时间：2023-11-09 18:33:32
关键词 QuEChERS方法； 在线； 凝胶渗透色谱； 气相色谱-串联质谱； 烟叶； 农药残留
1 引 言
为了防治病虫害，烟草在育种、种植、调制和保存期间要使用农药。残留农药会降低烟叶质量，加剧环境污染， 并威胁人类和其它生物的健康[1]。因此，烟叶中的农药残留检测对保证烟叶质量和环境安全具有重要意义。由于烟叶样品基质复杂，其中残留农药含量低（低至ng/g级），因此通常需要样品预处理过程才能进行后续测定[2]。目前，液-液萃取[3]、固相萃取[4]、固相微萃取[5]等方法已用于烟叶中农药残留测定。这些方法存在有机溶剂消耗量大、操作繁冗费时、回收率低等不足。Anastassiades等[6]开发了“快速、简便、经济、高效、耐用且安全（Quick， easy， cheap， effective， rugged and safe， QuEChERS）”的样品前处理技术。QuEChERS方法具有回收率高、稳定性强和被分析目标物范围广等优点，因此在农药残留检测中广泛应用[3]。常规QuEChERS方法在净化步骤中通过离心或过滤将吸附剂与样品液分离，耗时费力。为了克服这一缺陷，本研究组以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基键合硅烷/四氯化三铁（GCB/PSA/Fe3O4）复合材料为吸附剂，改进了QuEChERS方法[7]，吸附剂可以在磁场作用下与提取液快速分离，具有操作简单、快速高效的优点。
在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱（GPC-GC-MS）是将凝胶渗透色谱和气相色谱-质谱在线联用的分析检测技术，不但具有抗基质干扰能力强、灵敏度高的优点，而且可以连续自动分析，能提高分析速度和结果的准确性，已被应用于农药残留检测[8～10]。本研究采用改进QuEChERS方法对烟叶样品前处理，以在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱（GPC-GC-MS/MS）检测，选取烟草种植生产中对烟叶质量和烟草制品产品安全有影响的常用10种除草剂、抑芽剂和杀虫剂为代表性化合物，建立了烟叶中农药残留量的快速、准确、灵敏分析方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
在线GPC-GC-MS/MS系统（日本岛津公司），GPC配有LC-20AD泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，DGU-20A3R脱气机和SPD-20A紫外检测器；GC-MS/MS包括日本岛津2010-plus气相色谱和TQ 8030三重四级杆质谱，由FCV-12AH电磁阀实现GPC和GC-MS/MS的在线连接。用Quanta 200 扫描电镜（Quanta 200，FEI，Holland）对材料形貌进行表征。
环己烷和丙酮（色谱纯，韩国德山纯化工有限公司）。所用水由Milli-Q系统（Milford， MA， USA）制得。10种目标物和内标（磷酸三苯酯）均购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司，以甲苯（必要时添加丙酮或甲醇）为溶剂配制目标物母液（100 μg/mL）。混合标准工作溶液（内标浓度为20 ng/mL）以甲苯配制，并在-20℃下避光保存。采用溶剂热方法制备Fe3O4[7]：在200 mL反应釜内将5.0 g FeCl3・6H2O 溶解在100 mL 乙二醇中并搅拌得到澄清溶液，再加入15.0 g NaAc 和50 mL乙二胺，搅拌30 min，将反应釜于200℃下反应8 h。待反应釜降温后，用水和乙醇清洗产物， 60℃下干燥，备用。制备磁性吸附剂时，将0.4 g GCB、 0.5 g PSA和1 g Fe3O4置于15 mL具盖玻璃瓶内，用5 mL乙腈清洗3次后，将产物在60℃下干燥即可。
2.2 仪器条件
GPC条件：色谱柱为Shodex CLNpak EV-200（150 mm × 2 mm，16 μm）；柱温为40℃；流动相为环己烷-丙酮（70∶30， V/V）；流速0.1 mL/min；进样量10 μL；GPC收集时间为3.30～5.30 min；GC-MS/MS条件：惰性前置柱5 m × 0.53 mm空柱；预柱DB-35 ms（5 m × 0.25 mm × 0.25 μm），分离柱DB-35 ms（25 m × 0.25 mm × 0.25 μm），柱温箱程序：初始温度82℃，保持5.0 min，再以8℃/min升至300℃，保持7.75 min；不分流进样，进样时间7.0 min；高纯He为载气，压力程序：由120 kPa开始，以100 kPa/min升至180 kPa，保持4.4 min，再以49.8 kPa/min恢复至原始压力，保持33.8 min；程序升温进样口程序：120℃保持5 min，以100℃/min升至250℃，保持33.7 min；接口和离子源温度为300℃和200℃；电离源为EI源；电离电压70 eV；溶剂延迟时间15 min；目标物及内标的多反应监测（MRM）参数如表1所示，碰撞气为Ar，压力200 kPa。
2.3 样品制备
本研究建立烟叶提取液快速净化和检测的方法，因此直接采用文献＼[2＼]报道的方法提取烟叶： 称取2.00 g 烟叶于离心管中，加入10 mL水浸润样品；静置10 min后加入10 mL 乙腈和100 μL 内标溶液，振荡2 min；于-20℃下保持10 min后加入5 mL甲苯、4 g 无水Na2SO4、1 g NaCl＼， 1 g柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠，振荡2 min后离心5 min，收集上层提取液；提取液的净化和检测方法为：取0.5 mL提取液到装有磁性吸附剂的离心管中，振荡1 min；在磁场下将磁性吸附剂与溶液分离，所得溶液为待测液，可进行在线GPC-GC-MS/MS分析。将不含目标物的净化液浓缩吹干，再加入相同体积、不同浓度的系列标准工作溶液，混匀溶解即得到基质匹配标准曲线。
3 结果与讨论
3.1 磁性吸附剂的表征
如图1a所示， PSA表面光滑，而磁性吸附剂中PSA表面粗糙（图1b），且在PSA颗粒之间也有材料均匀分布，观察是GCB和Fe3O4颗粒（图1c）。Fe3O4能使吸附剂在磁场作用下与样品溶液快速分离，同时PSA和GCB能分离提取液中的杂质。
3.2 GPC收集时间考察
图2为在线GPC-GC-MS/MS系统的示意图。其原理为：样品经GPC柱分离，废液直接排出系统，含有目标物的馏分先被储存在定量环（0.2 mL）中，再全部注入GC。注入GC的样品通过打开溶剂蒸气出口实现溶剂的排出，同时目标分析物在保留在预柱中。待溶剂排出口关闭后柱，温箱开始升温，目标物进入分析柱分离。因此选择收集时间显得尤为重要。目标物的分子量在溴氰菊酯和灭螨蜢之间，因此目标物在GPC上的保留时间也介于二者之间，二者在GPC上的保留时间为3.50和5.08 min。考虑灵敏度和基质去除效果，确定收集时间为3.30～5.30 min。
3.3 改进QuEChERS方法的优化
为了得到较好的净化效果，优化了磁性吸附剂的用量和净化时间（GCB、PSA和Fe3O4之间的质量比为4∶5∶10）。如图3a所示，随着吸附剂用量增加，提取液的颜色由黄色逐渐变为近无色，当吸附剂用量达到80 mg时，继续增加用量对净化效果改善不大。且在考察的范围内，各目标物的峰面积没有变化，这可能是因为在烟叶提取液中含有甲苯，使吸附剂与含苯环目标物之间的相互作用力减弱而引起的。考虑净化效果和吸附剂用量，将吸附剂的用量定为80 mg。在0.5～6.0 min范围内，净化时间对净化效果影响不大，且目标物的峰面积没有变化，这是因为吸附剂在净化时是分散的，可以使吸附快速达到平衡，因此净化时间对净化效果没有太大影响。为了稳定净化效果，净化时间选取1.0 min。
比较了本方法与常规QuEChERS方法的净化效果，如图3b所示，未经净化的烟叶提取液颜色为黄色，经过常规QuEChERS方法净化后，提取液颜色变浅；经过本方法净化后，提取液几乎无色（Ⅲ）。因此，本方法对色素等杂质的去除效果较好。
3.4 方法确认
在优化条件下，考察了方法的检出限、定量限、线性范围和重现性。检出限和定量限为目标物信噪比为3和10时对应的浓度。以目标物浓度及其与内标峰面积之比为横、纵坐标，绘制工作曲线。如表2所示，10种目标物的检出限在0.94～100 ng/L之间，定量限在3.1～34 ng/L之间，线性相关系数R2≥0.9989。本方法提取烟叶的结果与标准方法[11]相同，其中9种目标物（甲氰菊酯除外）的检出限为40～600 ng/L。本方法能显著提高灵敏度，是由吸附剂降低基质干扰和在线GPC-GC-MS/MS提高进样量引起的。
为了考察本方法的重现性，配制3种浓度（各目标物线性范围最低值的2、10和100倍）的样品，以一天内配制的4个样品和连续3天配制的样品进行分析，计算日内和日间相对标准偏差。如表3所示，目标物的日内及日间精密度分别小于15.1%和19.8%，其中目标物在中浓度和高浓度下的日内及日间精密度数值不高于8.5%，低浓度下的日内及日间精密度数值相对较高，这可能是由于测定误差引起的。美国分析化学家学会（Association of Official Analytical Chemists， AOAC）提出[12]，可接受的精密度数值随着分析物的浓度或含量降低而升高。本研究中目标物在低浓度（1.52～4.00 μg/L）下的精密度数值低于21%（目标物浓度为10 μg/L时所能接受的精密度数值），说明本方法的重现性可以接受。
3.5 实际样品分析
