ射线存在调控难、辐射强度过高的问题，而紫外辐射具有设备简单，操纵方便和辐射强度容易调控等特点[14-15]。因此，本文运用紫外辐射方法制备纳米Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）复合水凝胶，研究纳米Ag对水凝胶的形貌、溶胀性能、温度和pH响应性能的影响。
1实验部分
11试剂
甲基丙烯酸-N，N’-二甲胺基乙酯（DMAEMA）、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸（AMPS）、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）和四甲基乙二胺（TEMED），AR，上海晶纯试剂有限公司；过硫酸钾（KPS）和聚乙二醇（PEG，Mw=400 g/mol），AR，无锡市亚盛化工有限公司；硝酸银（AgNO3），AR，上海申博化工有限公司。
12复合水凝胶的合成
P（DMAEMA-co-AMPS）水凝胶的制备：首先将等物质的量比的单体DMAEMA和AMPS溶解于20 mL去离子水中，然后加入占单体质量为05%的交联剂BIS、占单体质量为1%的引发体系（KPS+TEMED）（质量百分数，以单体总质量为基准）和占单体物质的量为20%的致孔剂PEG（物质的量百分数，以单体总物质的量为基准），搅拌均匀后，在N2气氛保护下，置于UV125A紫外光固化机（辐照强度为400 mW/cm2，输出功率为2 000 W）下进行紫外光辐照反应10 min。聚合反应完成后，将合成的水凝胶，加入大量去离子水中浸泡，每隔5 h 换一次水，重复进行20次，以除去未反应的小分子物质和残留的致孔剂PEG。然后，将水凝胶切成体积为（1 cm×1 cm×1 cm）的小块，进行冷冻干燥，干燥结束后密封保存在冰箱中。
纳米Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）复合水凝胶的制备：制备方法与P（DMAEMA-co-AMPS）水凝胶类似，只是将等物质的量比的单体DMAEMA和AMPS改为等物质的量比的DMAEMA、AMPS和AgNO3。
13表征及性能测试
1） 水凝胶的结构和形貌表征。利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）表征复合水凝胶的微观形貌：将达到溶胀平衡的水凝胶样品置于液氮中快速冷冻，然后迅速置于冷冻干燥箱中，调节冷冻速率为02 ℃/min，冷冻至-20 ℃，然后以同样速率解冻至20 ℃。小心折断干燥后的凝胶样品，对断面进行喷金处理，由S-3000N扫描电子显微镜（日本日立公司）观察水凝胶试样的断面形貌。通过超声作用将冷冻干燥后的水凝胶试样均匀分散在丙酮溶剂中，取一滴分散液滴在48×10-2 mm规格的铜网上， 待其干燥后选取合适区域利用JEOL-2010型高分辨透射电子显微镜（日本电子株式会社）拍摄照片。复合水凝胶的物相使用DX-2000型X射线衍射仪（XRD）表征（丹东方圆仪器有限公司）。辐射源为Cu靶Kα线，波长λ=0154 18 nm，扫描范围：10°～ 80°，扫描速率：5 °/min。采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征复合水凝胶的化学组成：将冷冻干燥后的水凝胶样品与KBr混合研磨、压片，在NICOLET 380型傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Electron公司）上进行测试，波长扫描范围为400～4 000 cm-1，分辨率为2 cm-1。复合水凝胶中Ag纳米粒子与聚合物基体的相互作用可以利用X射线光电子能谱仪（XPS）进行表征：以单色化的Al-Kα为X射线激发源，电子结合能扫描范围：0～1 000 eV，在高纯氮气气氛下测试。
2） 水凝胶的溶胀性能测定。将冷冻干燥的水凝胶称重后，放入温度为25 ℃的去离子水中，每隔一定的时间取出，用滤布滤掉水凝胶表面的水份，称重，再按式（1）计算溶胀率（swelling ratio，SR）[16]：
SR=Wt-WdWd（1）
式中：Wt为t时刻溶胀水凝胶的质量；Wd为干凝胶的质量。
3） 水凝胶溶胀性能的温度响应性测定。将冷冻干燥的水凝胶浸泡于去离子水中，置于恒温水浴中，调节温度以30 ℃为起点，升温速率为5 ℃/min，直至水凝胶的质量基本保持恒定，按式（2）计算水凝胶在不同温度下的平衡溶胀率（equilibrium swelling ratio，ESR）[17]：
ESR=WsWd（2）
式中：Ws为溶胀达平衡后的水凝胶质量；Wd为干凝胶的质量。
