时间：2023-10-04 22:57:08
【关键词】凝胶色谱法；头孢菌素类药物；高分子杂质；测定方法
从现如今我国医药临床研究中可以看出，有些药物对人体会造成一定的过敏性，这和药物中的高分子杂质的含量之间存在着必然的联系。从实际的判断中可以看出，要想保证药品的安全性，药物研究人员应该对高分子杂质的数量进行控制，减少其对人体健康的威胁。为了保证药物的整体质量。工作人员需要对纯度进行测定。工作人员所采用的测定方式就是凝胶色谱法。
一、实验过程中的注意事项
研究人员在对头孢菌素类药物进行测定的过程中，主要采用的是凝胶色谱法。在测定的过程中要经过严格地检定。保证实验操作的规范性和科学性，这样才能够提升测量结果的精准度。
1、仪器准备
在实验进行之前，做好准备阶段的工作至关重要，在检测之前，工作人员要对实验仪器和设备等进行检测，包括每一个检测单元、输液单元。在检测之后需要做好记录。进行这一环节主要是为了有效的满足紫外检测工作基本要求，提升输液单位的流速，进而在检测的过程中发出相对比较科学的模拟信号。在设备和系统使用的过程中，工作人员主要涉及到液相色谱仪，保证检测的精准度是至关重要的。只有做好定期的检定工作，才能提升实验结果的高效性
2、凝胶色谱柱准备
研究人员在选择色谱柱的过程中，需要将仪器设备的耗能量，溶解能力等方面列入到检测工作的行列中。一般情况下，胶凝色谱柱的体积明显低于柱床的体积。为了满足这一要求，头孢菌素的抗生素高分子杂质所在柱床的体积要达到60ml以上。
3、玻璃柱管的分端凝胶介质的选取
一般来说，在玻璃柱管的分端上会存在着一个玻璃棉在其顶端。如果条件不允许的话可以采用过滤板或者是可以调节的商品玻璃珠管。采用这种方式的过程中，凝胶类型有很多种。其中数量较多的就是采用葡聚糖凝胶。在使用的过程中，工作人员需要做好溶胀工作。根据凝胶柱的体积来计算其余的用量。经过蒸馏水泡过之后，玻璃柱管可以长时间的放置。只需要在热水中煮沸，就可以保证其充分溶胀。需要注意的是，这两种不同的溶胀方式应该将气泡挤压出去，实现真空脱气。
4、装柱
如果凝胶介质经过了充分的溶胀，就需要用蒸馏水来对其悬浮，去除其中的杂质。按照这种方式进行洗涤，直到表面上层的溶液达到澄清状态。通过具体的实践可以看出，凝胶介质可以用水来配置悬浆，然后将其倒入玻璃柱中，直到其完成沉降滞后就可以实现装柱。不仅如此，垂直放置的玻璃珠管应该保持顺畅，在其中加入一定量的凝胶悬浆，可以促进凝胶颗粒沉降的科学性。同时还应该让漏斗保持凝胶悬浆，这种方式在应用等等过程中，装柱之间明显增强，在需要的时候可以采用增加负压的方式来提升装柱时间。
二、系统适用性实验
在实验的过程中，采用系统适用性实验不仅可以提升溶液制备工作的高效性，还可以促进其可操作性。溶液的配置所采用的方式比较简单，主要是实现主成分和杂质的混合配置。
但还是会使得有些杂质对照品不能得到，如性质不稳定或分离提取技术要求太高等，但这些杂质峰恰恰又是与主成分峰最难分离的色谱峰。系统适用性试验目前包括很多内容，主要考察对照品测定系统与高分子杂质测定系统中蓝色葡聚糖2000溶液峰的保留时间的比值，以及理论板数和拖尾因子，以此来控制对照品测定与高分子杂质测定时仪器状态的同一性。
三、操作方法上的注意事项
1、样品溶液及对照溶液的制备
具体操作中必须要按规定的标准来配制样品溶液，由于某些高浓度抗生素溶液具有一定的不稳定性，所以通常对样品溶液采取即溶即进的形式。对照溶液的制备上，要注意头孢菌高分子杂质的含量测定，通常以样品自身在SDS水溶液或纯水中的缔合物作为对照进行定量。在制备缔合物时特别要注意对浓度及水的纯度的控制，以此来保证缔合完全。
2、进样及进样方式
一般在对头孢菌素高分子杂质含量进行测定时，通常需要不同状态的流动相，选择出合适的对照溶液进行进样。因此，只有事先将流动相更换之后，才能充分保证凝胶色谱柱的平衡性。并且，笔者建议尽量采用凝胶色谱仪自动进样方式，或是在特殊情况下，选择手动进样。然而，无论是任何一种进样方式，在实验中，都必须保证色谱柱端无缝隙处，从而避免样品扩散，影响分离效果。另外，在对头孢菌素高分子进行自动取样的过程中，也要切实遵守相关的液相色谱操作规程。
3、凝胶面的平整
如果选择了手动进样方式，就一定要保证凝胶表面的平整性和完整性。并在进样之前，事先使用滴管吸取掉凝胶表面积压的液体，确保色谱柱下端能够顺利流通，直到色谱柱内的溶液流降到凝表面时，我们才可以应用相应的定量器具，对样品溶液进行精密的量取。之后，我们还需要将样品溶液滴加到色谱柱的凝胶表面中，同时还要对色谱柱管内壁上残留的样品溶液进行清洗。最后，也是最重要的一个实验环节，相关实验人员要在色谱柱顶端缓慢注入适量的流动相，认真做好进样时间的记录工作。
4、记录对照及结果
要分别记录样品和对照溶液的色谱图，积分对照溶液的峰面积和样品溶液中处于外水体积的高聚物杂质面积，按外标法以峰面积计算样品中高分子杂质的含量。按平行实验的平均值作为样品中高分子杂质含量的最终结果，并与标准规定限度比较后作出是否符合规定的判断。
5、样量分析
在一般高效液相色谱仪上使用凝胶柱，应严格限制泵压。由于一般高压液相色谱管路和检测器通路狭窄，极易发生堵塞，所以要注意尽量减少将出柱液连接到检测器的时间，尤其是新填充的色谱柱更应经水或流动相充分平衡后再连接到检测器。
四、结束语
通过实验结果表明，大部分抗生素药物中的高分子杂质已经超出了药物本身的杂质，严重影响了药物质量，残留了部分污染物质，再加之抗生素在贮存过程中，其分子很容易发生聚合反应，最终产生大量的聚合物杂质，大大降低了药品的纯度。因此，采用高效的凝胶色谱法对头孢菌素中的高分子杂质含量的测量是非常至关重要的，操作人员必须严格遵守相应的检测要求，加强对凝胶色谱法的合理运用及改进，进一步提高头孢菌素类型药物的质量和纯度，从而达到理想的治疗效果。■
参考文献
[1]乔海灵，赵永星，马统勋.青霉素类抗生素过敏反应机制及诊断的新近研究进展[J].国外医药（抗生素分册）.2012（05）
[2]顾立素，胡昌勤，金少鸿.安美汀中高分子杂质的分离分析与质量控制[J].药物分析杂志.2011（01）
[关键词]植物油 猪肉 农药残留 在线凝胶渗透色谱-串联气质联用法
中图分类号：O657.63 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）08-0331-02
作为人们日常生活的必需品，植物油与猪肉是否安全与人们的身体健康有着直接的关系，其中植物油与猪肉的农药残留量是影响其质量安全的主要因素之一，因此全球对于植物油与猪肉农药残留的最大残留量作出了严格的规定。但是植物油与猪肉含有较高含量的油脂，这对农药残留的测定造成了很大的干扰，并且对检测仪器有很强的污染，因此需要在农药残留前将油脂除去。
常用的除油方法包括了固相萃取、液液分离、固相微萃取等方法，但是这些方法的操作相对复杂，只能对农药进行选择性的萃取。目前GPC凝胶渗透色谱已运用到了多种样品的处理，能够有效地去除干扰油脂与色素，但常规GPC属于离线处理，速度较慢，操作复杂，还需要使用大量的有机溶剂，因此应用存在一定的限制。新型的在线凝胶渗透色谱-串联气质联用法（GPC-GC-MS）则适用于复杂基质的分析，有机溶剂用量不大，能够有效去除干扰、降低噪音并改善色谱，同时也减少了人为误差，使检测具有较高的准确性、重现性。
1 试验材料与方法
1.1 试验设备仪器、试剂
GPC/GCMS-QP2010Plus在线胶渗透色谱-串联气质联用仪、全自动均质仪、台式高速冷冻离心机、往复振荡器、漩涡混合器、0.001g/0.0001g分析天平、PSA粉末、C18粉末、有机滤膜（0.22μm）；试剂：PSA、LC18、Carb/NH2、OasisHLB（各浓度均为500mg/6mL），2000mg/12mL ENVI-18、甲苯、环己烷、丙酮、乙腈、Dr.Ehrestorfer农药标准品。
1.2 标准溶液配制
称取适量农药标准品溶于丙酮，配制成浓度为1000mg/L的标准储备液，并置于冰箱-30℃保存。根据测定的要求，配制标准工作曲线溶液（使用空白样品基质溶液进行配制）。
1.3 样品提取
将猪肉去筋，切成小块，称取待测样品5.000g置于50mL离心管中，然后加入蒸馏水8mL，乙腈10mL，采用全自动均质仪进行提取，1min后加入无水硫酸镁、氯化钠各4g，漩涡混合并振荡，振荡时间为20min。然后进行冷冻离心，14000r/min，5min，取1mL乙腈层用于净化。
1.4 样品净化
植物油净化时在1mL乙腈层内加PSA粉与C18粉各100mg，然后混合1min，并冷冻离心，14000r/min，5min，取上清液在有机过滤膜上过滤，然后采用在线凝胶渗透色谱-串联气质联用法测定。动物组织净化时在1mL乙腈层内加PSA粉与C18粉各150mg，混合1min，并冷冻离心，14000r/min，5min，取上清液在有机过滤膜上过滤，然后采用在线凝胶渗透色谱-串联气质联用法测定。
2 在线凝胶渗透色谱-串联气质联用法测定条件
色谱柱流动相为丙酮：环己烷=3：7，流速0.1mL/min；进样量为10μL；柱温40℃；检验波长为210nm；在线收集时间3.5-5.5min。色谱柱升温程序为，开始温度82℃，5min后按照8℃/min程序升温到300℃并维持7.75min；载气为纯度在99.999%以上的氦气，流速1.75mL/min；采用不分流PTV进样，开始温度120℃，5min后按照100℃/min程序升温到250℃并维持31min。
3 结果
3.1 净化组合选择
为了方便样品净化，本试验采用乙腈进行提取。乙腈提取不仅溶入油脂少，加入水后对样品具有较强的渗透性，样品分散也非常均匀，而加入无水硫酸镁与氯化钠后样品的整个提取状态变得更加均一，有利于后续的净化操作。PSA与C18是两种常用的净化剂，PSA能够有效地去除脂肪酸，而C18去除维生素、甾醇与是色素的效果较好。为了避免净化剂直接加入提取液造成基质干扰物的吸附，降低目标化合物的回收率，因此本试验设计了9组净化剂组合进行提取液净化效果的对比，具体见表1。结果发现，植物油（花生油）在第5组，即加入净化剂PSA与C18各100mg时，净化效果最佳，除杂后的色谱峰形最好，回收率高、稳定，满足仪器分析要求。猪肉样品在第9组，即加入净化剂PSA与C18各150mg时，净化效果最佳。因此对植物油样品净化选择净化剂各100mg，猪肉样品净化选择净化剂150mg。
3.2 基质效应
在进行农药残留测定时，需要考虑到基质效应，由于基质效应对某些待测物的准确定量定性存在严重的影响，因此测定时必须引起注意。基质效应产生原因有很多，比较复杂，因此农药残留测定中很难将其影响从根本上进行消除。相关研究指出可采用基质净化法、空白基质配制标准液和同位素内标法等对基质效应进行清除或者补偿，本试验为了能够对基质效应进行有效的控制，减少对测定的影响，采用的基质配制标准液的方法。
3.3 相关性分析
分别配制55种农药的系列混合标准溶液，浓度依次为0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L和0.20mg/L，绘制标准曲线。通过标准曲线发现，当农药的质量浓度为0.01mg/L≤c≤0.20mg/L时，线性关系较好，相关系数r2均≥0.991，S/N≥10（比信噪比）将55种农药成分测定的低限范围确定在了0.005mg/kg≤LOQ≤0.03 mg/kg。
3.4 样品回收率
本试验中的加标回收率实验采用的是基质匹配标准溶液-外标法，对植物油、猪肉空白样品添加55种农药混合标准液进行回收。加标浓度为0.05mg/kg，共平行处理6份，对样品的回收率与精密度进行分析。结果发现，样品的回收率在55%～125%之间，标准偏差1.8%～8.1%。
4 讨论
农药的作用在于对危害农业、林业的昆虫等进行预防和消灭的一类化学合成物质，种类很多，根据化学组成与结构包括了有机磷、有机氯、氨基甲酸酯以及拟除虫菊酯等等；同时还可按照功能进行分类包括杀虫剂、杀菌剂、杀线虫剂以及除草剂、植物生长调节剂等等。农药的应用能够为粮食增产起到一定的保障作用，尤其我国属于农业大国，每年的病虫害都会对农作物的产量造成严重的影响，农药的使用能够使粮食的损失减少约250亿公斤，因此在增加农作物产量上具有重要的作用。但是农药的使用也为粮食安全、环境污染造成了一定的风险，近年来，农作物的病虫害情况不断加重，因此农药的使用量也在不断的增大，喷施的农药或者环境中农药残留都造成了农作物中农药的残留，由于农药会引发癌症、畸形和突变等，当含有残留农药的农产品被人长期食用，就会在体内造成积累，导致慢性中毒和疾病，并且对下一代造成影响。因此，农药残留受到了全球的高度关注，许多国家也对农药残留最低限量做出了严格的限制。
凝胶渗透色谱法是选择不同孔径多孔凝胶做固定相进行不同大小、形状分子的分离，样品中的色素、油脂等大分子杂质比农药优先分离，而农药分子量一般小于500，该方法常用于农药残留分析的样品净化，净化效果好，并且柱子可重复使用，具有较高的自动化程度。该方法被广泛应用于对脂类、色素等大分子杂质复杂基体的净化与浓缩。而凝胶渗透色谱法也常与GC/MS和LC/MS联用，进而能够实现农药残留的快速分离与分析。色谱法是农药残留检测中最主要的检测方法，包括GC气相色谱、气质联用法、液相色谱法、液质联用法等。采用色谱法进行农药残留分析具有较高的分离效能、选择性与灵敏度，能够快速准确的进行农药的定性与定量分析，该方法较为常用，也是国际公认的一种检测方法。其中气质联用法是能够对复杂的样品进行分析，准确的判定目标化合物。该方法具有较高的稳定性，标准质谱图能够检索，信息丰富，由于色谱图结合了目标化合物的质谱图，因此能够准确对农药残留进行准确的定性和定量，测定效果具有优势。
本试验中对样品的净化采用了改进的QuEChERS方法，并采用在线凝胶渗透色谱-串联气质联用法对植物油与猪肉的55种农药残留进行了测定，结果将55种农药成分测定的低限范围确定在了0.005mg/kg≤LOQ≤0.03 mg/kg，样品的回收率则在55%～125%之间，标准偏差1.8%～8.1%。
参考文献
[1] 吴卫东，吴凤琪，万志刚等.在线凝胶渗透色谱-串联气质联用法测定植物油和猪肉中55种农药残留[J].食品安全质量检测学报，2014，（11）.