为了证明本方法在实际样品中应用的效果，采用本方法和现行标准方法[11]处理3种烟叶样品并进行测定。在样品A中测到了七氟菊酯、二甲戊灵和联苯菊酯，采用本方法和标准方法均无法对其进行定量分析；在样品B中测到了七氟菊酯，两种方法的测定结果为1.06和1.03 μg/L，对氟节胺和联苯菊酯均无法进行定量分析；在样品C中测到了仲丁灵、二甲戊灵和氟节胺，两种方法的测定结果为92.1和92.7 μg/L、108.2和112.2 μg/L以及3.68和3.70 μg/L，对七氟菊酯也均无法进行定量分析。结果表明，本方法与标准方法[11]的检测结果相吻合。样品C中测到的目标物数目最多，给出了其中被测到目标物的典型色谱图。如图4所示，目标物均不存在干扰。同时，对净化前的烟叶提取液直接进行在线GPC-GC-MS/MS分析，检测结果与以上两种方法不存在显著性差异：在样品B中测到了七氟菊酯，其浓度为1.01 μg/L；在样品C中测到了仲丁灵、二甲戊灵和氟节胺，其浓度为92.8， 110.2和3.81 μg/L。
将上述3种样品加标后用本方法测定，将所测量与实际加标量相比得到相对回收率。如表4所示，目标物的相对回收率在68.8%～132.2%之间，不同实际样品中目标物在不同浓度下的回收率相差较大，可能是因为不同产地烟叶样品的基质差异引起的。使用气相色谱-串联质谱检测烟叶中的农药残留时，基质增强效应和基质抑制效应同时都存在[13]，其中含有氨基的极性农药化合物在气相色谱分析时主要表现为基质增强效应（如二甲戊灵和联苯菊酯，回收率最高为132.2%），但含有同一功能基团的化合物由于理化特性的差异所呈现的基质效应也会有较大差别（如七氟菊酯，回收率最低为68.8%），而且同一化合物在不同浓度水平和样品基质下产生的基质效应程度也不尽相同（如甲氰菊酯）[14]。
4 结 论
采用磁性吸附剂净化烟叶提取液，再用在线GPC-GC-MS/MS检测，优化了在线GPC-GC-MS/MS条件和影响净化效果的因素，在最佳的条件下建立了烟叶样品中10种农药残留量的测定新方法，并用于实际烟叶样品的测定。由于磁性吸附剂可以在磁场作用下实现快速回收，且在线GPC-GC-MS/MS系统可以提高进样量。与现有标准方法[11]相比，本方法具有样品前处理过程操作简单、净化能力强、灵敏度高等优点，为日常烟叶样品中农药残留量的测定提供了一种可选择的方法。
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关键词：活血止痛凝胶贴膏；微乳；醇质体；透皮试验；抗炎；镇痛
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.018
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0070-06
活血止痛膏由干姜、陈皮、丁香、胡椒、荆芥、牡丹皮、水杨酸甲酯等28味中药组成，具有活血止痛、舒筋活络功效，主治筋骨疼痛、肌肉麻痹、痰核流注、关节酸痛[1]。原剂型为橡胶膏剂，上市多年，疗效确切，被广泛使用。由于橡胶膏剂透气性差、易致敏[2]，故将其改为凝胶贴膏。活血止痛膏处方均含有挥发油等脂溶性成分，而凝胶贴膏是以水溶性高分子材料为基质的外用贴剂，为保证处方药与基质的高度融合，提高制剂稳定性，本研究以凝胶贴膏为载体，微乳/醇质体[3-5]为释药系统，制备复合型纳米经皮给药制剂，在解决脂溶性成分与水溶性基质相容性的同时，利用微乳、醇质体纳米化的优势，促进药物经皮渗透。以方中脂溶性成分丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯为定量指标，考察体外经皮渗透特性和对药效的影响，评价微乳、醇质体在中药复方经皮给药制剂中应用的可行性。
1 仪器、试药与动物
Waters Acquity HPLC H-Class Core System超高效液相色谱仪，BSA224S CW型子分析天平（德国赛多利斯公司），TK-20B型Franz扩散池（上海锴凯有限公司），透析袋（截留相对分子质量7000，北京经科宏达生物技术有限公司），Z92-BD多功能搅拌器（天津利华仪器厂）。
活血止痛凝胶贴膏（自制，批号160615），微乳活血止痛凝胶贴膏（自制，批号160626），醇质体活血止痛凝胶贴膏（自制，批号160626）；丹皮酚对照品（批号D-002-140728）、丁香酚对照品（批号D-064-140728）、水杨酸甲酯对照品（批号S-018-150728），成都瑞芬生物科技有限公司；甲醇、乙腈为HPLC级（美国，Fisher公司），水为屈臣氏蒸馏水，冰醋酸（北京化工厂，批号20150704），伊文思蓝（上海化学试剂厂，批号030712），其余试剂均为分析纯。
昆明种小鼠，雄性，透皮试验小鼠体质量14～16 g、4～5周龄，药效学试验小鼠体质量20～22 g、6～7周龄，中国人民军事医学科学院实验动物中心，饲养于SPF级动物房，动物许可证号SCXK（军）2012-0004。
2 方法与结果
2.1 方法学考察
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯对照品适量，置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成浓度分别为1.48、8.92、18.2 mg/L的混合对照品储备液。精密量取该储备液1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 取活血止痛凝胶贴膏体外透皮接收液，过0.20 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.1.3 阴性对照溶液的制备 取凝胶贴膏空白基质体外透皮接收液，过0.20 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.1.4 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Acquity UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～4 min，10%～90%A）；检测波长：280 nm，柱温：30 ℃，流速：0.6 mL/min。在上述色谱条件下，对照品溶液、供试品溶液中丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯均分离良好，阴性对照溶液无干扰。
2.1.5 线性关系考察 取混合对照品溶液3 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，进样1 ?L，再将混合对照品储备液分别进样0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 ?L，按“2.1.4”项下色谱条件进样，测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯的峰面积，并以各成分的进样质量（ng）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果显示，3种待测成分在确定的线性范围内线性关系良好，见表1。
2.1.6 日内精密度试验 分别精密吸取2、1、12 h接收液，为高、中、低浓度，于1 d内连续进样6次，分别测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯峰面积，结果显示各成分RSD均在3%以下，表明仪器精密度良好，见表2。
2.1.7 日间精密度试验 分别精密吸取2、1、12 h接收液，为高、中、低浓度，于3 d内每日分别连续进样6次，分别测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯峰面积，结果显示各成分RSD均在3%以下，表明仪器精密度良好，见表2。
2.1.8 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24、48 h进样，测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯峰面积，结果RSD分别为1.4%、1.2%、0.24%，表明供试品溶液在48 h内稳定，见表2。
2.1.9 重复性试验 精密吸取6份供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中，分别测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯含量，RSD分别为1.3%、1.6%、1.2%，表明方法的重复性良好。
2.1.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的接收液5 mL，按样品含量∶对照品加入量大致为1∶1比例加入丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯混合对照品溶液，加甲醇定容至10 mL，按“2.1.4”项下色谱条件进行测定，结果丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯的平均加样回收率分别为98.44%、102.33%、101.93%，RSD分别为1.68%、0.65%、1.90%，表明方法的准确度良好，结果见表3。
2.2 凝胶贴膏基质的制备
2.2.1 活血止痛凝胶贴膏的制备 精密称取处方量活血止痛浸膏和凝胶贴膏基质，混合均匀，制成膏体后均匀涂布于衬布上，加盖聚乙烯薄膜，即得活血止痛凝胶贴膏样品。活血止痛浸膏中丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯含量分别为1.42、11.19、125.36 mg/g浸膏。
2.2.2 微乳活血止痛凝胶贴膏的制备 按处方比例称取活血止痛浸膏、樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲酯与适量中链甘油三酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和丙二醇，按微乳制备工艺混合，使药物溶解完全，于室温采用磁力搅拌器边搅拌边加入处方量的水至澄清透明，即得O/W型载药活血止痛微乳，用载药微乳溶胀辅料混合均匀，制成膏体后均匀涂布于衬布上，加盖聚乙烯薄膜，即得微乳活血止痛凝胶贴膏样品。