4） 水凝胶溶胀性能的pH响应性测定。将冷冻干燥的水凝胶浸泡于不同pH值的水溶液中，置于恒温水浴中，调节温度至25 ℃，浸泡12 h至水凝胶的质量基本保持恒定，按式（2）测定不同pH下水凝胶的平衡溶胀率。
2结果与讨论
21形貌表征
P（DMAEMA-co-AMPS）水凝胶呈三维大孔网络结构，孔径分布范围：20 ～ 80 μm，结构较规整。如图1a所示Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）复合水凝胶的三维网络结构中分布着一定数目的Ag粒子，然而，孔结构和尺寸分布不均一（见图1b）。（a） P（DMAEMA-co-AMPS）（b） Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）
图1复合水凝胶的SEM照片由于Ag原子核对电子射线具有散射作用，因此，Ag在TEM照片上呈黑色（见图2）。Ag纳米粒子在聚合物基体中分散良好，基本呈球形，粒径分布较窄，平均粒径约为4 nm。原因推测是：Ag+可以与水凝胶网络分子链上酰胺基中的氧和氮原子通过静电吸引作用结合，形成O-Ag+型和N-Ag+型配位键，使得Ag+均匀地固定和分布在水凝胶三维网络中[18]。因此，在紫外辐照引发单体聚合的同时，聚合物基体中形成均匀分布的Ag纳米粒子。
纳米Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）复合水凝胶的XRD谱图如图3所示，在2θ=3832°、4423°、6448°、7748°处出现四个明显的特征衍射峰，对照标准卡片（PDF No.65-2871），可以分别将其归属于 （111）、（200）、（220）、（311） 晶面，对应立方晶系结构的Ag。此外，四个特征衍射峰均较尖锐，表明紫外辐射还原AgNO3制备的Ag单质的结晶度较高。
2θ/（°）
水凝胶的XRD谱图
23FT-IR谱图
采用FT-IR表征P（DMAEMA-co-AMPS）水凝胶后可知，在波数为2 924 cm-1附近的3个峰为C-H的伸缩振动峰；在1 731 cm-1及1 162 cm-1处出现了酯基的吸收峰，分别对应C=O的伸缩振动峰和C-O的伸缩振动峰；1 640 cm-1为仲酰胺C=O的伸缩振动峰，1 554 cm-1是仲酰胺N-H的弯曲振动峰，1 468 cm-1是-CH2-中C-H的弯曲振动峰，在1 390 cm-1附近出现了叔胺基吸收峰；1 188 cm-1是酰胺中C-N伸缩振动峰，1 162 cm-1为S=O对称伸缩振动峰（见图4a线）。
Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）复合水凝胶的特征吸收峰的位置基本和图4a线一致，但与图4a线比较发现，仲酰胺C=O的伸缩振动峰和酰胺基中C-N伸缩振动峰的位置分别蓝移了7 cm-1和19 cm-1（见图4b线）。原因为：纳米Ag粒子与聚合物分子链上酰胺基中氧原子和氮原子存在配位作用，使得纳米Ag中的电子向酰胺基发生转移，导致振动吸收峰发生蓝移。
σ/cm-1
（a） P（DMAEMA-co-AMPS）；
（b） Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）
Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）纳米复合水凝胶中Ag纳米粒子与聚合物基体的相互作用可以通过XPS谱图进行表征（见图5），含有C、N、O、S和Ag等元素，与Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）纳米复合水凝胶的元素组成基本一致（见图5a）。由图5b可知，37513 eV和36913 eV分别为Ag3d3/2和Ag3d5/2的能谱峰，比标准的Ag3d3/2和Ag3d5/2的能谱峰（3739 eV和3679 eV）[19]，均增加了123 eV，向高结合能方向移动，表明Ag的化学环境发生变化，Ag原子失去电子，价电子的电子云密度减小，内层电子屏蔽效应变弱，使得内层电子的结合能变大[20]。通过与其相应的标准结合能对照，仅有酰胺基中羰基氧的结合能降低101 eV，其余基团的O1s的电子结合能变化均不明显（见图5c）。在图5d 中，酰胺基中氮原子的结合能谱的峰值为39938 eV， 比标准的酰胺基N1s的能谱峰（3998 eV）低042 eV。叔胺基中氮原子的N1s的结合能为40238 eV，与标准结合能一致。 基体中的酰胺基上的氧、 氮原子结合能都降低， 由此推断， Ag纳米粒子与酰胺基中的氧原子、氮原子之间存在配位作用， 酰胺基中的氧、 氮原子得到银原子的电子， 形成O-Ag+和N-Ag+型配位键， 与FT-IR谱图结果一致。结合能/eV结合能/eV