[2] 吴凤琪，聂冬锐，沈金灿等.快速溶剂萃取在线凝胶渗透色谱-串联气质联用法测定大豆中53种农药残留量[J].食品安全质量检测学报，2014，（11）.
[3] 姚翠翠.气相色谱串联质谱在农药多残留测定中的应用[D].河北大学，2010.
[4] 李南.色质联用技术在坚果中农药多残留分析中的应用[D].河北大学，2011.
【关键词】 超细珠黄凝胶；薄层色谱法；高效液相色谱法；靛玉红；胆酸
Abstract：Objective To establish the quality standard for Ulter Zhuhuang gel. Methods Indirubin， cholic acid and borneol were identified by TLC. The content of indirubin and cholic acid was determined by HPLC. Result The TLC sports developed was fairly clear. The HPLC method showed that the average recovery of indirubin and cholic acid was 100.3% with RSD＝2.1% and 98.9% with RSD＝1.8% respectively. Conclusion The method is convenient and accurate. It can be used for the quality control of Ulter Zhuhuang gel.
Key words： Ulter Zhuhuang gel；TLC；HPLC；indirubin；cholic acid
超细珠黄凝胶是以珠黄散为基本方，应用超细粉体等技术研制的一种新型制剂(专利号ZL 03152990.9)，内含珍珠、牛黄、青黛、冰片等，具有清热解毒、去腐生肌之功能。为了控制该制剂的质量，确保临床疗效，我们采用薄层色谱法对处方中青黛、牛黄、冰片等药材的主要成分靛玉红、胆酸、龙脑进行了定性鉴别；并用高效液相色谱法对凝胶中靛玉红和胆酸含量进行测定。
1 仪器与试药
美国Waters高效液相色谱仪；Waters 486 紫外检测器；Alltech 500型蒸发光散射检测器；Waters 515泵；WDL-95色谱工作站(大连物理化学研究所)；FA1104电子天平(上海)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山)。
靛玉红(批号0717-200003)、胆酸(批号10078-0013)、龙脑(批号881-200001)对照品由中国药品生物制品检定所提供；药材由南京市同仁堂药业有限责任公司提供；超细珠黄凝胶及空白凝胶自制。甲醇为色谱纯；其它试剂均为分析纯。
2 薄层色谱鉴别
2.1 溶液的制备
2.1.1 靛玉红、胆酸、龙脑对照品液的制备
分别称取干燥至恒重的靛玉红、胆酸、龙脑对照品2 mg，加氯仿适量溶解于2 mL量瓶中，定容至刻度。
2.1.2 青黛、牛黄、冰片对照药材液的制备
分别称取青黛、牛黄、冰片0.5 g，加入氯仿20 mL，超声提取0.5 h，滤过，上清液置水浴蒸干，残渣加氯仿溶解，转移至2 mL量瓶，定容至刻度。
2.1.3 凝胶样品供试液的制备
称取超细珠黄凝胶5 g，加入氯仿20 mL，超声提取0.5 h，滤过，上清液置水浴蒸干，残渣加氯仿溶解，转移至2 mL量瓶中，定容至刻度。
2.1.4 空白凝胶供试液的制备
分别取不含青黛、牛黄、冰片的阴性凝胶样品，按“2.1.3”项下方法制备相应空白供试液。
2.2 靛玉红的薄层色谱鉴别
分别吸取靛玉红对照品液、青黛药材对照液、样品供试液、缺青黛的空白凝胶供试液，分别点于同一薄层硅胶G板上，以苯-氯仿-丙酮(5∶4∶1)为展开剂[1]上行展开，展距约15 cm，取出，晾干，可见光下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置显相同颜色斑点，而空白凝胶供试液无干扰。
2.3 胆酸的薄层色谱鉴别
分别吸取胆酸对照品液、牛黄药材对照液、样品供试液、缺牛黄的空白凝胶供试液，分别点于同一薄层硅胶G板上，用异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸(15∶7∶5)作为展开剂[1]，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇液，105 ℃加热至斑点显色清晰，放冷，在365 nm紫外灯下观察。供试品色谱中含有与胆酸标准品及牛黄药材对照液一致的荧光斑点，而空白凝胶供试液无干扰。
2.4 龙脑的薄层色谱鉴别
分别吸取龙脑对照品液、冰片药材对照液、样品供试液、缺冰片的空白凝胶供试液，分别点于同一薄层硅胶G板上，以石油醚-乙酸乙酯-苯(18∶2∶4)作为展开剂[2]，展开，取出，晾干，喷以10%香草醛浓硫酸溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中含有与龙脑标准品及冰片药材对照液一致的斑点，而空白凝胶供试液无干扰。
3 含量测定
3.1 靛玉红的含量测定
3.1.1 色谱条件
Lichrospher RP C18色谱柱(汉邦科技)；流动相：甲醇-水-甲酸(80∶20∶1)；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；AUFS：0.5；进样量：5 μL。在此条件下取靛玉红对照品液、凝胶样品供试液、缺青黛的空白凝胶样品供试液分别进样，结果显示，靛玉红峰对应处无干扰峰存在。见图1。
3.1.2 线性关系考察
精密称取靛玉红对照品1.3 mg，定容于50 mL量瓶中，加适量甲醇超声使其充分溶解，定容，得浓度为26.0 μg/mL的靛玉红标准液。分别精密量取靛玉红标准液0.5、1、2、5 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，分别得浓度为1.3、2.6、5.2、13 μg/mL对照品液。上述对照品液和原标准液依次进样，以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。靛玉红浓度在1.3～26.0 μg/mL范围内呈线性关系。回归方程：Y＝8 700.9＋24 420.0X，r＝0.999 8。
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3.1.3 样品供试液的制备
精密称取凝胶样品2.0 g，置三角烧瓶中，分次加入氯仿20、20、10 mL，各超声提取30 min，合并氯仿提取液，水浴挥干，残渣加甲醇溶解并定容至1 mL，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液供测定用。
3.1.4 精密度试验
精密吸取对照品液，重复进样，记录峰面积。结果6次进样峰面积的RSD＝1.29%。
3.1.5 重复性试验
精密吸取同一批样品供试液，重复进样。结果6次进样峰面积的RSD＝1.76%。
3.1.6 稳定性试验
取对照品液，在0、l、2、3、4、5 h分别进样，记录峰面积，结果6次进样峰面积的RSD＝1.03%，可见5 h内测定结果稳定。
3.1.7 加样回收率试验
精密称取已知含量的同一批样品6份，每份2.0 g，分别精密加入定量的靛玉红对照品液，按“3.1.3”项处理后测定其中靛玉红含量。结果平均加样回收率为100.3%，RSD＝2.1%，见表1。表1 靛玉红加样回收率试验结果(略)
3.1.8 样品含量测定
取3批超细珠黄凝胶样品(030107， 030118，030125)，按“3.1.3”项处理，测定靛玉红含量。3批凝胶中靛玉红含量分别为3.313、3.034、3.469 μg/g，平均含量为3.272 μg/g。
3.2 胆酸的含量测定
3.2.1 色谱条件[3]
Lichrospher RP C18色谱柱(汉邦科技)；流动相：甲醇-水-冰醋酸(80∶20∶0.01)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度105 ℃，雾化气体(N2)流速：2.05 SLPM；进样量：5 μL。在此条件下取胆酸对照品液，凝胶样品供试液，缺牛黄的空白凝胶样品供试液分别进样，结果显示，空白凝胶样品在胆酸峰对应处无干扰，见图2。
3.2.2 线性关系的考察
精密称取胆酸对照品45.10 mg，于50 mL量瓶中，加适量甲醇超声使其充分溶解，定容，得浓度为902.0 μg/mL的胆酸标准液。分别精密量取上述标准液1、2、4、6、8 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容，得浓度为90.2、180.4、360.8、541.2、721.6 μg/mL的对照液。依次进样，以对照品浓度的自然对数lnX为横坐标，峰面积的自然对数lnY为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：lnY＝4.146 2＋1.509 1 lnX， r＝0.999 9。可见，样品浓度在90.2～902.0 μg/mL范围内线性关系良好。
3.2.3 样品供试液的制备
精密称取超细珠黄凝胶2.0 g，置三角烧瓶中，分次加入甲醇20、20、10 mL，各超声提取30 min，合并甲醇提取液，水浴挥干，残渣加甲醇溶解并定容于5 mL量瓶，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液供测定用。
3.2.4 精密度试验
精密吸取胆酸对照溶液，重复进样，记录峰面积。结果6次进样峰面积的RSD＝1.72%。
3.2.5 重复性试验
精密吸取样品供试溶液，重复进样，结果6次进样峰面积的RSD＝1.17%。
3.2.6 稳定性试验
取胆酸对照溶液，在0、2、4、6、8、10 h分别进样5 μL，记录峰面积，结果6次进样峰面积的RSD＝2.52%，可见在10 h内测定结果稳定。
3.2.7 加样回收率试验
精密称取已知含量的同一批样品6份，每份2.0 g，分别精密加入定量的胆酸对照品液，按“3.2.3”项处理后测定其中胆酸含量。结果平均加样回收率为98.9%， RSD＝1.8%，见表2。表2 胆酸加样回收率试验结果(略)
3.2.8 样品含量测定
取3批超细珠黄凝胶样品(030107， 030118，030125)，按“3.2.3”项处理，测定胆酸含量。结果显示，3批超细珠黄凝胶样品中胆酸含量分别为501.8、494.4、508.4 μg/g，平均含量为501.5 μg/g。
4 讨论
青黛中主要含靛玉红、靛蓝、色氨酮、青黛酮等成分，药理研究表明，青黛中的靛玉红具有抗肿瘤活性，还能治疗慢性粒细胞白血病等病症。而《中华人民共和国药典》[1]中对青黛中靛玉红仅有定性检查。为了更好地控制超细珠黄凝胶中青黛的质量，我们建立了靛玉红的高效液相色谱分析方法，操作简单，结果准确，可以有效地检测青黛中的靛玉红含量。
牛黄为牛科动物黄牛或水牛的胆囊结石，主要含胆汁酸、胆红素、胆固醇、麦角固醇、多种氨基酸等成分。胆酸是胆汁酸中一种游离型甾体化合物，也是牛黄的主要指标性成分之一。由于胆酸结构中不含生色基团，因此，使用高效液相色谱常用检测器(如紫外、荧光检测器)测定其含量时，需在短波末端(≤210 nm)进行，灵敏度低，而且一些微量强吸收杂质和溶剂会产生干扰，影响色谱峰分离。蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector，ELSD)是一种新型质量检测器，其测定原理是基于不挥发样品分子对光的散射程度与其质量成正比，与其所含基团性质无关，主要用于没有紫外或为紫外末端弱吸收的样品。我们采用ELSD-HPLC联用测定超细珠黄凝胶中胆酸含量，结果准确，重现性好，利于其中牛黄的质量控制。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005.138，48，附录12.