2.2.3 醇质体凝胶贴膏的制备 采用注入法制备活血止痛醇质体，称取处方量冰片、樟脑、薄荷脑、水杨酸甲酯加入胆固醇、磷脂、表面活性剂和维生素E油，注入一定量的乙醇，在密闭、温度35 ℃、磁力搅拌条件下溶解完全后，将纯水缓慢加入乙醇溶液中，持续搅拌5 min，搅拌结束后将醇质体放至室温，经0.20 μm微孔滤膜过滤，得醇质体。将醇质体与其他药材醇提物混合均匀，即得醇质体浸膏。称取处方量醇质体浸膏和基质，混合均匀，制成膏体后均匀涂布于衬布上，加盖聚乙烯薄膜，即得醇质体活血止痛凝胶贴膏样品。
2.3 体外经皮渗透试验
2.3.1 离体鼠皮的制备 小鼠断颈处死，适量脱毛剂脱去鼠毛，生理盐水冲洗干净，剥离皮肤，去除脂肪层、筋膜，置于生理}水中，选取完整无破损皮肤。
2.3.2 经皮渗透试验 采用Franz扩散池，将活血止痛凝胶贴膏、微乳活血止痛凝胶贴膏、醇质体活血止痛凝胶贴膏分别设为A、B、C组，每组精密称取凝胶贴膏0.500 g/份，平行5份。将鼠皮固定在扩散池与接收池之间，扩散面积为3.14 cm2，接收液为PEG400-95%乙醇-生理盐水（1∶3∶6），磁力搅拌转速为350 r/min，控制温度为（32±0.2）℃，计时，分别于1、2、4、8、12、24 h时间点将接收液全部取出，同时补加同体积的新鲜接收液。将接收液作为供试品溶液，过0.20 μm微孔滤膜，采用超高液相色谱法（UPLC）测定供试品中丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯的含量，分别按照公式计算其累计透过率（Q）。
Q=[∑_（i=1）^C_i ]×V/W×100。式中，Ci为第i个时间点样品的质量浓度，V为每次取样的体积，W为所取凝胶贴膏样品中待测成分的含量。以Q对透皮时间（t）作图，绘制体外透皮曲线。
凝胶贴膏、微乳凝胶贴膏和醇质体凝胶贴膏丹皮酚24 h累计透过率（Qp）分别为65.30%、61.30%、60.20%，丁香酚24 h累计透过率（Qe）分别为51.08%、54.71%、55.66%，水杨酸甲酯24 h累计透过率（Qm）分别为49.20%、65.17%、72.15%。不同释药载体的3种成分中只有水杨酸甲酯24 h累计透过率微乳/醇质体凝胶贴膏具有明显优势，见图5。
3 讨论
凝胶贴膏、微乳凝胶贴膏和醇质体凝胶贴膏丹皮酚24 h累计透过率分别为65.30%、61.30%、60.20%，丁香酚24 h累计透过率分别为51.08%、54.71%、55.66%，经t检验，二者组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）；水杨酸甲酯24 h累计透过率分别为49.20%、65.17%、72.15%，凝胶贴膏与醇质体凝胶贴膏组间比较P
从药效试验结果可以看出：不同释药载体的活血止痛膏贴均能不同程度降低由化学刺激引起的腹腔疼痛，减少小鼠扭体次数，提高扭体反应抑制率；且微乳凝胶贴膏大剂量组、醇质体凝胶贴膏中剂量组对减少小鼠腹腔内毛细血管的炎性渗出、降低毛细血管通透性具有较好作用（P
将活血止痛膏制成纳米释药载体，增加了药物在整个体系中的溶解度[12-13]，药物以分子形式容易透过皮肤。同时，微乳或醇质体将脂溶性成分转化为水溶性，在解决水性凝胶与之相容性并提高了制剂稳定性的同时，又利用微乳和醇质体在经皮渗透中的优势使药物透过皮肤。因此，采用纳米复合载药释药系统，凝胶贴膏中有效成分透过皮肤屏障的能力更优[14]，本研究也为中药复方外用制剂的开发提供了新思路。
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（收稿日期：2016-09-23）
【关键词】 体外透皮试验
摘要:目的 考察透皮吸收促进剂对甲氧沙林脂质体(lmop)凝胶体外透皮作用的影响。方法 分别制备无透皮促进剂的lmop凝胶及以1%(ω)氮酮和1%(ω)丙二醇为透皮吸收促进剂的lmop凝胶。采用franz扩散池，以离体小鼠皮肤为透皮屏障，用高效液相色谱法测定体外接受液中甲氧沙林(8-mop)的含量，计算其累积透皮释药量（q），并将数据进行释放动力学模型拟合。结果 样品凝胶体外释药符合higuchi方程，不含透皮吸收促进剂的lmop凝胶：q = 79.65 t1/2+ 27.99；含透皮吸收促进剂的lmop凝胶：q = 117.39 t1/2+ 34.37，显示后者的渗透作用更好。结论 以1%(ω)氮酮和1%(ω)丙二醇为透皮吸收促进剂的脂质体凝胶的透皮渗透效果更佳。
关键词:甲氧沙林；脂质体凝胶；透皮吸收促进剂；体外透皮试验
abstract: objective to evaluate the effects of skin permeation enhancers,1% (ω)azone and 1% (ω)propylene glycol,on transcutaneous absorption of 8methoxypsoralenliposome gel. methods gels of 8methoxypsoralenliposome with and without skin permeation enhancers were prepared. a piece of excised abdominal hairless mouse skin was set in a franztype diffusion cell. penetration of 8methoxypsoralen was detected by hplc and cumulative permeation (q) calculated and simulated in pharmacokinetics model. results the drug release and permeation studies in vitro in franz diffusion cell followed the higuchi equation with optimum correlation coefficient. for the gel without enhancers,equation was as following:q=79.65t1/2+27.99; for the gel with enhancers,equation was as following:q=117.39t1/2+34.37. conclusions 8methoxypsoralenliposome gel with 1%(ω) azone and 1%(ω) propylene glycol has a higher permeation rate than the gel without enhancers.
key words:8methoxypsoralenliposomal gel; skin permeation enhancer; transcutaneous absorption in vitro
甲氧沙林（8methoxypsoralen，8mop）为治疗白癜风的国家基本药物。临床上应用的片剂、酊剂等传统剂型在长期使用后，易产生较严重的不良反应［1］。实验已证实［2］，甲氧沙林脂质体（methoxypsoralen liposome， lmop）凝胶剂以其可生物降解、皮肤靶向性强的特点，可减少药物全身吸收所带来的不良反应，具有较好的皮肤靶向性和缓释作用，且对实验性白癜风疗效明显优于同剂量的8mop酊剂及普通凝胶剂。
皮肤角质层是药物经皮吸收的主要屏障和限速部位,但脂质体能否顺利完全的透过皮肤角质层目前仍存有疑问［3］。而透皮促进剂能够增加药物的经皮渗透能力，减少时滞，提高药物生物利用度。因此，本文根据预试验结果并参考有关文献［4,5］，将氮酮(azone，az)和丙二醇(propylene glycol，pg)按1∶1（质量比）的比例混合，研究其对lmop凝胶经皮渗透性的影响，为进一步完善lmop凝胶制剂提供实验依据。
1 仪器、药品与材料
1.1 仪器
agilent 1100 series高效液相色谱仪（美国hpchem）；re―52c型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；j―250型水循环真空泵(河南巩义市英峪仪器厂)；tk―6a型franz扩散池(上海锴凯科贸有限公司)。
1.2 药品与试剂
8mop（江苏溧阳市制药厂，批号20040107，纯度>98.5%）；卵磷脂（国药集团上海化学试剂公司，批号20040315）；胆固醇（北京化学试剂公司，批号20040401）；硬脂胺（sigma公司，批号cas8002-43-5）；维生素e（sigma公司，批号59-02-9）；卡波姆-934（bfgoodrich公司，批号cc86gba625）；甲醇（tedia公司，色谱纯，批号403202）；苯扎氯铵（上海化学试剂一厂，批号20040919）；sephadex g―50（pharmacia公司）；药用氮酮(山西芮城兴庆化工厂,批号20041210)；丙二醇(武汉市江北化学试剂厂，批号20040724)；其余试剂均为分析纯。
1.3 实验动物与材料
雄性昆明小鼠，体质量(20±2） g，spf级，湖北省疾控中心提供,许可证号：scxk(鄂)2003―0005；0.45 μm微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂)。
2 方法与结果
2.1 离体鼠皮的制备
将小白鼠断颈处死，用剪刀除尽腹毛，剥离腹部皮肤，去除皮下脂肪，洗净后用生理盐水浸泡，并置于4 ℃冰箱中冷藏备用。
2.2 接受液的制备
以含30%(φ)乙醇的磷酸盐缓冲液（pbs，ph6.5，中国药典2005版二部附录）配制。
2.3 凝胶的制备［6］
2.3.1 lmop混悬液的制备