（a）全谱图（b）Ag3d谱图结合能/eV结合能/eV
（c） O1s谱图 （d） N1s谱图
1. 酰胺基中羰基氧原子的O1s结合能谱1. 酰胺基中氮原子的结合能谱
2. 磺酸基S=O中氧原子的O1s的结合能谱2. 叔胺基中氮原子的N1s的结合能谱
3.-OH中的O1s的结合能谱3. 2种N1s能谱的迭加峰
4. 脂肪链中羰基氧原子的O1s的结合能谱
5. C-O-C中的O1s的结合能谱
6. 5种O1s能谱的迭加峰
25水凝胶的溶胀性能
P（DMAEMA-co-AMPS）水凝胶和Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）纳米复合水凝胶在pH=7的去离子水中的溶胀率（SR）随时间的变化关系如图6所示，在初期的5 h内，两种水凝胶均迅速达到相对较高的溶胀率，这是由于水凝胶网络结构比较均匀完整，高分子链几乎未松弛，水向凝胶网络扩散速率较快；7 h后，水凝胶的溶胀率随时间增长缓慢，这是由于水分子扩散到一定程度，交联点之间的分子链伸展降低了它的构象熵值，分子网络的弹性收缩力使网络收缩，当这两个相反的趋势抵消时，水凝胶于8 h时达到溶胀平衡。随后，两种水凝胶的溶胀率均随时间增加而基本保持不变。
此外，较P（DMAEMA-co-AMPS）水凝胶而言，Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）纳米复合水凝胶的平衡溶胀率由17169%降至4149%，而且溶胀速率也明显减小。原因是：Ag纳米粒子和聚合物基体之间存在较强的相互作用，使得水凝胶的交联度增加，因此，Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）纳米复合水凝胶的平衡溶胀率和溶胀速率均明显降低。
不同Ag粒子含量的Ag/P（DMAEMA-g-AMPS）纳米复合水凝胶的平衡溶胀率（ESR）随温度的变化如图7所示。
t/℃
曲线1～4∶单体比n（DMAEMA）：n（AMPS）=3∶1，而添加AgNO3的物质的量分别占单体总物质的量的0%、1%、5%和10%。
从图7中可以看出，曲线2的平衡溶胀率明显高于曲线1（P（DMAEMA-g-AMPS）水凝胶），然而随添加AgNO3的物质的量的进一步增加，复合水凝胶的平衡溶胀率明显下降。原因是：当少量Ag粒子存在时，Ag粒子与高分子链中的酰胺基之间存在配位作用，使得高分子链难以松弛，导致溶胀率增加。但是，随着Ag粒子的不断增多，Ag粒子成为交联点，增加交联密度，导致溶胀率下降，同时使得复合水凝胶的温度响应性能减弱。因此，当AgNO3的物质的量占单体总物质的量的为1%时，复合水凝胶既能保持较高的平衡溶胀率，又具有较高的温度响应性。
27Ag粒子含量对水凝胶pH响应性的影响
不同Ag粒子含量的Ag/P（DMAEMA-g-AMPS）纳米复合水凝胶的平衡溶胀率（ESR）随pH的变化如图8所示，四条曲线的ESR均分别在pH≈4和10处达到极大值，且复合水凝胶的最大ESR值随Ag粒子含量的增加而增大，在低pH范围内表现更为明显。这是由于复合水凝胶的分子链中同时含有-NH和-SO3H，在酸性环境（低pH）中-NH发生质子化，在碱性环境（高pH）中-SO3H发生解离，因此平衡溶胀率曲线呈现两个极大值点。Ag粒子越多，与酰胺基的配位作用越强，使得高分子链更加难以松弛，导致溶胀率增加。总体来说，当AgNO3的物质的量占单体总物质的量的为10%时， 复合水凝胶在宽的pH范围内（pH=2～12）均能保持较高的平衡溶胀率，且最大平衡溶胀率约为350%。
通过绿色、简单的紫外辐射法制备了Ag/P（DMAEMA-co-AMPS） 纳米复合水凝胶。SEM、XRD和FT-IR结果表明，立方晶系结构的Ag纳米粒子分布在水凝胶三维网络结构中；TEM照片结果表明，Ag纳米粒子基本呈球形，粒径分布较窄，平均粒径约为4 nm；XPS 结果表明，Ag纳米粒子与聚合物分子链中酰胺基之间存在较强的配位作用。Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）纳米复合水凝胶的平衡溶胀率和溶胀速率较P（DMAEMA-co-AMPS）水凝胶均明显降低。此外，发现Ag/P（DMAEMA-co-AMPS）纳米复合水凝胶的温度及pH敏感性，可以通过改变Ag纳米粒子的含量进行调控。
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（责任编辑：何学华，吴晓红）第1期汪 健，等：鄂尔多斯盆地早奥陶世碳酸盐岩有机质研究安徽理工大学学报（自然科学版）第36卷第36卷第1期安徽理工大学学报（自然科学版）Vol.36No.1