[2] 刘汉清，袁红宇，许金宏，等.宫糜药膜与宫糜散质量对比研究[J].江苏药学与临床研究，1996，4(2)：10－15.
关键词：蛋白质组学；人胰液；双向凝胶电泳
中图分类号：O655.4文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)04-0005-05
Establishment and Optimization of Separation of Human Pancreatic Juice by Two-Dimensional Gel Electrophoresis
LIU Xiao-yong, HAN Jin-xiang, CUI Ya-zhou, ZONG Mei-juan, CHEN Yu, TIAN Mei
（Shandong Medical Biotechnological Center, Key Laboratory for Biotech-Drugs, Ministry of Health, Jinan 250062, China）
Abstract：Objective To establish and optimize the two-dimensional gel electrophoresis separation of proteome in human pancreatic juice.Methods By comparing several commonly used protein extraction methods，a method for the separation of proteome in human pancreatic juice was determined. The proteome in human pancreatic juice was effectively concentrated and separated by isoelectric focusing on first dimension and SDS-PAGE on second dimension.Results By optimizing the extraction of proteins in human pancreatic juice, loading amount and separation scope of IPG strip, the proteins were successfully extracted from human pancreatic juice and were separated by two-dimensional gel electrophoresis with higher resolution and better reproducibility.ConclusionAcetone-precipitation combined with two-dimensional gel electrophoresis is a suitable approach to study the proteome in human pancreatic juice. The optimization of the separation of human pancreatic juice by two-dimensional gel electrophoresis lays a technological foundation for the further investigation of disease-related human pancreatic juice proteomics.
Key words：proteomics; human pancreatic juice; two-dimensional gel electrophoresis
胰液中含有胰腺组织细胞所释放的高浓度的蛋白质与DNA。胰液中蛋白质的变化与胰腺的生理或病理状态密切相关，这些蛋白质是潜在的胰腺疾病标记物。因此，胰液的检测对早期胰腺疾病的筛查具有重要意义。目前国际上对胰液蛋白组分的研究多采用表面增强激光解析飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术[1]和一维液相分离与质谱鉴定联用（1DLC-MS/MS）的方法[2]，发现了HIP/PAP-I、PAP-2等具有重要的临床应用价值的胰腺肿瘤检测标志物。然而这两种方法的定量偏差和分辨率不高的缺陷却成为深入研究胰液蛋白质组学的技术瓶颈。
双向凝胶电泳技术依据蛋白质等电点进行第一向等电聚焦，然后根据蛋白质相对分子质量大小进行第二向SDS-PAGE分离，可以在一个平面上分离出数以千计的蛋白质，在整体水平上研究生命活动的规律，从中筛选出潜在的生物标记物，为寻找胰腺疾病早期诊断、治疗、预后的特异性标志物提供新的途径。但是胰液样品中富含的盐、脂和蛋白酶等物质，对双向凝胶电泳干扰较大。因此，如何提高胰液双向凝胶电泳的分辨率和重复性成为胰液蛋白质组研究的首要问题。
本研究通过对胰液样品双向凝胶电泳的几个关键环节的分析，建立了一种适合于有效分离胰液蛋白质的双向凝胶电泳技术方案，得到了分辨率较高和重复性较好的电泳图谱。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1标本胰液标本由山东大学齐鲁医院通过术后引流的方法提供。
1.1.2主要试剂考马斯亮蓝R350，IPG buffer（immobilized pH gradient buffer），Immobilized DryStrip，矿物油，2D-Quant试剂盒，2D-Cleanup试剂盒（GE Amersham公司）；尿素，硫脲，CHAPS，二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），三羟甲基氨基甲烷（Tris-base），碘乙酰胺（IAA），甘氨酸，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，四甲基二乙胺（TEMED），过硫酸铵，硝酸银，十二烷基磺酸钠（SDS），甘油，琼脂糖等（Ameresco公司）；其余为国产分析纯试剂。
1.1.3主要仪器与软件ALC-210精密天平（Sartorius公司）；超声粉碎仪GY98-3d（宁波新芝研究所）；Microfuge 22R高速低温离心机（Beckman公司）；Vmax酶标仪（Molecular Device公司）；Ettan IPGphor II等电聚焦仪、Ettan DALTtwelve垂直电泳仪和ImageMaster5.0凝胶图像分析软件（GE Amersham公司）；PowerLook2100XL扫描仪（Umax公司）；4700型质谱仪（ABI公司）；SZ-93纯水蒸馏装置（上海雅荣公司）；超低温冰箱（SANYO公司）；QL-901 Vortex和TS-1脱色摇床（其林贝尔公司）等。
1.2样品处理
新鲜胰液标本10 000×g，4 ℃离心20 min，收集上清分装－80℃保存备用。将标本分别按如下方法处理：
① 2D-Cleanup试剂盒处理胰液标本，操作参照试剂盒说明书。用裂解液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4 % CHAPS，65 mmol/L DTT，2 % IPG Buffer）溶解沉淀过夜。
② 在胰液标本中加入4倍体积的预冷丙酮[含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF）]，－20℃沉淀2 h后，4 ℃，10 000×g离心10 min。用预冷的丙酮洗涤沉淀，室温干燥后，用裂解液溶解沉淀过夜[2]。
③ 在胰液标本中加入4倍体积的预冷三氯乙酸（TCA）/丙酮混合液（含20 %TCA，80 %丙酮，1 mmol/L PMSF），－20℃沉淀2 h后，4℃，10 000×g离心10 min。用预冷的丙酮洗涤沉淀，室温干燥后，用裂解液溶解沉淀过夜。
使用2D-Quant试剂盒将以上3种方法处理的样品和未经处理的胰液标本蛋白质定量。
1.3第一向等电聚焦电泳与平衡
将样品与水化液（8 mol/L Urea，2 % CHAPS，18 mmol/L DTT，0.5 % IPG Buffer，痕量溴酚蓝）混合，分组使用18 cm和24 cm IPG胶条（pH 3~10 NL）在IPGphor II水平电泳仪进行等电聚焦电泳。总聚焦数分别为50 kVh和65 kVh。
等电聚焦电泳后，将胶条从电泳槽中取出，用润湿的滤纸吸掉胶条上多余的矿物油，分别在平衡液基础液［1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8），6 mol/L 尿素，87 %（体积分数）甘油69 mL/200 mL，2 %（质量浓度）SDS］中加入1 % DTT，和2.5 % IAA 2次平衡各12 min。
1.4第二向SDS-PAGE电泳
将平衡好的胶条放置于12. 5 %均匀SDS-PAGE分离胶上端，用0.5 %琼脂糖封固。电泳参数设置：初始功率每胶0.2 W，电泳1 h，然后使用每胶0.4 W，电泳1 h，再以每胶17 W电泳大约6 h，待溴酚蓝前沿迁移至SDS-PAGE胶下缘时停止电泳。
1.5染色
使用考马斯亮蓝R350染色法（方法参见说明书）对凝胶染色。
1.6图像采集与分析
PowerLook2100XL扫描凝胶，并使用Image Master 5.0软件分析图像。
1.7酶解与质谱鉴定
将切取的蛋白质点酶解后，进行质谱鉴定[3]。
2实验结果
2.1胰液蛋白几种提取法的电泳结果
我们分别使用丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和2D-Cleanup试剂盒3种方法对胰液样品进行了处理。将提取的蛋白质定量后，我们按100μg的蛋白质量在18 cm干胶条（pH 3~10 NL）上双向凝胶电泳（图1）。
A. 未经处理的胰液原液双向凝胶电泳图谱（点数271）；B. 丙酮沉淀法处理的胰液双向凝胶电泳图谱（点数318）；C. TCA/丙酮沉淀法处理的胰液双向凝胶电泳图谱（点数274）；D. 2D-Cleanup试剂盒法处理的胰液双向凝胶电泳图谱（点数294）。
2.2等电聚焦电泳不同上样量的电泳结果
蛋白质的上样量会直接影响双向凝胶电泳图谱的分辨率。图2是丙酮沉淀法处理的胰液样品在不同上样量情况下的双向凝胶电泳图谱。
A. 胰液蛋白质500μg上样量双向凝胶电泳图谱（点数629）；B. 胰液蛋白质100μg上样量双向凝胶电泳图谱（点数318）。
2.3等电聚焦电泳IPG胶条不同长度的电泳结果
在IPG胶条长度的选择上，我们按500 μg蛋白质上样量分别选取了2种长度的IPG胶条，进行了双向凝胶电泳（图3），图3A是18 cm pH3~10 NL的胶条（点数629），图3B是24 cm pH3~10 NL的胶条（点数634）。
此外，诸如等电聚焦的电压设置、平衡时间的选择、SDS-PAGE电泳的电流设置，染色方法的选择等一些其他实验条件和方法，都是我们经过反复比较、优化调整而得出的。
2.4 部分蛋白质鉴定结果
我们对电泳凝胶的蛋白质点酶解后，进行了质谱鉴定，发现了一些新的胰液相关蛋白质。见表1。
3 讨论