精密称取卵磷脂400 mg，胆固醇200 mg，硬脂胺20 mg，甲氧沙林30 mg，维生素e10 mg，分别溶于30 ml氯仿甲醇（体积比2∶1）溶液中，置于500 ml茄形烧瓶中，加玻璃珠若干颗，于40 ℃水浴上减压旋转蒸发至形成薄膜（a）；取10 ml pbs（10 mmol・l-1）加热至55℃，倾入（a）中，并浸入55 ℃水浴中搅拌30 min，即得lmop混悬液（b）。
2.3.2 lmop凝胶的制备
称取卡波姆100 mg和甘油2 g润湿研匀，加入溶有苯扎氯铵20 mg的水溶液适量，放置，使充分溶胀，滴加三乙醇胺适量调节ph值到6.0～6.5（c）；将lmop混悬液（b）适量加至（c）中，最后加pbs至40 g，搅匀，即得lmop凝胶（d，其8mop含量为0.075%）。另将适量az和pg按1∶1（质量比）混匀，搅拌加入凝胶基质中，再依上法制得含1%（az+pg）透皮吸收促进剂的lmop凝胶（e）。
2.4 hplc法测定8mop含量
2.4.1 色谱条件及分析结果
色谱柱:agilent zorbaxsbc18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇水(体积比70∶30)；流速为0.8 ml・min-1；检测波长为249 nm；柱温25 ℃；进样量:10 μl。
2.4.2 标准曲线的建立
精密称取105 ℃干燥至恒重的8mop对照品适量，加无水乙醇溶解制成10 μg・ml-1的对照品溶液。分别精密量取0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0 ml至10 ml量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀。每次进样10 μl，每一浓度进样3次。记录色谱图，测定峰面积，求得8mop的峰面积（a）与进样浓度（ρ）的回归方程：
a=-0.13+0.4278ρ，r=0.9996（n＝3）。
2.4.3 回收率试验
分别称取样品凝胶(d)、(e)各2 g，置100 ml量瓶内，分别精密加入8mop对照品10、40、80 mg，混合均匀，用无水乙醇稀释至100 ml，充分摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤。精密量取续滤液1.0 ml于100 ml量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀。吸取10 μl进样，记录色谱图，按回归方程计算8mop的含量。得样品凝胶（d）及（e）的平均回收率分别为1033%，100.4%，99.8%和99.9%，101.4%，1021%。rsd值分别为0.83%，1.02%，1.23%和097%，114%，1.43%（n＝3）。
2.4.4 精密度试验
将两种样品凝胶(d)、(e)配制成含1.0、4.0、8.0 μg・ ml-1 3种浓度的8mop样品溶液，每隔2 h测定1次，计算日内变异。将样品放置5 d，每天测定1次，计算日间变异。测得日内变异rsd值分别为1.08%，0.89%，0.73%和1.03%，064%， 047%（n＝3）；日间变异rsd值分别为094%， 117%，1.09%和1.09%，1.31%，1.49%（n＝5）。
2.4.5 方法稳定性
对各供试液分别在0、2、4、8、12、24、48 h作上述测定，各实验结果无显著性差异(p＞0.05)，表明方法稳定性良好。
2.5 体外透皮渗透考察
2.5.1 体外透皮实验装置及方法
本实验采用franz扩散池装置。将备用鼠皮固定在扩散池的供应室与接受室之间，使角质层面向供应室，上下夹紧后在接受室中注满接受液，驱除气泡。在供应室中分别加入1 g样品凝胶（d）及（e）。开启电磁搅拌器连续搅拌，并保持水浴温度在(32±0.5) ℃。分别在0.5、1、2、5、6、8，12 h取样4 ml，同时补加等量同温的新鲜接受液。
2.5.2 接受液含量测定和累积透皮量的计算
取接受液4 ml经0.45μm微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1.0 ml于100 ml量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀。取10μl进样，在249 nm 处测得峰面积，代入标准曲线方程，得接受液浓度，并按以下公式计算累积释药量（q）:ci=f(xi)；q=(ci×vn-1 i=1+ci×4)/s。其中f(xi):标准曲线方程；ci:接受液中药物浓度；v:接受液体积；s：扩散面积。以累积透皮释药量q对释药时间t作图，见图1。
将各样品凝胶体外透皮释药实验结果进行模型拟合，其8mop的累积透皮量（q）与时间（t1/2）之间线性回归具有良好的相关性，各释放参数符合higuchi扩散模式，所得斜率k即为透皮速率常数j(μg・cm-2・h-1)。经方差分析，组间差异有显著性（f＞f0.05），表明透皮促进剂的使用对8mop的经皮促渗作用效果明显，释药状态稳定。结果见表1。表1 样品（d）和样品（e）体外释药的higuchi方程（略）
3 讨 论
3.1 实验全部选择雄性昆明小白鼠可便于取皮操作及结果数据的平行。同时，以高效液相色谱法为离体鼠皮建立了可靠的体外测定方法，使其避免了因长时间浸泡于接受液中，皮肤蛋白质的脱落、溶解而造成接受介质混浊导致的测定干扰，从而保证了较好的基线分离。
3.2 体外透皮实验中水浴设定的温度 (32 ±0. 5) ℃系最接近正常人体表皮的温度。实验中pbs的ph值设定在6.5，一方面是由于该值更接近人体皮肤的ph值，另一方面是由于8mop中所含不饱和内酯在ph＝6.5时最稳定，水解常数最小［7］。因此，以pbs（ph6.5）为水合介质制备脂质体可使脂质体凝胶中的8mop保持在最稳定的范围内。同时，以含30%(φ)乙醇的pbs为透析介质可增大8mop的溶解度，有利于药物浓度的测定。
3.3 本实验凝胶为骨架控释制剂，透皮促进剂要先从基质缓慢扩散至皮肤表面，然后与角质层发生作用，其扩散速率为影响药物渗透的重要因素。氮酮分子直接分配介入角质层的双分子脂质体中，从而破坏其有序叠集排列，导致结构松散，流度增加，使药物分子易于转运，具有较强的透皮促进作用［8］。丙二醇作为促渗剂在单独应用时促渗作用并不明显，并且在较高浓度下随着丙二醇黏度的增加，反而会出现阻滞药物扩散的现象［9］。而丙二醇与氮酮合用则能够产生协同透皮吸收作用：一是由于丙二醇在类脂极性基团之间的亲水区域分布，使氮酮容易分配进入细胞间部位；此外，丙二醇还可以促进药物通过细胞内途径转运，并因此提高氮酮的促进作用［10］。本实验结果显示：含1%（az+pg）的lmop凝胶（e）与不含透皮吸收促进剂的lmop凝胶（d）比较，体外透皮时滞明显缩短，其连续稳态释药促透作用显著。
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摘要:目的 探讨不同浓度新型促渗剂壬代环戊双醚对双氯芬酸钠凝胶的透皮吸收影响。方法 采用改良frans扩散池进行体外透皮吸收实验。流动相：甲醇乙酸水溶液(ph=3.0)（体积比70∶30），紫外检测波长284 nm。结果 壬代环戊双醚含量在2.0％时透皮吸收最好。结论 壬代环戊双醚具有较好的促渗作用，是较好的新型促渗剂。
关键词:壬代环戊双醚；双氯芬酸钠凝胶；透皮吸收；新辅料
abstract: objective to evaluate the effect of 2nonyl1,3dioxolane,a penetration enhancer,on in vitro permeation of diclofenac gel．method the in vitro skin permeation experiment was conducted by using modified franz diffusion cell. acetate solution (ph3.0)methanol (70∶30) was used as mobile phase and the detection wavelength was set at 284 nm. result and conclusion the optimal concentration of 2nonyl1,3dioxolane for higher percutaneous absorption of diclofenac gel was 2.0%,suggesting that 2nonyl1,3dioxolane is a potent penetration enhancer.
key words:2nnonyl1,3dioxolane; diclofenac gel; pereutaneous absorption; new excipients
经皮给药系统是目前药剂学研究的热点之一［1］。其可维持稳定持久的血浓，避免胃肠道的破坏及肝脏首过效应，毒性和不良反应小，使用方便。然而在治疗量下许多药物难以渗透皮肤，必须使用促渗剂增加药物穿透性和透皮速率。在实际应用中，常用的有油酸及其酯类、二甲亚砜及其衍生物和氮酮等，其中以氮酮（azone）最为普遍［2］。
本室合成一种新的透皮吸收促进剂――壬代环戊双醚［3］，化学名为2正壬基1，3二氧戊环。由癸醛和乙二醇在对甲基苯磺酸催化下脱水环合而成。性状为无色、透明、无毒、略有香味的稀油状液体。其合成方法、药理毒性另文报道。
双氯芬酸钠为非甾体抗炎药［4］，口服易引起胃肠道反应，采用经皮给药方法，可以消除其对胃肠道的刺激，但经皮吸收又受到角质层的限制，透皮速率较小，需添加促透剂以改善药物的透皮释药。本文选用双氯芬酸钠为模型药物结合不同浓度的新型促渗剂壬代环戊双醚研究其对药物透皮制剂吸收的影响，考察壬代环戊双醚新型促渗剂的开发价值。
1 试剂、仪器与实验动物
1.1 试剂与仪器