由于胰腺位置隐蔽，多数胰腺疾病临床症状不典型，同时又缺少敏感和特异性的诊断指标，导致胰腺疾病严重威胁人类的健康和生命[3]。因此，发现新的敏感的、特异性强的胰腺疾病标记物进行早期筛查，成为当前胰腺疾病研究的主要方向。
胰液中含有很多胰腺分泌的关键调节蛋白质，在许多生理或病理状态下，这些蛋白质会在胰液中出现质或量的变化。与其他的胰液蛋白质分离方法相比较，双向凝胶电泳具有分辨率高、定量相对准确等优势。然而胰液样品中的盐、脂和蛋白酶等对双向凝胶电泳干扰较大，影响电泳图谱的重复性。因此，探寻一种能够有效增加胰液中蛋白质的抽提及其溶解性的方法，是建立胰液蛋白质表达谱所要解决的首要问题。
本文通过对胰液样品双向凝胶电泳的几个关键环节的分析，建立起一种适合于有效分离胰液蛋白质的双向凝胶电泳技术方案，并对胰液中的部分蛋白质进行了鉴定，得到了一些尚未报道的胰液相关蛋白质。
3.1丙酮沉淀法提取胰液蛋白质
蛋白质沉淀的方法可以去除脂、盐和核酸等杂质对等电聚焦电泳的干扰，还可以抑制蛋白酶活性，减少蛋白质降解并在一定程度上富集低浓度蛋白质，因此被广泛用于蛋白质样品的预处理和纯化。常用的沉淀剂为丙酮和TCA。由于我们在使用TCA处理其他样品时有蛋白质丢失现象，因此我们将TCA和丙酮按1:4的比例混合作为另一种沉淀剂。
结果发现，经沉淀法处理的样品图谱与胰液原液的电泳图谱相比较虽然有少量蛋白点的丢失，但是处理后的胰液电泳图谱在重复性和分辨率上要优于胰液原液图谱，并且出现了一些新的蛋白点，这些点是一些被脂类结合的蛋白质，以及一些容易被蛋白酶降解的蛋白质，通过沉淀过程的处理后保留了下来，从而显示在凝胶图谱上。我们认为，沉淀法处理后的样品，能够改善电泳的条件，图谱上多出了很多有望成为胰液生物标志物的蛋白点，更提高了图谱部分区域的分辨率，因此沉淀法可以作为胰液蛋白质组双向凝胶电泳样品制备的有效方法。
3种沉淀方法中，TCA/丙酮沉淀法与其他2种方法相比，有利于提高酸性蛋白质的分辨率，但造成了很多蛋白点的丢失，因此不适合胰液标本的处理。而实际应用中，与2D-Cleanup试剂盒处理法相比，丙酮沉淀法具有成本低廉、操作简便等优势。因此，我们认为利用丙酮沉淀法纯化胰液类盐、脂较丰富的样品，去除干扰成分，具有较好的效果。
3.2胰液蛋白质制备中蛋白酶的添加及重溶时间的选择
Wandschneider等[4,6]认为胰液中含有大量的蛋白酶，将未经处理的胰液样品直接进行双向凝胶电泳时应当使用多种多量的蛋白酶抑制剂如苯甲磺酰氟、抑酞酶等，防止胰液中蛋白质的降解，从而提高2-DE 操作的重复性。但是考虑到蛋白酶抑制剂本身对蛋白质的修饰可能并且可以出现在最后的双向凝胶电泳图谱中[4,5]，我们根据尽可能简化的原则仅加入PMSF，再与使用Cocktail复合蛋白酶抑制剂（Roche公司产品）的双向凝胶电泳图谱对比之后，证实完全可行，这也是建立使用丙酮沉淀法处理胰液和全程在冰上或－20℃的环境中操作，沉淀后的蛋白酶活性丧失的基础上的。
文献报道[3-5]的丙酮沉淀法中，沉淀的重溶时间有多种选择。我们分别对4 h与过夜2种情况作了预试验。结果显示，4 ℃沉淀重溶过夜并不会增加蛋白酶对蛋白质的降解，且蛋白质的溶解性还得到了显著提高。
3.3等电聚焦电泳上样量的优化
蛋白质的上样量会直接影响双向凝胶电泳图谱的分辨率。对于18 cm的胶条，图2 A加样量略显大（500μg，点数629），高丰度蛋白连成一片，低丰度蛋白分辨率低，严重影响了图谱的后续分析。图2 B加样量又略显小（100μg，点数318），虽然图谱效果明显好于图2 A，多数蛋白点清晰可辨，但部分低丰度蛋白却没有显示出来。想要选择一种既能提高上样量又能获得效果较为理想的电泳图谱，就要在IPG胶条的选择上做一些改进。
3.4等电聚焦电泳IPG胶条pH范围和长度的选择
商品化的IPG胶条在pH范围上有线性与非线性，宽pH梯度与窄pH梯度之分[3]。我们通过初步试验分析胰液中蛋白质总体分布情况后，发现胰液蛋白质主要集中于pH4～7梯度段之间，在酸碱两端也有少量蛋白质分布。因此，我们在胰液样品双向凝胶电泳时选用了pH3～10非线性的IPG胶条，既能检测胰液蛋白质总体分布，又能相对提高pH4～7段的分辨率，获得更多的蛋白质点。
在IPG胶条长度的选择上，通过图谱分析，我们认为，使用18 cm胶条低上样量适合于胰液蛋白质的分析，而24 cm胶条高上样量则更利于胰液蛋白质的制备。
3.5胰液相关蛋白质的鉴定
通过与前人[2]工作的比较，我们初步发现了10余种尚未报道的胰液相关蛋白质。通过后续功能研究，将有可能从中发现可直接用于胰腺疾病检测的生物标志物[7]。
我们通过一系列相关实验，得出了如下结论：第一，在低温下使用丙酮沉淀法处理胰液样品，既可以去除盐、脂等干扰物质，提高蛋白质的抽提率，还可以抑制蛋白酶的活性，减少蛋白质的修饰和损失；第二，使用商品化的IPG胶条，在选取合适的长度（18/24 cm）和pH范围（pH3~10 NL）的基础上，适当提高上样量（400~500μg），并采用考马斯亮蓝R350染色可以提高胰液双向凝胶电泳图谱的分辨率和重复性。
总之，我们对人胰液蛋白质组双向凝胶电泳的条件、标本处理等各个环节进行了调整、优化，建立了相对稳定的人胰液双向凝胶电泳技术方案，初步鉴定出部分胰液蛋白质，为建立胰液蛋白质表达谱及进一步开展疾病相关的胰液蛋白质组学研究打下了良好的技术基础。
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【摘要】 目的从舟山眼镜蛇蛇毒中分离L氨基酸氧化酶(LAO)，测定其理化和酶学性质。方法应用Sephadex G100凝胶色谱和POROS CM20离子交换色谱分离纯化LAO;Wellner和Lichtenberg法测定LAO活力;SDSPAGE法测定相对分子质量。结果舟山眼镜蛇蛇毒经Sephadex G100凝胶色谱和两次POROS 20 离子交换色谱后，获得LAO纯品(暂定名NALAO)。NALAO在非还原和还原条件下相对分子质量均为58 kD左右;其反应最适pH为8.0，最适温度为60 ℃，对L苯丙氨酸的米氏常数(Km)为3.08 mmoL/L。结论应用凝胶过滤色谱和离子交换色谱可从舟山眼镜蛇毒中分离纯化LAO。
【关键词】 眼镜蛇毒液类; 氨基酸氧化还原酶
蛇毒成分复杂，主要为酶和毒素，L氨基酸氧化酶(EC.1.4.3.2)在蛇毒中分布非常广泛，在蝰科、响尾蛇科、眼镜蛇科以及蝮蛇科中都有分布[14]。L氨基酸氧化酶(Lamino acid oxidase，LAO)是蛇毒中一种重要的活性组分，能够催化L氨基酸的氧化脱氨反应，生成相应的α酮酸、氨以及过氧化氢[5]，具有多种生物活性，如诱导血管内皮细胞凋亡、抑制或诱导血小板聚集、细胞毒性和抗菌活性等[610]。已从几种蛇毒中分离得到LAO，笔者应用凝胶色谱和离子交换色谱从舟山眼镜蛇蛇毒分离LAO，并对其部分理化和酶学性质进行初步研究。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1蛇毒舟山眼镜蛇(Naja atra)蛇毒冻干粉，福建医科大学蛇毒研究所提供。
1.1.2试剂与仪器L苯丙氨酸(批号040924，上海翔军生物科技有限公司);砷酸钠（Lot#:0892B82，美国Amresco公司）;过氧化氢酶（AA1041，美国Sigma公司）。SephadexG100凝胶柱(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);CM20阳离子交换填料预装柱(POROS 20，美国Applied Biosystems公司);BioCAD纯化工作站(美国Applied Biosystems公司);自动部分收集器(BSZ100)和恒流泵(HL1，上海沪西分析仪器厂);恒温摇床(美国Forma公司);紫外分光光度计(美国Biorad公司);试剂均为进口或国产分析纯。
1.2方法
1.2.1眼镜蛇蛇毒的凝胶色谱Sephadex G100凝胶柱(2.6 cm×100 cm)用HAcNaAc缓冲液(pH 5.8，0.05 mol/L+NaCl 0.05 mol/L)预先平衡过夜。称取眼镜蛇粗毒0.5 g溶于10 mL双蒸水，4 ℃静置过夜，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min。取上清液凝胶柱，用HAcNaAc缓冲液洗脱，流速16 mL/h。收集洗脱液，4 mL/管，根据D(280 nm)值绘出洗脱曲线。
1.2.2凝胶色谱组分LAO活力按文献[5]介绍的流程和反应体系进行分离组分酶活力测定。凝胶色谱洗脱组分0.1 mL与L苯丙氨酸反应，以终产物的光密度值[D(300 nm)]为指标，以反应体系中加HAcNaAc缓冲液0.1 mL取代蛇毒组分为未加酶对照。一个活力单位定义为在上述条件下得到0.03D300 nm所需的酶量。
1.2.3LAO纯化合并经凝胶色谱收集的具有LAO活性的组分。以POROS 20进行纯化。线性梯度洗脱(A液:0.05 mol/L，pH 5.8的HAcNaAc缓冲液;B液:含有0.5 mol/L NaCl的平衡液)，收集洗脱蛋白峰，浓缩和脱盐。测定POROS 20离子交换层析各组分的LAO活性，收集具有活性的组分，用POROS 20离子交换层析，以0.02 mol/L，pH 6.2的HAcNaAc缓冲液平衡，线性梯度洗脱(A液:0.02 mol/L，pH 6.2的HAcNaAc缓冲液;B液:含有0.5 mol/L NaCl的平衡液)，进一步纯化，收集活力峰，浓缩、透析脱盐。
1.2.4LAO纯度鉴定及相对分子质量按碱性不连续系统进行。样品按是否含有2%β巯基乙醇分为还原性和非还原性两种。在Hoefer电泳仪上电泳2 h，稳流12 mA/10 cm×10 cm。常规染色脱色。在Image Master VDS凝胶成像系统上依据标准蛋白绘制标定曲线，计算相对分子质量。
1.2.5蛋白质浓度采用文献[11]方法，将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260 nm和280 nm处分别测出D值，然后利用280 nm和260 nm波长下的吸收差求出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度(mg/mL)=1.45D(280 nm)-0.74D(260 nm)
1.2.6LAO对温度和pH适应性最适pH测定:在pH 6.0~10.0缓冲液中，其他条件不变，测定酶活力。最适温度测定:酶液在0.4 moL/L，pH 7.8的TrisHCl缓冲液中，测定20，30，40，50，60和70 ℃下的酶活力。以酶活力最高者为100%，其余折算为最高活力的百分数，并以pH或温度为横坐标，最高活力百分数为纵坐标，绘制酶活力适应曲线。
1.2.7LAO米氏常数(Km)酶液与不同浓度L苯丙氨酸反应，利用反应终止法测定酶反应初速度(V)，根据LineweaverBurk作图法求出该酶对L苯丙氨酸的Km值[12]。
2结果
2.1眼镜蛇蛇毒凝胶色谱眼镜蛇毒粗毒经Sephadex G100凝胶层析后获得5个蛋白峰，分别标记为Ⅰ~Ⅴ。其中第Ⅱ峰具有LAO活力。从粗毒500 mg中可获得Ⅱ组分38.6 mg，蛋白回收率约7.8%(图1，表1)。
样品:眼镜蛇蛇毒(500 mg);凝胶柱:Sephadex G100 2.6 cm×100 cm;洗脱液:HAcNaAc缓冲液(0.05 mol/L，pH 5.8，含0.05 mol/L NaCl);流速:16 mL/h，4管/h;阴影部分为L氨基酸氧化酶活性组分.