高效液相色谱仪(lc―10a，日本岛津)，智能透皮实验仪（tp―2a,南京红蓝电子科技中心），改良frans扩散池（购自沈阳药科大学），zd―85双功能气浴恒温振荡器(江苏金坛市富华仪器有限公司)，卡波姆940（carbomer，美国goodrich公司），双氯芬酸钠(北京双鹤药业有限公司)，双氯芬酸钠对照品(购自中国药品生物制品检定所)，壬代环戊双醚(本室合成)，氮酮（azone，药用，广州化学助剂厂），甲醇（色谱醇，南京汉邦试剂厂），其他试剂均为分析纯。
1.2 实验动物
昆明种小白鼠，体质量20～22 g，spf级，雌、雄兼用，福建医科大学动物实验中心提供，合格证号为医动字第23―006号(质)。
2 实验方法
2.1 双氯芬酸钠凝胶剂的制备
取双氯芬酸钠150 g溶解于60 ℃ 1 500 ml丙二醇中，另将150 g卡波姆940加入800 ml蒸馏水中充分溶胀，搅拌下将双氯芬酸钠溶液加入卡波姆基质中，并分别加入质量浓度为0％，0.5％，1.0％，1.5％，2.0%，25％，3.0％的壬代环戊双醚、2.0％的氮酮，用三乙胺调ph为7.5，搅拌使成凝胶状，蒸馏水加至1 000 g，搅匀，分装即得。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件
色谱柱shimpack ods柱(4.6 mm×150 mm，10 μm)；检测波长284 nm；流动相：甲醇乙酸水溶液(ph调3.0)（体积比70∶30）；流速：1.0 ml・min-1；柱温为室温；进样量：20 μl。柱效以双氯芬酸钠计，理论塔板数不低于3 000。
2.2.2 标准曲线的制备
精密称取105 ℃干燥至恒重的双氯芬酸钠对照品50 mg，置于50 ml量瓶中，用流动相溶解定容，振荡摇匀，备用。精密量取标准液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml置于100 ml量瓶中，用流动相溶解定容，振荡摇匀。精密吸取20 μl进高效液相仪测定峰面积，以峰面积（a）为纵坐标与双氯芬酸钠质量浓度（ρ）进行线性回归，得标准曲线方程： a＝2377.15 ρ+01152，r＝0.9998，线性范围：5.0～30.0 μg・ml-1。
2.2.3 稳定性试验
取双氯芬酸钠适量，加接收液生理盐水配成高低不同浓度的溶液，分别在0,2,4,8,12,24 h处测定峰面积，rsd分别为0.78％和0.61％。结果表明，双氯芬酸钠在24 h内稳定。
2.2.4 精密度试验
精密吸取对照品溶液(15.078 μg・ml-1)20 μl，分别于同一日内，不同日内重复进样5次，测得rsd分别为1.19％和2.13％。
2.3 体外透皮试验
2.3.1 离体鼠皮的制备
取体质量20～22 g健康小鼠，处死后立即剃除腹部毛，剥离腹部皮肤，除皮下脂肪，用生理盐水冲洗后浸泡于生理盐水中，置于4℃冰箱冷藏，24 h内使用。
2.3.2 体外透皮试验
试验装置的透皮面积为4.52 cm2，接受池体积为10.05 ml。磁力搅拌器速度为60 r/min，实验温度为(37±0.5) ℃恒温水浴。接受液为生理盐水。
将双氯芬酸钠凝胶均匀涂布于预先处理好的鼠皮上，固定在释放池下端(角质层朝向玻璃管侧)，凝胶含壬代环戊双醚的质量浓度分别为0％，0.5％，1.0％，15％，2.0%，2.5％，3.0％和含2.0％的氮酮在1，2，4，6，8，10，12，14 h取样4 ml，立即补充同温生理盐水4 ml，以0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，于284 nm处测定峰面积。
2.3.3 接受液含量测定和累积透皮量的计算
将所测峰面积代入标准曲线方程计算浓度，并量取接受液的体积，按以下公式计算累积释放药量(q)。
2.4 统计学方法
数据的录入和分析处理在spss l0.0统计软件上完成。不同浓度各时间点累积透皮药量比较采用重复测量的方差分析，用lsd法作多重比较。
3 结 果
体外鼠皮透皮吸收试验结果见表1。表1 含不同浓度壬代环戊双醚和氮酮的双氯芬酸钠凝胶的体外释放量（略）
本实验对含药量相同，但含壬代环戊双醚浓度不同的7种凝胶分别进行6次体外鼠皮透皮吸收试验，经重复测量的分析，表明在6种浓度中，2.0%，2.5％，3.0％组的透皮药量显著高于其他浓度组(p<0.05)，在时间方面以14 h组最高(p<0.05)；但是2.5％，30％组的透皮药量与2.0%组的透皮药量差异无显著性。同样2.0％浓度组的氮酮略低于2.0％浓度组壬代环戊双醚（p>0.05），两者差异无显著性。
综合考查，ρ=2.0％的壬代环戊双醚对双氯芬酸钠凝胶累积透皮药量较高，选择其为本凝胶的促渗剂。
4 讨 论
在体外皮肤渗透实验中，采用不同浓度透皮辅料壬代环戊双醚考察对双氯芬酸钠凝胶的促渗作用，研究表明：不同浓度的壬代环戊双醚对双氯芬酸钠凝胶透皮扩散均有促进作用，且随壬代环戊双醚的浓度增加而增加，但是在浓度达到某一数值后对于药物的促渗作用没有显著提高。2.0％的壬代环戊双醚对双氯芬酸钠凝胶具有较高的透皮促渗作用。
kastu等［5］人研究表明氮酮及甲基衍生物与红细胞作用时可以引起溶血，可能是氮酮插入脂质双层改变脂质的排列，使膜结构不稳定，这一积累导致膜碎片由细胞膜释放而通透性增强；壬代环戊双醚与氮酮具有相似的结构，有一个极性头部和一条烃链，其机理可能也是通过改变脂质分子排列而提高皮肤表皮的结构，使药物更好地透过皮肤达到促渗作用。但是有报道［3］表明壬代环戊双醚与氮酮相比安全性和刺激性更低，对其深入的研究工作将继续进行。
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1 引 言
双酚A（Bisphenol A， BPA）、壬基酚（Nonylphenol， NP）和辛基酚（Otcylphenol， OP）已被证明具有内分泌干扰效应\，BPA作为生产塑料的原料，NP和OP作为增塑剂和表面活性剂原料等被广泛用于各种产品，可通过多种途径污染食品。目前在纯净水以及鱼虾等水产品\、肉及肉制品\、奶类\及谷物\等多种食物中都检测到这类物质。BPA、NP和OP的亲脂性较强，易在高脂肪、高蛋白的动物性食品中富集。联合国粮食与农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）专家会议\对30篇文献进行调研，发现高脂肪食物中BPA的含量高于其它食物; Lu等\对台湾466件食品进行调查，发现肉类的NP和OP含量高于其它食品。监测BPA等污染物在动物性食品中的存在水平具有重要意义。
NP和BPA在环境中普遍存在，有研究者报道MilliQ超纯水中BPA的浓度约为1～8 pg/L\。此外，样品预处理实验用塑料器皿和橡胶制品等都会迁移出大量NP和BPA\，对分析结果造成干扰。Kuch等\在对地表水和饮用水中的环境雌激素酚类物质进行分析时，用二次蒸馏水或反渗透水作为质量控制样品，结果在过程空白中检出200～400 pg/L的OP、NP和BPA。在食品分析方面，尽管目前已有大量的文献报道了检测方法，但是有关分析过程中的质量控制涉及较少，其后果可能导致监测数据失真，造成评估过程中食品安全风险的误判。鉴于此，本实验在探讨不同样品处理过程提取效果的同时，考察了实验操作中目标化合物背景污染的来源，最终采用凝胶渗透色谱（GPC）净化，同位素稀释超高效液相色谱串联质谱技术（UPLCMS/MS）分离检测，实现了肉、蛋、奶中痕量BPA、NP及OP的同时测定。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
Waters ACQUITYTM超高效液相色谱仪、XevoTM TQ质谱仪（美国Waters公司）; MilliQ超纯水机（美国Millipore公司）; CHIST ALPHA24, LDplus型冻干仪（德国CHIST公司）; BüCHI MixerB400均质器（瑞士BüCHI公司）; Accuprep MPS凝胶渗透色谱仪（美国J2 Scientific公司）; 4011型数字旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）; SepPak NH2（500 mg， 6 mL），SepPak Silica（500 mg， 6 mL）和SepPak Florisil（500 mg， 6 mL）固相萃取柱（美国Waters公司）; Varian NH2（500 mg，6 mL）固相萃取柱（美国Varians公司）; Cleanert NH2，Cleanert PSA，Cleanert Silica，Cleanert Florisil，Cleanert PestiCarb和Cleanert Alumina N填料（天津Agela Technologies公司）; Supelclean LCFlorisil填料（美国Supleco公司）。
甲醇（LCMS级，德国Merck公司），乙腈、乙酸乙酯、环己烷、甲基叔丁基醚、丙酮和正己烷（HPLC级，美国Dikma公司）; 无水Na2SO4（分析纯）; 氨水（28%～30%，w/w, 比利时Acros Organics公司）; 双酚A（98.5%，德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司），4NP（日本Tokyo Kasei Kogyo公司），4OP（99%，美国SigmaAldrich公司）; 同位素内标BPAd4，4nNPd4和4nOPd17（纯度均大于97.8%，加拿大CDN公司）。
2.2 标准溶液的配制
分别准确称取10 mg标准品，以甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1000 mg/L的标准储备液，于20 ℃保存。临用时用甲醇稀释成不同浓度的标准工作液，于4 ℃保存。
2.3 样品前处理