图1眼镜蛇蛇毒的Sephadex G100凝胶色谱
Fig 1Gel filtration of Naja atra venom on Sephadex G100
2.2LAO纯化凝胶色谱第Ⅱ峰经CM20预装柱POROS 20 进行分离，分离后可得到7个洗脱峰，其中第4峰具有LAO活力(图2)。合并收集该组分，再次用POROS 20 纯化，得到A、B两个蛋白峰，经活性测定，其中第B峰具有LAO活性。该组分经SDSPAGE鉴定为电泳纯暂定名为NALAO。从粗毒到获得NALAO各层析步骤的目的组分得率及酶活性变化(表1)，NALAO在眼镜蛇毒粗毒中的含量约为0.3％。 表1L氨基酸氧化酶的酶活力变化及得率样品:第Ⅱ组分;上样体积:5 mL;色谱柱:CM20 (POROS 201.6 mm×100 mm);缓冲液体系:A液:HAcNaAc(pH 5.6，0.05 mol/L);B液:A液+0.5 moL/L NaCl;梯度:30%~100%，25CV;流速1 mL/min;出现“—”组分具有L氨基酸氧化酶活性.
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图2POROS 20 离子交换色谱图
Fig 2Ionexchange chromatography of LAO on CM20 (POROS 20)
2.3NALAO纯度鉴定及相对分子质量NALAO经12.5%SDSPAGE电泳为一条清晰的蛋白带(图3)，NALAO不论是还原还是非还原SDSPAGE电泳均为一条带，说明NALAO为单链蛋白，相对分子质量约58 kD。
2.4NALAO对温度和pH的适应性在LAO酶活力测定的体系中，改变反应温度，其余条件不变，NALAO在20~70 ℃区间，60 ℃时活力最高。以60 ℃时LAO活力为100%，绘制NALAO在不同温度下的酶活力(图4)。
在pH 6.0~10.0的缓冲体系，NALAO活性在pH 8.0时为最高，在pH 9.0~10活性较pH 8.0为低，但仍保持较高活性。以pH 8.0时酶活力为100%，绘制NALAO在不同pH下的酶活力(图5)。
2.5LAO米氏常数(Km)以苯丙氨酸为底物，在pH 7.8，37 ℃下，根据LineweaverBurk双倒数作图法作图，得出的方程为:[1/V]=0.0276+0.0851*[1/S]，计算眼镜蛇LAO对L苯丙氨酸的Km值为3.08 mmoL/L(图6)。
3讨论
3.1眼镜蛇毒LAO的分离纯化蛇毒是多种酶或非酶蛋白质或多肽的混合物，含有多种相对分子质量大小不等、等电点各异的蛋白质或多肽分子。分离蛇毒中活性成分有凝胶过滤层析法、离子交换层析法、疏水层析法和反相层析法等。笔者根据眼镜蛇毒中各种组分相对分子质量的差异应用Sephadex G100凝胶过滤法进行分离，具有LAO活性的组分为相对分子质量相对较大的成分，约占粗毒7.8％，这一过程去除了大量相对分子质量低的组分(约90%)，为进一步用离子交换层析降低了层析柱负荷。由于凝胶色谱分级所得到的活性组分间还含有不少其他非LAO的蛋白质，因此，根据蛋白质的荷电性质差异，应用ROROS 20弱阳离子交换色谱进一步分离，发现70％为非LAO蛋白质。根据相关文献和前期预实验的结果，笔者采用在不同pH条件下的ROROS 弱阳离子交换色谱，将相对分子质量和等电点接近的蛋白质进一步分离，结果发现经第一次ROROS 色谱所得具有LAO活性的蛋白峰再次经ROROS 色谱柱(洗脱液pH由5.6改为6.2，洗脱梯度由30%~100％改为0~50％)获得两个色谱峰，含有LAO的为第B峰。
3.2蛇毒LAO的理化性质及活性根据以往的研究报道，从不同蛇毒中分离纯化出来的LAO有不同的结构，以同二聚体或异二聚体形式存在的相对分子质量分布在100~142 kD，以单体蛋白质形式存在的相对分子质量55~60 kD[3]。本文分离得到的眼镜蛇毒LAO即NALAO在还原与非还原条件下，SDSPAGE电泳均显示一条带，说明它为单链蛋白质，相对分子质量为58 kD，与文献报道的江浙蝮蛇毒LAO相似。Tan等报道的同属眼镜蛇科的孟加拉眼镜蛇(Naja kaouthia)毒LAO及Ahn等报道的眼镜王蛇毒LAO均为同二聚体蛋白，相对分子质量分别为112和135 kD[1，4]，说明不同蛇毒的LAO的理化性质差异很大，但是LAO单体或二聚体存在与蛇种关系不大。
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[关键词] 籽瓜；葫芦科；乙酸乙酯部位；化学成分
[Abstract] In this paper， the chemical composition of ethyl acetate parts of seed melon were studied by using ethanol re-flux method， extraction method， and isolated by column chromatography oversilica gel and Sephadex LH-20 and HPLC. The structures of the separated compounds were identified by physical-chemical methods and spectral data such as MS，1H-NMR，13C-NMR， etc. 12 compounds were got from the plant including one new compound， 4-hydroxymet-hyl-2-methoxyphenyl 1-O-β-D-[6′-O-（4″-hydroxybenzoyl）-glucopyranoside] （1） and 11 known compounds， uracil （2）， thymine （3）， 2′-deoxyuridine （4）， 7，8-dimethylalloxazine （5）， indole-3-carboxylic acid （6）， β-adenosine （7）， 4-hydroxybenzoic acid （8）， p-coumaric acid （9）， cucumegastigmanesⅠ （10）， 3′-methoxyl-quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside （11） and 3，3′-dimethyloxy-4，4′-dihydroxy-9，9′-monoepoxy lignan （12）.
[Key words] seed melon；Cucurbitaceae；ethyl acetate part；chemical constituents
doi：10.4268/cjcmm20161314
籽瓜Citrullus lanatus ssp.vulgaris var.megalaspermus Lin et Chao，又名打瓜。属葫芦科西瓜属普通西瓜种的栽培变种，主要分布于新疆、内蒙古和甘肃等地[1]。籽瓜含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素B、D等营养物质，多做日常食用，是人们普遍喜爱的美味食品。在医疗行业除了可降低血浆胆固醇、调节血糖水平、预防肥胖以外，还可以抑制癌细胞扩散或肿瘤的形成。具有重要的经济开发价值[2]。
全国籽瓜年产量数百万吨，但均用于取籽，然而占总质量近93%的瓤、皮被废弃扔掉，不仅造成资源浪费，而且污染农田环境[1-2]。本研究利用籽瓜皮作为原料，将籽瓜皮提取物乙酸乙酯部位进行化学成分的研究。
1 材料
籽瓜瓜皮，籽瓜取籽后留在田间的部分，采自新疆石河子150团15连，并由石河子市蔬菜所所长薛琳鉴定品种为内蒙黑中片。
UV-2401紫外分光光谱仪（日本岛津公司）；SK5200HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；BP211D型电子天平（德国赛多利斯）；RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；真空干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；酒精计（冀州市耀华机械代表厂）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市英峪子华仪器厂）；LC3000型高效液相色谱仪；Varian inova-400 型核磁共振波谱仪；Waters LCT Premier XE time-of-flying质谱仪（美国 Waters 公司）。
乙酸乙酯（天津市富宁精细化工有限公司）；正丁醇（天津市富宁精细化工有限公司）；石油醚（天津市富宁精细化工有限公司）；甲醇（广东市东红化工厂）；薄层硅胶GF254（青岛海洋化工有限公司），柱色谱用硅胶（青岛海洋化工有限公司），Sephadex LH-20，柱色谱用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和甲醇等均为分析纯试剂，液相所用甲醇为色谱纯。
2 提取与分离
2.1 提取与萃取 取干燥的籽瓜瓜皮40 kg，粉碎，分别以药材的9，6，6倍量的95%乙醇回流提取3次，再用75%乙醇同样以药材的9，6，6倍量回流提取，分别合并提取液，滤过，浓缩得95%乙醇和70%乙醇提取的浸膏分别为6.7，7.06 kg。将浸膏分别用水分散，依次用石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位630 g、乙酸乙酯部位142 g、95%正丁醇部位304 g、70%正丁醇部位240 g。
2.2 分离 将籽瓜乙酸乙酯部位浸膏（142 g）用无水乙醇溶解和150 g硅胶（80～100目）拌样，经硅胶柱色谱（100～200目），洗脱剂为氯仿-甲醇，每500 mL收集1次，经TCL，合并，得到Fr.H～O 8个流分。
Fr.H经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇 （30∶1～22∶1） 梯度洗脱，得到5个组分Fr.H1～Fr.H5。Fr.H3经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，硅胶柱色谱氯仿-甲醇 （30∶1）洗脱得到化合物5。Fr.H4经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，硅胶柱色谱氯仿-甲醇 （30∶1）洗脱得到2个组分Fr.H4.1～Fr.H4.2。Fr.H4.1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，硅胶柱色谱氯仿-甲醇（55∶1）洗脱得到化合物6。Fr.H4.2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，硅胶柱色谱氯仿-甲醇（50∶1）洗脱得到4个组分Fr.H4.2.1～Fr.H4.2.4。Fr.H4.2.4经制备HPLC （RP-C18），在55%甲醇-水洗脱，254 nm，5 mL・min-1的条件下纯化得到化合物12 （11.3 mg，tR=11.0 min）。Fr.H5经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱得到5个组分Fr.H5.1～Fr.H5.5。Fr.H5.3经硅胶柱色谱氯仿-甲醇 （50∶1）洗脱得到化合物3。Fr.H5.4经硅胶色谱柱氯仿-甲醇 （50∶1）洗脱和Sephadex LH-20凝胶色谱柱用甲醇洗脱得到化合物8和9。
Fr.I经硅胶柱色谱氯仿-甲醇 （28∶1～26∶1） 梯度洗脱，得到5个组分Fr.I1～Fr.I5。Fr.I 2经Sephadex LH-20凝胶色谱柱甲醇洗脱和硅胶色谱柱氯仿-甲醇 （40∶1）洗脱得到化合物11。
Fr.J经硅胶色谱柱氯仿-甲醇 （20∶1）洗脱，得到4个组分Fr.J1～Fr.J4。Fr.J3经Sephadex LH-20凝胶色谱柱甲醇洗脱得到化合物2。
Fr.K经Sephadex LH-20凝胶色谱柱甲醇洗脱和硅胶色谱柱氯仿-甲醇 （18∶1）洗脱，得到3个组分Fr.K1～Fr.K3。Fr.K3经Sephadex LH-20凝胶色谱柱甲醇洗脱得到3个组分Fr.K3.1～Fr.K3.3。Fr.K3.3经制备HPLC （RP-C18），流动相65%甲醇，检测波长254 nm，流速5 mL・min-1纯化得到化合物10 （14.5 mg，tR=12.0 min）。
Fr.M经硅胶色谱柱氯仿-甲醇 （17∶1）洗脱，得到5个组分Fr.M1～Fr.M5。Fr.M5经硅胶色谱柱氯仿-甲醇 （25∶1～20∶1） 梯度洗脱和Sephadex LH-20凝胶色谱柱甲醇洗脱得到3个组分Fr.M5.1～Fr.M5.3。Fr.M5.2经制备HPLC （RP-C18），流动相52%甲醇，检测波长254 nm，流速5 mL・min-1，纯化得到化合物4 （13.0 mg， tR=18.5 min）。
Fr.O经硅胶色谱柱氯仿-甲醇 （15∶1）洗脱，得到3个组分Fr.O1～Fr.O3。Fr.O3经Sephadex LH-20凝胶色谱柱甲醇洗脱得到化合物7和2个组分Fr.O3.1～Fr.O3.2。Fr.O3.2经制备HPLC（RP-C18），流动相45%甲醇，检测波长254 nm，流速5 mL・min-1，纯化得到化合物1 （15.0 mg，tR=12.0 min）。
3 结构鉴定
化合物1 Molish反应呈阳性，说明1为糖苷化合物。ESI-MS m/z 459.4 [M + Na] +，435.5 [M - H]-，471.4 [M + Cl]-，可知化合物的相对分子质量为436；HR-ESI-MS m/z 459.126 3 [M + Na]+ （计算值为459.126 7），可推断该化合物的分子式为C21H24O10。