动物肌肉样品用组织捣碎机捣碎均匀，鸡蛋去壳后于100 mL烧杯中用玻璃棒搅拌均匀，液态奶样品冷冻干燥后研磨均匀，奶粉样品直接称取。分别称取肌肉、鸡蛋和奶粉样品4.0、4.0和2.0 g，于50 mL玻璃离心管中，加入10 mL乙酸乙酯环己烷（1∶1，V/V）涡旋混匀，超声提取15 min，于4 ℃以3000 r/min离心15 min，取5 mL上清液用于GPC净化。GPC采用苯乙烯树脂Biobead SX3 （300×10 mm）凝胶色谱柱，流动相为乙酸乙酯环己烷（1∶1，V/V），流速3.0 mL/min。收集12.5～17.5 min组分于100 mL鸡心瓶中，在30 ℃以120 r/min旋转蒸发至干，加1 mL甲醇。
分 析 化 学第40卷
第4期牛宇敏等： 同位素稀释液相色谱串联质谱法测定动物性食品中的双酚A、壬基酚及辛基酚
实验中所用的器具均为玻璃材质，使用前在马弗炉中400 ℃烘烤4 h。GPC及液相色谱串联质谱仪的管线均为不锈钢或聚四氟乙烯材质。每10个样品做一个溶剂空白。
2.4 色谱质谱条件
色谱和质谱分析条件采用本课题组已建立的方法\。色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18 （50 mm×2.1 mm，1.7 g/kg，放置30 min。乙腈、甲醇及甲基叔丁基醚处理肌肉和鸡蛋等含水基质时，需加入无水Na2SO4脱水后，再超声提取，取1 mL直接上机测定。使用乙酸乙酯环己烷（1∶1，V/V）直接提取时，超声离心后取1 mL上清液旋转蒸发至干，以1 mL甲醇复溶再测定。结果如图1所示，4种提取液中，除甲基叔丁基醚提取效率较差外，其余3种提取液的提取效率相差不大，均在62.3%～117.8%之间。乙酸乙酯环己烷（1∶1，V/V）的回收率最高，乙腈略优于甲醇。因此采用固相萃取净化时，选择乙腈作为提取液，GPC净化时选择乙酸乙酯环己烷（1∶1，V/V）。
图1 不同提取液对肌肉（A）、鸡蛋（B）和奶粉（C）中目标化合物的回收率
Fig．1 Recoveries of target compounds in muscle （A）, egg （B） and infant formula （C） using different extracting solutions
1. 乙酸乙酯环己烷（Ethyl acetatecyclohexane, 1∶1，V/V）; 2. 乙腈（Acetonitrile）; 3. 甲醇（Methanol）; 4. 甲基叔丁基醚（Methyl tertiary butyl ether）。
3.3 净化方式的优化
3.3.1 固相萃取法 在测定实际样品时，无论以乙腈，还是乙酸乙酯环己烷（1∶1，V/V）为提取液时，直接旋转蒸发浓缩后都有明显的脂肪残留，LCMS/MS测定时产生了很强的基质抑制，NP和OP均大于70%（表1）。正相固相萃取是动物源性食品中痕量残留物富集净化常用的方法。本实验比较了NH2柱、Silica柱和Florisil柱。在空白对照中均检出NP，NH2柱和Florisil柱约为3 ng，Silica柱约为100 ng。
本研究以NH2柱为例，分别用10, 20, 30, 40和50 mL的甲醇丙酮（1∶1，V/V）预淋洗柱子，NP的背景值未明显减少，说明大体积的洗脱液不能有效去除NP的干扰。本研究对固相萃取柱的不同组成部分进行了考察，即柱套、筛板以及填料。将常用的塑料柱套换成了玻璃柱套; 取不同的填料（0.5 g）和筛板分别浸泡在5 mL甲醇丙酮（1∶1，V/V）溶液中，每隔1 h取1 mL浸泡液进行测定; 弃去剩余溶液，重新加入5 mL甲醇丙酮（1∶1，V/V）溶液，以考察NP和BPA的溶出情况。本研究比较了7种填料，包括Cleanert NH2，Cleanert PSA，Cleanert Silica，Cleanert Florisil，Cleanert PestiCarb，Cleanert Alumina N和Supelclean LCFlorisil，发现随着浸泡时间的延长，填料中释放出的NP逐渐减少，最后维持在约0.4 ng; 但是筛板中NP会持续溶出，浓度约为0.8 ng，因此直接使用商品化的固相萃取柱进行净化不可行。
本实验参考了文献\，将Florisil填料于130 ℃加热16 h可去除NP（NP溶出量低于0.1 ng）。称取奶粉2.0 g，以10 mL乙腈提取一次，用10 mL乙腈饱和的正己烷进一步去除脂肪，取乙腈层旋转蒸发至干，加5 mL正己烷丙酮（8∶2，V/V），转入放有1.0 g Florisil填料的玻璃离心管中，2500 r/min漩涡振荡1 min，离心后取上清液，旋蒸至干，定容并检测，基质抑制率仍然大于50%（表1），该方法不能达到净化目的。
表1 不同净化处理后奶粉中目标化合物的基质抑制率
Table 1 Matrix suppression of target compounds in infant formula after different cleanup procedures （n＝3）
方法 MethodBPA（%）NP（%）OP（%）Ⅰ267779Ⅱ37152Ⅲ740 Ⅰ： 提取液直接浓缩（Extracts directly concentrated）; Ⅱ： Florisil填料净化（Purified by Florisil）; Ⅲ： GPC净化（Purified by GPC）。BPA: Bisphenol; NP: Nonylphenol; OP: Octylphenol。
关键词：凝胶渗透色谱（GPC）；PL-GPC50；PUMP；双检测器；autosampler
中图分类号：TH17
文献标识码：A
文章编号：1009-2374（2012）23-0080-04
独山子石化公司乙烯厂新区化验室现有英国PL公司产PL-GPC50常温凝胶色谱仪5台，主要用于18万吨/年SSBR/SBS橡胶装置的胶液分子量及其分布分析，另外亦用于13万吨/年PS装置抗冲级聚苯乙烯（HIPS）及通用级聚苯乙烯（GPPS）粒料分子量分析。通过凝胶渗透色谱（GPC），能够给出可靠的工艺调整参考数据，因此PL-GPC50常温凝胶色谱仪的正常运行直接关系到以上两套装置的平稳生产。笔者通过安装、调试、维修PL-GPC50常温凝胶色谱仪的工作实践，总结出了一些实践经验，希望能给此仪器的使用者和维护者起到一定的指导作用。
1 仪器简介及操作和注意事项
1.1 仪器结构
此仪器由溶剂贮器、在线过滤脱气装置、Data stream数模转换器、高压输液泵、自动进样装置、色谱柱系统、RI和UV双检测器、自动记录及数据处理系统几大部分构成。
图1 原则流程图
1.2 基本操作及注意事项
1.2.1 溶剂准备。将过滤、超声脱气后的新鲜THF溶剂加入试剂瓶，同时在每4升溶剂瓶中加入1克的抗氧剂（常用的抗氧化剂为BHT），以防THF在使用过程中氧化。
1.2.2 仪器开机。开机前检查泵头处的“Purge”阀的旋钮是否处于正常流路（旋紧为正常流路），并检查自动进样器的各条连线是否理顺；打开主机和Data stream后面板的电源开关，仪器各部分进行自检，等待完成后打开计算机运行 PL Instrument Control软件，进行仪器和计算机之间的通讯，使GPC50进入计算机软件控制状态。此时溶剂输送泵处于停止状态，状态显示为红色的叉号，其余为绿色的圆圈。
1.2.3 泵条件化和排气。若机器初次使用或长期停用或更换溶剂时需做排气操作，点击软件界面左侧PUMP处，可在右侧见泵操作界面，设定流速为工作流速（常规流速为1mL/min），设定工作压力范围0～20MPa（Min Pressure和Max Pressure）和流速改变梯度（Flow Ramp），点击Update，参数即发送至仪器并开始执行。泵的流量允许范围为0～10mL/min，正常工作和进样时的流速必须为1mL/min，闲置时的流速可以是0.1mL/min，只有当“Purge”旋钮松开时才能使用大于1mL/min的流速；流速的改变不能太快，必须逐步地升高或降低，如从1mL/min降到闲置时的0.1mL/min时应按照每次0.2mL/min的频率逐步降低；当泵压力异常时应及时检查“Purge”阀的状态且用滤纸对柱接头处检漏。排气操作时，可打开“Purge”阀，观察气泡从溶剂废液管中的流出情况（此时泵压力为零）。在确认泵流出溶剂已无气泡的条件下，并闭泵“Purge”阀。
1.2.4 柱温箱条件化。点击软件界面左侧oven处，在右侧界面设定柱箱温度（oven temperature），并点击Update发送至仪器。在仪器到达设定参数前，oven处绿色圆圈处于闪动状态；当仪器达到设定参数并稳定后，则绿色圆圈会稳定点亮。柱箱的温度在分析过程中必须恒温40℃。
1.2.5 RI和UV检测器条件化。在仪器升温和平衡过程中，可以随时对RI和UV检测器操作。如检测器基线不稳，可点击左侧Purge处显示操作界面对检测器进行操作。点击Start Purge可对参比池进行冲洗；点击Auto Zero进行自动调零。（RI参比池Purge后应该给予充分的稳定时间，通常2小时以上，基线平稳后方可，基线可通过Data stream monitor查看）。允许通过RI检测器池体的最大允许流量为5mL/min，因此即使“Purge”阀处于打开态时，冲洗RI检测器参比池的流速亦不应超过5mL/min，因为RI检测器的池体仅8微升，所以每次大流量冲洗时间均无需太长，一般设定60秒即可。进样前最好将UV和RI检测器全部调零。
1.2.6 样品制备。根据MMPP1方法要求将大约50mL的聚合溶液加入大约200mL乙醇中，在一个500mL的玻璃烧杯内搅拌，用力挤压凝聚物使部分干燥，然后在烘箱中烘干凝结物，直到完全脱除溶剂。在一个50mL容量瓶内，称出0.075±0.001g的聚合物，加入约30mL含内标溶液的THF溶解直至样品完全溶解。将样品经0.45mm的PTFE过滤器过滤后准备进样分析（过滤步骤绝不可省略，否则形成的凝胶会造成系统堵塞）。
1.2.7 数据分析。
（1）创建工作簿：运行GPC Online，选择
Create a New Workbook。以后可多次调用此Workbook。键入文件名并选择保存路径，同时可在Experiment Tile和Comment中作注释。完成后点击确定。在Conditions界面下，可填写所用溶剂、溶剂RI值、流速、温度、色谱柱信息以及检测器信息。Data Collection界面下，可设定自动进样器、定量环、进样方式、数据采集时间及采样速率，在Instruments下可添加设备信息。
（2）创建采样方法：选择左侧Views下的Method Browser，创建新的方法。填写方法名，同时不要选择Do Data Processing，其他选择可保持默认设置。完成后点击确认。
关键词：农药残留；检测；前处理技术
近年来，由于农业生产过程中忽视农药的正确、合理使用，农药污染问题经常发生，农药残留量超标现象相当严重，并呈现逐年加剧的趋势。为保障人民的身体健康、有效控制农药在农产品生产中的使用和对其残留量进行监控，大力开展农药残留检测技术特别是相关的前处理技术的研究是非常必要的。农药残留测定之前要有适合于各种样品的理化性质的萃取、净化、浓缩等前处理步骤，这些前处理过程往往对农药残留分析的准确性、精确程度有重要影响。由于农药残留检测技术涉及的样品种类繁多、样品组成及其浓度复杂多变、样品物理形态范围广泛，对农药残留测定构成的干扰因素特别多，所以需要选择科学有效的处理方法。据统计表明[1]，大部分农药残留检测实验室中用于农药残留检测样品前处理过程的时间约占整个分析时间的2/3。为了提高分析测定效率，改善和优化农药残留检测样品制备的方法和技术是一个重要问题。在现代农药残留分析中，有些提取方法已经能够达到部分净化或完全净化的效果。因此，提取和净化方法的界限已十分模糊。这些新技术的共同特点是节省时间，减轻劳动强度，节省溶剂，减少样品用量，提高提取或净化效率以及自动化水平。目前，得到广泛应用的新技术主要有超临界流体提取、固相微萃取、微波辅助萃取技术、胶渗透色谱、基质固相分散萃取、固相萃取等。
1超临界流体萃取（supercritical fluid extraction，sfe）
超临界流体（supercritical fluid，scf）是指处于临界温度和临界压力的非凝缩性的高密度流体。这种流体介于气体和液体之间，兼具二者的优点。超临界流体萃取（sfe）是指利用处于超临界状态的流体为溶剂对样品中待测组分的萃取方法。lehotay等[2]首次报道了应用sfe技术检测蔬菜中五氯硝基苯残留，样品无需进一步净化即可通过气质联机（gc-ms）检测。随后lehotay等再次使用sfe，gc-ms检测了蔬菜、水果中46种农药残留，除甲胺磷和乙酰甲胺磷外，其他农药的回收率都在80%以上。为提高sfe的萃取效果，常在超临界流体co2中加入少量的极性溶剂。rhan通过在洋葱、胡萝卜前处理过程中加入甲醇，有效地提高了被检农药的回收率。刘瑜等[3]应用此技术对苹果中5种氨基甲酸酯农药进行检测，其结果支持了这一观点。sfe技术的优点是可进行选择性萃取，萃取物不会改变其原来的性质，萃取过程简单易于调节；缺点是萃取装置较昂贵，不适于分析水样和极性较强的物质[4]。
2固相微萃取（solid- phase microextraction，spme）
固相微萃取是 20世纪80年代末由加拿大waterloo大学pawliszyn和arhturhe教授提出的，它是在固相萃取技术基础上发展起来的一种兼样品制备的前处理技术。spme的原理是利用待测物在基体和萃取相之间的非均相平衡，使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层，待吸附平衡后，再以气相色谱或高效液相色谱分离和测定待测组分。spme技术具有简便、快捷、无需萃取溶剂的特点，非常适用于挥发或半挥发农药残留分析。影响固相微萃取结果的因素包括萃取头类型、萃取时间、离子强度、解吸附温度和解吸附时间等。陈伟琪等[5]利用100 μm聚二甲基硅氧烷萃取头浸入匀浆液的萃取方式，由gc-fpd测定了茼蒿中的甲拌磷等 4种有机磷农药残留量，讨论了搅拌速度、离子强度、平衡时间等影响因素对测定结果的影响；lambropoulou等采用100 μm聚二甲基硅氧烷萃取头、顶空-固相微萃取（hs-spme）方式，用gc-ms方法测定了草莓和樱桃中的乙硫磷、对硫磷、倍硫磷等 7种有机磷农药残留量；sakamoto等发展了一种采用85 μm聚丙烯酸酯萃取头、顶空-固相微萃取测定水中的158种农药残留量的gc-ms方法，探讨了不同种类萃取头、盐浓度、ph值和萃取温度等参数的影响。固相微萃取的优点是操作简单快速，价廉实用，适用于现场检测；缺点是因固定相吸附容量有限，定量结果误差相对较大，主要用于定量测定。
3微波辅助萃取技术（microwave aided extraction，mae）
微波辅助萃取是1986年匈牙利学者ganzler等人通过利用微波能萃取土壤、食品、饲料等固体物中的有机物，提出一种新的少溶剂样品前处理方法
。微波辅助萃取技术是对样品进行微波加热，利用极性分子可迅速吸收微波能量的特性来加热一些具有极性的溶剂，达到萃取样品中含目标化合物，分离杂质的目的。akhtar等[6]先用mae法从精饲料中萃取出盐霉素，而后用hplc法测定其浓度。hummert等[7]用mae法萃取后用gc-ecd测定了海洋哺乳动物脂肪组织中的有机氯化合物，经该方法与索氏提取方法萃取的样品中类酯的含量相似。微波辅助萃取技术的优点是快速节能、节省溶剂、污染小；缺点是不易自动化，且一般仅用于有机氯类农药的提取。
4凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，gpc）
凝胶渗透色谱技术是根据溶质（被分离物质）分子量的不同，通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），使物质达到分离。凝胶渗透色谱法最初主要用来分离蛋白质，但随着适用于非水溶剂分离的凝胶类型的增加，凝胶渗透技术应用于农药残留量净化得以发展。balinova采用gpc提纯步骤，用hplc检测了5种gc无法检测的农药（杀虫隆、氟虫脲、四螨嗪、噻螨酮、除虫脲），方法灵敏度高，准确度及精密度好，数据线性范围宽（2~40 ng），能够很好地分离共萃取基质。该方法的操作难度相对较高，初学者不易掌握。
5基质固相分散萃取（matrixsolid-phase dispersion extr-action，mspd）
基质固相分散萃取由barker于1989年首次提出。这项技术的优点是不需要进行组织匀浆、沉淀、离心、ph调节和样品转移等操作。mspd的原理是将c18等固相萃取吸附剂与固体、半固体或黏性的样品一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶液淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。mspd多应用于从动物组织、蔬菜、水果中分离药品、除草剂、杀虫剂和其他污染物，barber s a和王运浩等认为影响mspd效果的因素包括吸附剂的粒径、键合相的性质、样品基质的性质以及基质的修饰、淋洗剂的性质以及加入的顺序等。kristenson等发展了一种简便快速的mspd/gc-ms方法测定水果中的氯菊酯和倍硫磷、马拉硫磷等10种有机磷农药残留量。选择c8作为吸附剂，每次分析仅需25 mg样品和100 μl溶剂；pico等利用c18做分散吸附剂、硅胶柱净化、gc-npd和gc-ecd测定的方法检测了水果和蔬菜中的克菌丹、灭菌丹等8种杀菌剂；morzycka建立了一种简便的多残留分析的mspd/gc-npd方法测定蜂蜜中的乙硫磷、毒死蜱等12种农药的残留量，采用florisil和硅胶作分散吸附剂，氧化铝和硅胶作为净化吸附剂，达到了较好的净化效果和良好的回收率。该方法仅适用于一类化合物的分离。
6固相萃取（solid phase extraction，spe）
固相萃取（spe）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。与液/液萃取相比，固相萃取有很多优点：固相萃取不需要大量互不相溶的溶剂，处理过程中不会产生乳化现象；采用高效、高选择性的吸附剂（固定相），能显著减少溶剂的用量，简化样品的预处理过程，同时所需费用也有所减少。一般来说，固相萃取所需时间为液/液萃取的1/2，而费用为液/液萃取的1/5。固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其主要分离模式也与液相色谱相同，可分为正相（吸附剂极性大于洗脱液极性）、反相（吸附剂极性小于洗脱液极性），离子交换和吸附。目前，用于hplc的填料几乎均可用于spe。但spe柱的填料粒径大于hplc填料，spe柱效会远低于hplc色谱柱。因此，该方法适于分离保留性质差别很大的化合物，主要用于处理样品。
固相萃取主要用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的分离和富集。例如生物体（如血液、尿等）中药物及其代谢产物的分析、食品中有效成分或有害成分的分析、环保水样中各种污染物（可挥发性有机物和半挥发性有机物）的分析等，都可以使用固相萃取将目标化合物分离出来，并加以富集。
该文将近年来发展迅速的固相萃取前处理技术与先进的气质联用检测技术结合起来，期望能探索出一种快速方便、准确可靠、用于实验室内的农药残留（包括有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、除草剂、杀菌剂）检测前处理方法，进一步完善农药残留检测方案，为制订覆盖面广、快速、有效的新标准方法提供技术支持。
7参考文献
[1] 陈燕清，颜流水.食品中农药残留前处理技术进展[j].江西化工，2004（3）：17-23.
[2] lehotay s j，eller k i.development of a method of analysis of 46 pesticides in fruits and vegetables by supercritical fluid extraetion and gas chromatography /ion trap nlass spectrometry[j].j.aoac int.1995（78）：821-830.