在1H-NMR中存在1组AMX偶合的芳香质子δH7.26 （d，J=2.0 Hz，H-3），7.19 （dd，J=8.0，2.0 Hz，H-5） 和7.63 （d，J=8.0 Hz，H-6），这显示存在1个1，2，4-三取代苯环；在氢谱δH3.64 （s） 有1个甲氧基信号且与C-2在HMBC谱中存在相关峰，见图1，表明存在2-甲氧基-4-羟甲基苯环。另一组芳香质子构成苯环上的AA′XX′偶合系统δH8.22 （2H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′） 和7.18 （2H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′），提示存在1个对位取代苯环；在13C-NMR中存在羰基碳信号δC166.5 （C-7″），表明存在4″-羟基苯甲酸基团。
在1H-NMR中，能够观察到1个端基质子信号δH5.64 （1H，d，J=7.8 Hz，H-1′）且Molish反应呈阳性，表明有1个取代糖存在。综合分析1H-NMR，13C-NMR和HMBC谱可知该取代糖为吡喃葡萄糖基。端基质子的偶合常数J=7.8 Hz表明取代糖为β构型的吡喃葡萄糖。在HMBC谱中有H-1′与C-1相关峰，这表明该取代糖在C-1′位与苯环的C-1位相连；在HMBC谱中还存在H-6′与C-7″的相关峰，表明该取代糖在C-6′位与羰基碳C-7″通过氧原子位相连。
综上所述，化合物1的结构确定为4-羟苯甲基-2-甲氧基苯酚-1-O-[6′-O-（4″-羟基苯甲酸）]-β-D-吡喃葡萄糖苷，化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据见表1。
化合物2 白色粉末， 分子式为C4H4N2O2， ESI-MS m/z 286.8 [2M + Na + K]2+。1H-NMR （DMSO，500 MHz） δ： 10.82 （1H，s，H-1），11.02 （1H，s，H-3），5.46 （1H，d，J=7.5 Hz，H-5），7.39 （1H，d，J=8.0 Hz，H-6）；13C-NMR （DMSO，125 MHz） δ： 152.0 （C-2），164.8 （C-4），100.7 （C-5），142.7 （C-6） 。以上数据与文献[3]对照鉴定为尿嘧啶。
化合物3 白色粉末，分子式为C5H8N2O2 ，ESI-MS m/z 318.8 [2M + Na + K]2+。 1H-NMR （DMSO，500 MHz） δ： 10.65 （1H，s，H-1），10.96 （1H，s，H-3），7.25 （1H，s，H-6），1.72 （3H，s，CH3）；13C-NMR （DMSO，125 MHz） δ： 151.9 （C-2），165.4 （C-4），108.1 （C-5），138.2 （C-6），12.3 （CH3）。以上数据与文献[4]对照鉴定为胸腺嘧啶。
化合物4 白色粉末，分子式为C10H14N2O5，ESI-MS m/z 507.3 [2M + Na]+，277.4 [M + Cl]-。 1H-NMR （MeOD，500 MHz） δ： 7.83 （1H，s，H-6），6.30 （1H，t，J=7.0 Hz，H-1′），3.33 （1H，m，H-2′），4.42 （1H，m，H-3′），3.93 （1H，d，J=3.5 Hz，H-4′），3.81 （1H，d，J=3.0 Hz，H-5′a），3.76 （1H，d，J=3.5 Hz，H-5′b），1.90 （3H，d，J=1.0 Hz，CH3-5′）；13C-NMR （MeOD，125 MHz） δ： 151.0 （C-2），165.1 （C-4），110.2 （C-5），136.8 （C-6），84.8 （C-1′），39.8 （C-2′），70.8 （C-3′），87.4 （C-4′），61.4 （C-5′），11.1 （CH3-5）。以上数据与文献[5]对照鉴定为2′-脱氧尿嘧啶核苷。
化合物5 白色粉末，分子式为C12H10N4O2，ESI-MS m/z 485.6 [2M + H]+，241.4 [M - H]-。1H-NMR （pyridine-d5，500 MHz） δ： 7.75 （1H，s，H-6），7.94 （1H，s，H-9），2.15 （3H，s，7-OCH3），2.21 （3H，s，8-OCH3）；13C NMR （pyridine-d5，125 MHz） δ： 148.5 （C-2），163.0 （C-4），130.6 （C-6），140.0 （C-7），145.8 （C-8），128.0 （C-9），143.9 （C-4a），131.9 （C-5a），140.7 （C-9a），152.7 （C-10a），20.7 （CH3-7），21.3 （CH3-8） 。 以上数据与文献[6]对照鉴定为7，8-二甲基异咯嗪。
化合物6 白色粉末，分子式为C9H7NO2，ESI-MS m/z 160.3 [M - H]-，196.4 [M + Cl]-。1H-NMR （DMSO，500 MHz） δ： 7.99 （1H，s，H-2），8.02 （1H，d，J=7.5 Hz，H-4），7.17 （1H，s，H-5），7.17 （1H，s，H-6），7.46 （1H，d，J=7.5 Hz，H-7）；13C-NMR （DMSO，125 MHz） δ： 136.9 （C-2），112.6 （C-3），122.5 （C-4），121.4 （C-5），121.0 （C-6），112.6 （C-7），132.6 （C-8），126.5 （C-9），166.6 （C-10）。以上数据与文献[7]对照鉴定为吲哚-3-甲酸。
化合物7 白色粉末，分子式为C10H13N5O4，ESI-MS m/z 290.7 [M + Na]+。1H-NMR （DMSO，500 MHz） δ： 8.15 （1H，s，H-2），8.36 （1H，s，H-8），5.89 （1H，d，J=6.5 Hz，H-1′），4.63 （1H，dd，J=11.5，6.0 Hz，H-2′），4.15 （1H，dd，J=7.5，4.5 Hz，H-3′），3.98 （1H，d，J=3.0 Hz，H-4′），3.56 （1H，m，H-5′a），3.67 （1H，m，H-5′b），5.45 （1H，dd，J=7.0，4.5 Hz，OH-2′），5.21 （1H，d，J=4.5 Hz，OH-3′），5.47 （1H，d，J=6.0 Hz，OH-5′），3.39 （2H，s，NH2-6）；13C-NMR （DMSO，125 MHz） δ： 152.8 （C-2），149.5 （C-4），119.8 （C-5），156.6 （C-6），140.4 （C-8），88.4 （C-1′），73.9 （C-2′），71.1 （C-3′），86.4 （C-4′），62.1 （C-5′） 。以上数据与文献[8]对照鉴定为β-腺苷酸。
化合物8 白色粉末，分子式为C7H6O3，ESI-MS m/z 137.1 [M - H]-，173.1 [M + Cl]-。1H-NMR （MeOD，500 MHz） δ： 7.90 （1H，d，J=8.5 Hz，H-2，6），6.84 （1H，d，J=8.5 Hz，H-3，5）；13C-NMR （MeOD，125 MHz） δ： 121.3 （C-1），131.6 （C-2），114.6 （C-3），161.9 （C-4），114.6 （C-5），131.6 （C-6），168.8 （COOH） 。以上数据与文献[9]对照鉴定为对羟基苯甲酸。
化合物9 白色粉末，分子式为C9H8O3，ESI-MS m/z 163.1 [M - H]-。1H-NMR （MeOD，500 MHz） δ： 7.46 （1H，d，J=8.5 Hz，H-2，6），6.83 （1H，d，J=8.5 Hz，H-3，5），7.62 （1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.30 （1H，d，J=16.0 Hz，H-8）；13C-NMR （MeOD，125 MHz） δ： 125.8 （C-1），129.7 （C-2），115.4 （C-3），159.7 （C-4），115.4 （C-5），129.7 （C-6），145.2 （C-7），114.3 （C-8），169.8 （COOH） 。以上数据与文献[10]对照鉴定为对香豆酸。
化合物10 白色粉末，分子式为C13H20O4，ESI-MS m/z 503.3 [2M + Na]+，275.5 [M + Cl]-。 1H-NMR （MeOD，500 MHz） δ： 2.51 （1H，d，J=16.8 Hz，H-2a），2.16 （1H，d，J=16.8 Hz，H-2b），5.87 （1H，s，H-4），5.89 （1H，dd，J=15.6，1.0 Hz，H-7），5.79 （1H，dd，J=15.6，5.6 Hz，H-8），4.19 （1H，m，H-9），3.50 （1H，dd，J=11.1，5.0 Hz，H-10a），3.46 （1H，dd，J=11.1，6.7 Hz，H-10b），1.04 （3H，s，H-11），1.02 （3H，s，H-12），1.92 （3H，d，J=1.2 Hz，H-13）；13C-NMR （MeOD，125 MHz） δ： 42.5 （C-1），50.8 （C-2），201.3 （C-3），127.2 （C-4），167.0 （C-5），80.2 （C-6），132.6 （C-7），132.5 （C-8），73.7 （C-9），67.3 （C-10），23.5 （C-11），24.6 （C-12），19.6 （C-13）。以上数据与文献[11]对照鉴定为cucumegastigmanes Ⅰ。
化合物11 白色粉末，分子式为C22H24O11，ESI-MS m/z 487.4 [M + Na]+，463.5 [M - H]-，499.4 [M + Cl]-。1H-NMR （MeOD，500 MHz） δ： 5.29 （1H，m，H-2），2.68 （1H，dd，J=6.0，3.0 Hz，H-3a），2.64 （1H，dd，J=5.5，3.0 Hz，H-3b），6.09 （1H，t，J=2.0 Hz，H-6），6.13 （1H，t，J=2.0 Hz，H-8），6.98 （1H，s，H-2′），6.72 （1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.83 （1H，d，J=8.0 Hz，H-6′），3.78 （3H，s，OCH3-3′）；13C-NMR （MeOD，125 MHz） δ： 79.5 （C-2），42.7 （C-3），197.2 （C-4），163.6 （C-5），96.6 （C-6），165.6 （C-7），95.5 （C-8），163.2 （C-9），103.5 （C-10），130.1 （C-1′），110.0 （C-2′），147.7 （C-3′），146.8 （C-4′），114.7 （C-5′），119.2 （C-6′），55.1 （OCH3-3′），99.8 （glc-1″），73.2 （glc-2″），76.9 （glc-3″），69.7 （glc-4″），76.4 （glc-5″），60.9 （glc-6″）。以上数据与文献[12]对照鉴定为3′-甲氧基-槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物12 白色粉末，分子式为C20H26O6，ESI-MS m/z 361.7 [M - H]-，397.6 [M + Cl]-。1H-NMR （pyridine-d5，500 MHz） δ： 7.04 （1H，d，J=1.5 Hz，H-2，2′），7.22 （1H，d，J=8.0 Hz，H-5，5′），6.99 （1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-5，5′），4.10 （1H，d，J=11.0 Hz，H-7，7′），3.12 （1H，m，H-8，8′），4.21 （1H，d，J=11.0 Hz，H-9，9′），3.72 （1H，s，OCH3-3，3′）；13C-NMR （pyridine-d5，125 MHz） δ： 134.0 （C-1，1′），117.2 （C-2，2′），147.1 （C-3，3′），149.5 （C-4，4′），123.4 （C-5，5′），114.4 （C-6，6′），36.7 （C-7，7′），45.3 （C-8，8′），62.0 （C-9，9′），56.6 （OCH3-3，3′）。以上数据与文献[13]对照鉴定为3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基-9，9′-单环氧木脂素。
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【摘要】
目的： 应用蛋白质组学方法筛选子痫前期差异蛋白，探讨差异蛋白与子痫前期发生的可能关系. 方法： 收集5例正常足月妊娠妇女和5例足月子痫前期重度患者胎盘母面及宫壁上的蜕膜组织，提取总蛋白. 双向凝胶电泳技术对总蛋白进行分离，考马斯亮兰染色，获得蛋白质图谱. 用 PDQuest软件进行图像分析，寻找差异蛋白，随机选取8个差异蛋白质点进行胶内酶解，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）技术获得肽质量指纹谱，搜寻蛋白质数据库鉴定蛋白质并进行初步分析. 结果： 获得了正常妊娠及子痫前期重度患者蜕膜组织双向电泳凝胶图谱，蛋白质点子痫前期组为（436±13）个点，正常妊娠组为（425±16）个点，图像分析结果显示表达丰度相差2倍以上的差异蛋白质点有14 个，它们在子痫前期中均表现下调. 随机选取的8个蛋白质点均成功得到鉴定，它们分别是膜联蛋白Ⅴ，血红蛋白β链，RhoGDP解离抑制剂1，氯离子细胞内通道蛋白1，原肌球蛋白4，平滑肌蛋白22α2，α1抗胰蛋白酶和纤维蛋白原β链. 结论： 子痫前期重度患者蜕膜组织中存在差异蛋白，这些蛋白质在子痫前期的发病过程可能起重要作用.
【关键词】 先兆子痫；蜕膜；蛋白质组学；电泳，凝胶，双向
【Abstract】 AIM: To screen the differential proteins in deciduas of preeclampsia and to study their roles in preeclampsia. METHODS: The deciduas from 5 normal women of fullterm pregnancy and 5 preeclampsia patients were collected to obtain the total proteins.The proteins from the 2 groups underwent twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) and Coomassie brilliant blue stained gel imaging with PDQuest image analysis software. The peptide mass fingerprinting(PMF) was acquired by matrix assisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS) .The resulted data were then searched against protein databases for the identification of the proteins， and an initial analysis was made accordingly. RESULTS: 2DE patterns of the deciduas of normal fullterm pregnancy group and preeclampsia group were acquired.According to them， (436±13) protein spots were seen in preeclampsia group and( 425±16) in normal pregnancy group.Fourteen differential spots were downregulated in preeclampsia group among them and 8 differential spots were all successfully identified.They were Annexin Ⅴ， Hemoglobin β chain， RhoGDPdissociation inhibitor 1， chloride intracellular channel protein 1，Tropomyosin α4 chain， Transgelin 22α2， α1antitrypsin and Fibrinogen β chain， respectively. CONCLUSION: Differential proteins found in deciduas from patients with severe preeclampsia might play an important role in the pathogenic process of preeclampsia.
【Keywords】 preeclampsia; decidua; proteomics; electrophoresis， gel， twodimensional
0引言
子痫前期（preeclampsia，PE）是一种人类妊娠期间特有的原因不明的多系统疾病，严重危害母婴健康［1］. 蛋白质组学是近年来兴起的一门新学科，因具有高通量的特点而广泛应用于临床. 子痫前期的蛋白质组学研究主要集中在寻找早期特异性蛋白质标志物和发病机制的探讨［2-3］，并运用蛋白质组学技术对子痫前期患者的外周血、脑脊液、羊水和胎盘滋养细胞等进行了各种研究［4］. 但目前子痫前期仍然没有理想的标志物，具体的发病机制仍未阐明. 本实验利用蛋白质组学技术，通过比较子痫前期重度患者和正常妊娠妇女蜕膜的蛋白表达差异，探讨引起子痫前期发生的可能因素，为研究子痫前期的病因和寻找特异性标志蛋白提供依据.
1对象和方法
1．1对象选择 200609/200704在中南大学湘雅第三附属医院产科住院的足月子痫前期重度患者5例（ 诊断及分类参照全国统编教材《妇产科学》第 6 版）为子痫前期组；正常足月妊娠患者5例（无内外科合并症，因臀位和头盆不称）为正常妊娠组. 子痫前期组与正常妊娠组年龄分别为23～34（30.56±3.26）岁和24～31（27.22±2.89）岁，差异无统计学意义（P＞0.05）；分娩孕周分别为35+6～39+2（37.86±2.02） wk和37+2～39+6（38.35±1.89） wk，差异无统计学意义（P＞0.05）. 两组患者分娩方式均为硬膜外麻醉下剖宫产. 在胎盘娩出后即刮取胎盘母面及宫壁上的蜕膜组织，用冰无菌生理盐水冲洗，去除血液及黏液成份并吸干水份，取新鲜蜕膜组织5 g，液氮保存备用. 另取部分蜕膜组织用40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋备HE染色用. 术前静脉抽血3 mL，3000 r/min，离心15 min，取上清液保存备用.
丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠（SDS），四甲基乙二胺（TEMED），过硫酸铵（AP），丙基硫酸盐，三羟甲基氨基甲烷等（美国SigmaAldrich 公司）；胰蛋白酶（美国 Promega 公司）；低温高速离心机（Hettich公司，16R型）；VoyayerDE STR 4307 MALDITOFMS质谱仪（Applied Biosystem 公司）；固相pH胶条（pH 3～10，24 cm），2D Quant Kit蛋白定量试剂盒和双向电泳系统（IPGphor等电聚焦仪，Ettan DALT垂直电泳槽，Imagescanner 图像扫描仪，图像分析软件 PDQuest）为瑞典Amersham Biosciences公司产品.
1．2方法
1.2.1蛋白样品的制备收取的冻存蜕膜组织，经过裂解液裂解、研磨、离心取上清液提取蜕膜组织总蛋白，分装，-70℃保存. 按2D Quant Kit蛋白定量试剂盒操作步骤测蛋白质浓度.
1.2.2双向凝胶电泳第一向固向IPG胶条等电聚焦 ，1000 μg总蛋白质与水化上样缓冲液混合，总体积 450 μL，加入IPG胶槽中，24 cm IPG固向胶条，线性，pH 3～10，IPG phor水平电泳仪电泳. 等点聚焦条件设置： ① 30 V，20℃水化 14 h； ② 500 V/h； ③ 快速升压 1000 V/h， 除盐； ④ 线性升压 8000 V/8.5 h等电聚焦. 胶条在平衡液A液与B液各平衡15 min后胶条移至分离胶上进行第二向电泳即SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳条件如下：恒压，2.5 w/胶，30 min，然后以11 w/胶恒功率电泳， 直至溴酚蓝前沿迁移至凝胶底边停止电泳. 第二向电泳时间约需6 h左右.
1.2.3考马斯亮蓝染色取出电泳后的凝胶，双蒸水清洗后用考马斯亮蓝G250的染色方法进行显色. 染色固定过夜，双蒸水清洗脱色直至背景清晰.
1.2.4图像采集与分析考马斯亮蓝染色后的凝胶通过ImageScanner扫描仪以及LabScan扫描仪控制软件进行图像扫描以获取二维凝胶的电子图像. 运用图像分析软件PDQuest 7.0进行分析， 包括蛋白质点的检测，背景消减，标准化，匹配，建立平均凝胶，比较差异等分析以确立差异表达的蛋白质.
1.2.5蛋白质酶解经过图像分析，随机选取丰度差异表达相差2倍以上的14个点中的8个点做质谱鉴定. 用人工方法切胶，洗胶，脱色，脱水，原位酶解. 然后进行样品萃取，点样.
1.2.6MALDITOFMS质谱分析将制备好的点样板放入VoyagerDE STR 4307 MALDITOFMS质谱仪中进行分析，获得肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting， PMF）.
1.2.7数据库查询MALDITOFMS质谱图解谱采Mascot Wizard软件进行 ，Mascot Wizard软件均采用其默认参数设置. 其查询网址为：matrixscience.com/cgi/searchform.pl?FORMVER=2＆SEARCH=PMF. 在NCBInr，Swissprot蛋白数据库中搜索理论上酶解肽段能与之相匹配的蛋白，结合蛋白质在胶上的等电点和分子量鉴定蛋白质. Mascot分数＞55分则认为得到鉴定，否则视为未得到鉴定.
统计学处理： 采用SPSS 13.0 统计软件进行分析，数据结果以x±s表示，进行t检验，以α=0.05（双尾）为检验水准，P
2结果
2．1蜕膜组织的HE染色经HE染色证实，实验所取子痫前期组与正常妊娠组胎盘母面组织均为蜕膜组织. 大部分典型多边形蜕膜细胞，呈铺砖状排列，未见绒毛（图1）.
图1蜕膜组织HE ×400
2．2蜕膜组织总蛋白质双向电泳图谱 两组蜕膜组织总蛋白在相同条件下进行双向凝胶电泳分离，并重复3次. 图像扫描后，得到重复性好的两组蜕膜组织的双向电泳图谱 （ 图 2）. 子痫前期组图谱检测到（ 436±13）个点， 平均匹配率为79.2%. 正常妊娠组图谱检测到（425±16）个点，平均匹配率为78.6%. 蛋白点主要集中在Mr = 13～80 ku，pH=3～8范围.
A：正常妊娠组蜕膜组织； B：子痫前期组蜕膜组织.
图2蜕膜组织考马斯亮蓝染色图谱
2.3差异蛋白质点的质谱鉴定PDQuest 软件进行图像分析发现，选取丰度差异表达相差2倍以上的蛋白质点有14个，在子痫前期组表达均下调. 随机选择8个差异表达的蛋白质斑点均成功得到鉴定. 图3为子痫前期组和正常妊娠组部分显著差异蛋白点的局部放大图. 黑箭头所指为已鉴定的部分显著差异蛋白质点，其数字代表相应的蛋白质点号. 用Mascot软件搜索蛋白数据库，获得对应的蛋白质(表1).
A：正常妊娠组蜕膜组织；B：子痫前期组蜕膜组织.
图3蜕膜组织部分显著差异蛋白点的局部放大图
3讨论
人体蜕膜组织是母胎界面的重要组成部分，与胎儿滋养层直接接触，具有参与母胎免疫耐受形成及维持妊娠的功能. 在吕英璞等［5］的研究中发现子痫前表1蛋白质点肽质量指纹图谱检索SWISSPROT数据库结果期患者蜕膜组织中Th1/Th2比率明显高于外周血，母胎界面的局部免疫失调，尤其是Th1细胞的过度表达是子痫前期发病的关键环节之一. 本研究选取分娩后的蜕膜组织，能够直接反应该疾病母胎界面存在的蛋白分子变化.
在本研究中，膜联蛋白Ⅴ在子痫前期组中表达明显下调. 膜联蛋白Ⅴ是一种胎盘内抗凝蛋白，对暴露于活化血小板表面的磷脂酰丝氨酸具有高亲和性. 在体内，磷脂酰丝氨酸存在于活化血小板或活化内皮细胞的质膜外层，为凝血因子提供一个聚集进而促发凝集的表面. Tait 等［6］在兔和猪血栓模型中都发现了膜联蛋白Ⅴ的抗凝作用具有血小板指引靶向性. 膜联蛋白Ⅴ这种抗凝蛋白不足很可能是造成子痫前期患者的高凝状态的原因之一. α1抗胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可通过对各种蛋白酶的抑制作用，保护组织免受蛋白酶破坏，从而维持机体内环境稳定. 凝血酶也是一种以丝氨酸为活动中心的蛋白酶. 本研究中发现α1抗胰蛋白酶在子痫前期组中表达下调. 由此我们推测由于α1抗胰蛋白酶这种凝血酶抑制剂分泌不足导致凝血酶增高从而参与了子痫前期患者高凝状态的发生发展. RhoA属于Rho家族蛋白的Rho亚家族成员，是重要的细胞内信号分子. 它能结合并水解鸟苷酸，结合GTP为活性型，结合GDP为失活型. 有研究［7］表明RhoA可能通过调节滋养细胞浸润、低氧反应及血管舒缩功能等参了与子痫前期的发病. 本研究发现RhoGDP解离抑制剂1在子痫前期中表达下调，相应解离的RhoA将增加，活性RhoA就应在子痫前期中高表达，这与其他研究结果理论上是一致的. 纤维蛋白原β链是由肝合成和分泌的一种糖蛋白，其转录被认为是整个纤维蛋白原分子表达的限速步骤， FgBβ基因多态性单独或与环境因素作用使循环中的血浆纤维蛋白原水平升高，在调节血浆纤维蛋白原水平方面起重要作用［8］ . 本研究结果显示这些蛋白在子痫前期组表达均下调，它们在子痫前期中的作用以及本实验中的2DE图谱蛋白质点并不是很多，如对样品采用预分级和亚蛋白质组重叠技术有助于低丰度等功能蛋白的检出等问题还有待我们进一步探讨.