[3] 刘瑜，庄无忌，邱月明.苹果中五种氨基甲酸酯农药的超临界流体萃取及其气相色谱法测定[j].色谱，1996（6）：45-47.
[4] 曹明霞，徐溢，赵天明，等.超临界萃取在天然植物成分提取中的应用进展[j].广州化工，2010（8）：23-25，37.
[5] 陈伟琪，候小凤，张珞平.spme/gc联用测定蔬菜中有机磷农药的方法研究[j].厦门大学学报：自然科学版，2000，39（4）：509-515.
[6] akhtar m h，crotea u l g.extraction of salinomycin from finished layers ration by microwave solvent extraction followed by liquid chroma-tography[j].analyst，1996，121（6）：803-806.
[7] hummert k，vetter w，luckas b.fast and effective sample prep-aration for determination of organochlorine compounds in fatty tissue of marine mammals using microwave extraction[j].1996，42（5-6）：300-304.
关键词：农药残留；检测；前处理技术
近年来，由于农业生产过程中忽视农药的正确、合理使用，农药污染问题经常发生，农药残留量超标现象相当严重，并呈现逐年加剧的趋势。为保障人民的身体健康、有效控制农药在农产品生产中的使用和对其残留量进行监控，大力开展农药残留检测技术特别是相关的前处理技术的研究是非常必要的。农药残留测定之前要有适合于各种样品的理化性质的萃取、净化、浓缩等前处理步骤，这些前处理过程往往对农药残留分析的准确性、精确程度有重要影响。由于农药残留检测技术涉及的样品种类繁多、样品组成及其浓度复杂多变、样品物理形态范围广泛，对农药残留测定构成的干扰因素特别多，所以需要选择科学有效的处理方法。据统计表明[1]，大部分农药残留检测实验室中用于农药残留检测样品前处理过程的时间约占整个分析时间的2/3。为了提高分析测定效率，改善和优化农药残留检测样品制备的方法和技术是一个重要问题。在现代农药残留分析中，有些提取方法已经能够达到部分净化或完全净化的效果。因此，提取和净化方法的界限已十分模糊。这些新技术的共同特点是节省时间，减轻劳动强度，节省溶剂，减少样品用量，提高提取或净化效率以及自动化水平。目前，得到广泛应用的新技术主要有超临界流体提取、固相微萃取、微波辅助萃取技术、胶渗透色谱、基质固相分散萃取、固相萃取等。
1超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）
超临界流体（supercritical fluid，SCF）是指处于临界温度和临界压力的非凝缩性的高密度流体。这种流体介于气体和液体之间，兼具二者的优点。超临界流体萃取（SFE）是指利用处于超临界状态的流体为溶剂对样品中待测组分的萃取方法。Lehotay等[2]首次报道了应用SFE技术检测蔬菜中五氯硝基苯残留，样品无需进一步净化即可通过气质联机（GC-MS）检测。随后Lehotay等再次使用SFE，GC-MS检测了蔬菜、水果中46种农药残留，除甲胺磷和乙酰甲胺磷外，其他农药的回收率都在80%以上。为提高SFE的萃取效果，常在超临界流体CO2中加入少量的极性溶剂。Rhan通过在洋葱、胡萝卜前处理过程中加入甲醇，有效地提高了被检农药的回收率。刘瑜等[3]应用此技术对苹果中5种氨基甲酸酯农药进行检测，其结果支持了这一观点。SFE技术的优点是可进行选择性萃取，萃取物不会改变其原来的性质，萃取过程简单易于调节；缺点是萃取装置较昂贵，不适于分析水样和极性较强的物质[4]。
2固相微萃取（Solid- phase microextraction，SPME）
固相微萃取是 20世纪80年代末由加拿大Waterloo大学Pawliszyn和Arhturhe教授提出的，它是在固相萃取技术基础上发展起来的一种兼样品制备的前处理技术。SPME的原理是利用待测物在基体和萃取相之间的非均相平衡，使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层，待吸附平衡后，再以气相色谱或高效液相色谱分离和测定待测组分。SPME技术具有简便、快捷、无需萃取溶剂的特点，非常适用于挥发或半挥发农药残留分析。影响固相微萃取结果的因素包括萃取头类型、萃取时间、离子强度、解吸附温度和解吸附时间等。陈伟琪等[5]利用100 μm聚二甲基硅氧烷萃取头浸入匀浆液的萃取方式，由GC-FPD测定了茼蒿中的甲拌磷等 4种有机磷农药残留量，讨论了搅拌速度、离子强度、平衡时间等影响因素对测定结果的影响；Lambropoulou等采用100 μm聚二甲基硅氧烷萃取头、顶空-固相微萃取（HS-SPME）方式，用GC-MS方法测定了草莓和樱桃中的乙硫磷、对硫磷、倍硫磷等 7种有机磷农药残留量；Sakamoto等发展了一种采用85 μm聚丙烯酸酯萃取头、顶空-固相微萃取测定水中的158种农药残留量的GC-MS方法，探讨了不同种类萃取头、盐浓度、pH值和萃取温度等参数的影响。固相微萃取的优点是操作简单快速，价廉实用，适用于现场检测；缺点是因固定相吸附容量有限，定量结果误差相对较大，主要用于定量测定。
3微波辅助萃取技术（Microwave Aided Extraction，MAE）
微波辅助萃取是1986年匈牙利学者Ganzler等人通过利用微波能萃取土壤、食品、饲料等固体物中的有机物，提出一种新的少溶剂样品前处理方法
[1] [2] [3]
。微波辅助萃取技术是对样品进行微波加热，利用极性分子可迅速吸收微波能量的特性来加热一些具有极性的溶剂，达到萃取样品中含目标化合物，分离杂质的目的。Akhtar等先用MAE法从精饲料中萃取出盐霉素，而后用HPLC法测定其浓度。Hummert等用MAE法萃取后用GC-ECD测定了海洋哺乳动物脂肪组织中的有机氯化合物，经该方法与索氏提取方法萃取的样品中类酯的含量相似。微波辅助萃取技术的优点是快速节能、节省溶剂、污染小；缺点是不易自动化，且一般仅用于有机氯类农药的提取。
凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）
凝胶渗透色谱技术是根据溶质（被分离物质）分子量的不同，通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），使物质达到分离。凝胶渗透色谱法最初主要用来分离蛋白质，但随着适用于非水溶剂分离的凝胶类型的增加，凝胶渗透技术应用于农药残留量净化得以发展。Balinova采用GPC提纯步骤，用HPLC检测了种GC无法检测的农药（杀虫隆、氟虫脲、四螨嗪、噻螨酮、除虫脲），方法灵敏度高，准确度及精密度好，数据线性范围宽（~ ng），能够很好地分离共萃取基质。该方法的操作难度相对较高，初学者不易掌握。
基质固相分散萃取（Matrixsolid-phase dispersion extr-action，MSPD）
基质固相分散萃取由Barker于年首次提出。这项技术的优点是不需要进行组织匀浆、沉淀、离心、pH调节和样品转移等操作。MSPD的原理是将C等固相萃取吸附剂与固体、半固体或黏性的样品一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶液淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。MSPD多应用于从动物组织、蔬菜、水果中分离药品、除草剂、杀虫剂和其他污染物，BARBER S A和王运浩等认为影响MSPD效果的因素包括吸附剂的粒径、键合相的性质、样品基质的性质以及基质的修饰、淋洗剂的性质以及加入的顺序等。Kristenson等发展了一种简便快速的MSPD/GC-MS方法测定水果中的氯菊酯和倍硫磷、马拉硫磷等种有机磷农药残留量。选择C作为吸附剂，每次分析仅需 mg样品和 μL溶剂；Pico等利用C做分散吸附剂、硅胶柱净化、GC-NPD和GC-ECD测定的方法检测了水果和蔬菜中的克菌丹、灭菌丹等种杀菌剂；Morzycka建立了一种简便的多残留分析的MSPD/GC-NPD方法测定蜂蜜中的乙硫磷、毒死蜱等种农药的残留量，采用Florisil和硅胶作分散吸附剂，氧化铝和硅胶作为净化吸附剂，达到了较好的净化效果和良好的回收率。该方法仅适用于一类化合物的分离。
固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）
固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。与液/液萃取相比，固相萃取有很多优点：固相萃取不需要大量互不相溶的溶剂，处理过程中不会产生乳化现象；采用高效、高选择性的吸附剂（固定相），能显著减少溶剂的用量，简化样品的预处理过程，同时所需费用也有所减少。一般来说，固相萃取所需时间为液/液萃取的/，而费用为液/液萃取的/。固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其主要分离模式也与液相色谱相同，可分为正相（吸附剂极性大于洗脱液极性）、反相（吸附剂极性小于洗脱液极性），离子交换和吸附。目前，用于HPLC的填料几乎均可用于SPE。但SPE柱的填料粒径大于HPLC填料，SPE柱效会远低于HPLC色谱柱。因此，该方法适于分离保留性质差别很大的化合物，主要用于处理样品。
固相萃取主要用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的分离和富集。例如生物体（如血液、尿等）中药物及其代谢产物的分析、食品中有效成分或有害成分的分析、环保水样中各种污染物（可挥发性有机物和半挥发性有机物）的分析等，都可以使用固相萃取将目标化合物分离出来，并加以富集。