【参考文献】
［1］Koy C， Heitner JC， Woisch R， et al. Cryodetector mass spectrometry profiling of plasma samples for HELLP diagnosis: An exploratory study［J］. Proteomics， 2005，5(12):3079-3087. ［2］Norwitz ER， Tsen LC， Park JS， et al. Discriminatoryproteomic biomarker analysis identifies free hemoglobin in the cerebrospinal fluid of women with severe preeclampsia［J］. Am J Obstet Gynecol， 2005，193(3)957-964.
［3］Vascotto C， Salzano AM， DAmbrosio C， et al. Oxidized transthyretin in amniotic fluid as an early marker of preeclampsia［J］. Clin Chem，2007，6(1):160-170.
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［5］吕英璞，张文真，卢小燕，等. 辅助性T淋巴细胞1和2比率变化与妊娠期高血压疾病发病的关系［J］. 中华妇产科杂志，2006，2 (41):103-107.
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［7］周丽，乔福元. RhoA在子痫前期患者胎盘中的表达［J］. 现代妇产科进展，2006，15(12):925-927.
妊娠期高血压疾病(pregnancyinducedhyper-tension)是妊娠期特有疾病，包括妊娠期高血压，子痫前期(轻度、重度)，子痫，慢性高血压并发子痫前期和妊娠合并慢性高血压。西方国家其发病率为7%～10%，我国发病率约为9．4%，多发生于妊娠20周以后至产后24h内［1］。多数病例妊娠期出现一过性的高血压、蛋白尿等症状，分娩后随即消失。病情严重者出现重度低蛋白血症、肝肾功能损害、胎盘早剥、HELLP综合征及子痫;此外，子宫血管痉挛引起胎盘供血不足、胎盘功能减退，导致胎儿宫内生长发育受限、胎儿窘迫、胎死宫内、死产或新生儿死亡，严重危害母婴健康［2］。由于其病因学不明，检测技术有限，目前尚无特异性血清标志物作为重度子痫前期筛查的指标。基于上述状况，我们设计了以筛选子痫前期重度患者和健康对照组孕妇血清标志物为目标的差异蛋白质组学研究。采用双向凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)分离子痫前期重度患者和健康对照组孕妇血清蛋白质，图像分析软件识别差异蛋白质点，应用电喷雾串联质谱(ESI-Q-TOFMS/MS)鉴定两者的差异蛋白质，然后应用Westernblot检测差异蛋白质—P物质(substanceP，SP)在两者血清中的表达，进一步探讨P物质的临床应用价值。
1资料与方法
1．1一般资料病例组为安徽医科大学第一附属医院产科收治的8例子痫前期重度患者，年龄18～30岁，平均24岁，孕33～37周。8例患者中，初产妇5例，经产妇3例;均为单胎;均有不同程度的头昏、头痛、浮肿(+++～++++)，其中2例视物模糊;血压(165～190mmHg)∕(112～140mmHg)，尿蛋白(++～++++)，24h尿蛋白定量3．7～11．2g;2例胎盘早剥，1例HELLP综合征，这3例均伴有DIC。所有患者的诊断均符合《妇产科学》第7版［1］诊断标准，并排除影响血清蛋白质含量的其他相关疾病，如:妊娠合并慢性高血压、慢性肾炎、肾病综合征、胎膜早破、脑炎及其他血管性病变等。对照组为8例健康孕妇，其胎数、孕周及年龄与病例组相匹配，均无头昏、头痛、浮肿及视物模糊，血压及尿蛋白均正常。
1．2主要仪器及试剂低温高速离心机(Beckman)，水浴恒温振荡器(金华仪器)，紫外分光光度计(北京通用)，Mi-croQ-TOF质谱仪(Micromass)，PDquest二维凝胶图谱分析软件(Bio-Rad);尿素(urea)，硫脲(thiourea)，三羟甲基氨基甲烷［tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris］，赖氨酸(ly-sine)，银染试剂，辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG二抗及ECL发光剂等。
1．3方法
1．3．1样本收集和预处理采集病例组和对照组空腹静脉血4ml，室温下静置凝固30min，待血清析出，吸出血清以2000r/min、4℃离心10min，取上层血清，分装后置于－80℃冰箱中保存备用，至双向电泳前融化，避免反复冻融。取出血清样品，置冰盒上溶解。病例组8例各取50μl，等体积混匀，共400μl，分装为15μl/管及50μl/管备用;按上述方法预混8例对照组血清。采用试剂盒AlbuminandIgGRemovalkit(GEHealthcare)去除高丰度蛋白。
1．3．2蛋白浓度测定、双向凝胶电泳、银染采用GEHealthcare公司专门设计、针对蛋白质组学研究的蛋白质抽提试剂盒，即2D-quantkit蛋白定量试剂盒。其基本原理是:将蛋白沉淀后，去除裂解液，再用含铜离子的溶液重溶蛋白质沉淀，未与蛋白质结合的铜离子可与显色工作液反应并显色，显色深浅与蛋白质浓度成反比。第一向固相pH梯度等电聚焦(IEF)，等电聚焦后迅速取出IPG胶条先后置于10ml平衡A液(6mol/LUrea、50mmol/LTris-HCLpH8．8、0．2%DTT、30%甘油、1%SDS、痕量溴酚蓝)和10ml平衡B液(6mol/LUrea、50mmol/LTris-HCLpH8．8、碘乙酰胺、30%甘油、1%SDS、痕量溴酚蓝)中，摇床上摇振，各平衡15min。将平衡后的胶条移至厚0．75mm、浓度为12．5%的PAGE分离胶上端，排净气泡后用溴酚蓝+0．5%琼脂糖封胶。将胶条包埋于二向胶中，加1×buffer电泳液，开始电泳。电泳条件:2．5W/胶电泳30min，然后以11W/胶恒功率电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处，停止电泳。完成后取出，银染。染色好的凝胶可暂时保存于超纯水中，待扫描。
1．3．3凝胶图像分析凝胶经Imagescanner扫描仪及Lab-Scan扫描软件扫描并获取图像(分辨率为300dpi，图像和凝胶大小比例为1∶1)，再用PDquest图像分析软件一次进行点检测、背景消减、标准化、匹配、建立平均凝胶、比较差异等分析，找出差异蛋白质点。
1．3．4质谱样品制备及分析由上海第二军医大学遗传教研室协助完成。
1．3．5数据库检索采用MicroMass公司的Mascot软件解谱ESI-Q-TOF质谱图，从原始MS-MS谱中产生PKL格式的数据文件。然后用MascotScience公司的站点查询数据库，取蛋白得分＞55分，置信水平95%。1．3．6Westernblot包括制胶，电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育，ECL试剂发光、显影、定影等。
1．4生物信息学软件LabScan扫描软件，Pdquest二维凝胶图谱分析软件，MascotMS/MS数据库查询软件等生物信息学软件。
2结果
2．1血清双向凝胶电泳图谱和图像分析结果应用2-DE技术分离病例组和对照组孕妇血清总蛋白(上样量约120μg)，经银染后，得到双向凝胶电泳图谱。为保证结果的可靠性，相同条件下重复试验3次，每组各获得3张双向凝胶电泳图谱。采用PDquest双向凝胶电泳图像分析软件分析凝胶图谱，通过选择最弱点、最小点及最强点，自动过滤背景后，将识别获得的蛋白质点的面积、灰度等数据拟合成一张新的凝胶，在拟合凝胶图谱基础上匹配分析两组凝胶。结果显示:子痫前期重度患者血清图谱平均蛋白点数为219±5，健康孕妇血清图谱平均蛋白点数为213±8，匹配率为(97．2±1)%。与健康孕妇血清图谱比较，子痫前期重度患者血清图谱共有8个差异点。病例组中表达下调的点为1、2、3，其它点均表达上调，见图1。
2．2差异蛋白质点的鉴定从凝胶中切取8个差异蛋白质点，行ESI-Q-TOFMS/MS质谱分析，通过Mascot查询NCBI数据库，蛋白得分至少＞55分的结果才具有意义(P＜0．05)。结合双向凝胶电泳得到相应蛋白质点的表观分子量、等电点等可能的蛋白质信息。最终鉴定了3个蛋白质点，属于3种不同蛋白质，即凝血酶(thrombin)、P物质及血清白蛋白(albumin)。差异蛋白质的详细信息见表1。
2．3Westernblot检测血清中P物质表达情况2-DE联合质谱分离鉴定子痫前期重度患者和健康孕妇血清差异蛋白质的结果显示，病例组P物质表达水平明显低于对照组。提示P物质可能具有临床应用价值。为此，采用Westernblot检测两者血清中P物质表达，结果显示:病例组患者血清中P物质表达水平显著低于对照组(P＜0．05)，与质谱分析结果相同。见图2。
3讨论
双向凝胶电泳图谱及质谱分析结果显示，子痫前期重度患者血清中凝血酶、P物质及血清白蛋白表达均较健康孕妇下调，且以P物质表达差异最明显。提示P物质可能对该病的诊断具有一定意义，为揭示该病的发病机理提供了相应的依据。因为上述表达差异蛋白涵盖了急性期反应蛋白、凝血功能、补体调节、细胞外基质重构、运输蛋白等，均参与了重度子痫前期的发生发展。
3．1凝血酶它由凝血酶原在凝血因子Ⅹ和Ⅴ等共同作用下转变而成，是人体凝血功能的核心，具有诱导血小板集聚、激活蛋白C系统、反馈激活凝血因子生成更多的凝血酶等功能，通过引起血栓，达到止血目的，这对胎盘附着部位的止血有保护意义，但同时也使孕妇处于易发生血栓的高危状态。攻博等［3］研究提示，凝血酶生成活性随妊娠期高血压疾病病情的加重而上升，重度子痫前期尤为明显，但伴发DIC时，凝血酶生成明显低于其他各受检组，提示DIC发生后患者处于明显的低凝和纤溶活性相对低下的状态。本研究提示，病例组中凝血酶表达下调，与上述结果不尽相同，可能与所选患者病情严重且伴有凝血功能障碍有关。
3．2P物质SP是具有血管扩张作用的神经肽，其作为神经递质，参与神经调节，通过内分泌或旁分泌因子起作用，直接作用于血管平滑肌，引起血管舒张，血压降低［4］。目前研究认为，正常妊娠和妊娠期高血压疾病均存在炎症反应激活现象，妊娠期高血压疾病表现为过度激活。在炎症反应方面，SP起重要作用，参与多种炎症过程，包括中性粒细胞激活［5］、细胞因子生成及黏附分子上调等［6，7］;另外，SP还可激活肥大细胞，引起胞内钙离子动员和细胞脱颗粒，释放组胺［8］，加重炎症反应，导致炎症恶化［9］。妊娠期高血压疾病患者，机体失去代偿能力，SP抑制肾上腺髓质儿茶酚胺的合成与释放，对抗去甲肾上腺素引起的缩血管作用减弱;同时，SP促进前列腺素(PGE)和一氧化氮(NO)合成与释放的作用减弱［10］，血浆中PGE和NO等舒张血管的物质水平显著降低。妊娠期高血压疾病患者全身小动脉痉挛，血管缺血缺氧等变化使血浆中内皮素、血管紧张素等缩血管物质明显增加，血管收缩与舒张的调节处于失衡，加剧了血管痉挛，进而累及心、肝、肾、脑等重要脏器，影响胎儿-胎盘血液供应，产生高血压、水肿、蛋白尿、血液浓缩和胎儿生长发育迟缓等，甚至危及孕产妇及围产儿的生命。周丰等［11］的研究发现，正常妊娠期妇女血清SP低于非妊娠期妇女。罗湘闽等［12］的研究也发现，妊娠期高血压疾病患者血浆SP水平降低，随病情加重其下降程度愈显著，它可以反应妊娠期高血压疾病的病情发展变化。本研究也提示，子痫前期重度患者血清中SP表达下调。故作为生化指标，SP水平下降也有望成为重度子痫前期患者的诊断依据。