时间：2023-03-01 21:00:15
[关键词] 凝胶色谱法;比阿培南;聚合物
[中图分类号] R927.2[文献标识码]C [文章编号]1674-4721(2010)03(b)-116-02
Determination of high polyler impurities in Biapenem by gel permeation chromatography
MA Jie,ZHAO Yuxin,WANG Guanghui,REN Jiqiu
( Development and Scientific Research Centre,Harbin Pharmaceutical Group CO., LTD. General PharmAceuticalFactory,Heilongjiang Province,Harbin150046, China)
[Abstract] Objective:To develop a method for the determination of high polyer impurities in biapenem. Methods:Gel permeation chromatography method was adpoted.The analytical column was Sephadex G-10 stainless steel column (10 mm×300 mm), the mobile phase A:was phosphate buffer(dissolve 5.59 g of potassium dihydrogen phosphate and 0.41 g monopotassium phosphate in water to make 1 000 ml), and the mobile phase B was water; The flow rate was about 0.3 ml per minute; The detective wavelength was 254 nm; The volume of injection was 200 μl; The column temperature was room temperature;Reference standards Faropenem. Results: The calibration curves of high polyler impurities in biapenem was in good linearite over the range of 100.40～400.55 mg/ml(r=0.999 9). Conclusion: Gel permeation chromatography issensitive,specific,accurate and reliable, it is suitable to the determination of high polyler impurities in biapenem.
[Key words] Gel permeation chromatography;Biapenem;High polyler
比阿培南是美国Wyeth公司研发的新型1β-甲基碳青霉烯类抗生素。β内酰胺类抗生素变态反应与药物中存在的高分子杂质有关[1-2],β内酰胺类抗生素在以水为流动相中可以缔合形成表观分子量较大的缔合物,缔合物在Sephadex G10凝胶色谱系统中色谱行为和高分子杂质一样,Kav=0处表现为单一色谱峰这一特点,采用了自身对照外标法对高分子杂质进行精确定量[3-4],实验表明比阿培南比较难于在水溶液中聚合,且聚合物分子量与单体相差不大,给分离分析带来难度,但比阿培南在受热时会产生高分子聚合物,因此建议将比阿培南聚合物纳入质量控制指标。本文利用葡聚糖凝胶Sephadex G10色谱系统实现了对比阿培南中高分子聚合物的分离分析。
1 试剂与材料
LC-20AT泵,SPD-20A紫外检测器,LCsolution工作站(日本岛津公司); AG135电子分析天平(美国梅特勒托利多公司)。
比阿培南供试品(哈药集团制药总厂,批号:200909001-3、200909002-3、200909003-3);磷酸二氢钾(分析纯,天津市科密欧化学试剂开发中心);水为mili-Q超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:采用葡聚糖凝胶Sephadex G-10不锈钢柱(10 mm×300 mm),流动相A:磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾5.59 g,与磷酸二氢钾0.41 g,加水使溶解成1 000 ml);流动相B:水;流速:0.3 ml/min;检测波长为254 nm,进样量为200 μl。用流动相B为流动相,蓝色葡聚糖2000 进行测定,理论板数为1 429。
2.2 溶液的配制
2.2.1 对照品溶液取法罗培南对照品约10 mg,精密称定, 置10 ml 容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取1 ml 置10 ml 容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀。
2.2.2 供试品溶液取比阿培南约0.2 g,精密称定,置10 ml 容量瓶中,加流动相A 溶解并稀释至刻度,摇匀,立即进样。
2.3 对照溶液重复性试验
以流动相B为流动相,精密量取对照溶液200 μl,连续进样5次,记录峰面积为45 870 295、42 289 715、43 473 020、44 797 807、43 903 176,计算峰面积的相对标准偏差为3.07%,重复性较好。
2.4 对照品溶液浓度与峰面积线性关系考察
取法罗培南对照品10.07 mg,置10 ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0 ml于10 ml量瓶中,用水稀释至刻度,以流动相B为流动相,分别取200 μl注入液相色谱仪,对照品浓度在20.14～201.40 μg/ml范围内对峰面积呈良好线性,回归方程为A=467 413.653 2C-107 018.364(r=0.999 9)。
2.5 高分子聚合物峰的线性范围
因为比阿培南样品200909001-3不含有高分子聚合物,为考察该方法高分子聚合物峰的线性范围,将200909001-3批在105℃放置4 h高温破坏后,分别称取100.40 mg、199.65 mg、400.55 mg配制成不同浓度的供试液, 进样200 μl 测定聚合物的峰面积分别为1 208 775、2 382 568、4 707 626。以比阿培南高分子聚合物的峰面积为纵坐标,浓度(mg/ml) 为横坐标,求得回归方程:Y= 46 874.459 1+11 644.811 0X,r=0.999 9。结果:供试液浓度在100.40～400.55 mg/ml范围内对聚合物的峰面积呈良好线性关系。
2.6 影响色谱行为的因素考察
2.6.1 流速考察 因为比阿培南聚合物为寡聚物,与比阿培南单体分子量十分接近,难于分离,降低流速能使二者分离,分别考察流速为1.0、0.8、0.5、0.3 ml/min时二者分离情况,以流速为0.3 ml/min时分离效果最好。
2.6.2 法罗培南对照品的选择 因为比阿培南比较难于在水溶液中聚合,且聚合物分子量与单体相差不大,很难采用自身对照外标法对高分子杂质进行精确定量[5-6],因此采用结构相似的法罗培南作为外标法的对照品进行计算,并将计算结果乘以0.994。
2.7 样品测定
取供试品约0.2 g,精密称定,置10 ml 容量瓶中,加流动相A 溶解并稀释至刻度,摇匀,立即取200 μl 注入色谱仪,以流动相A 为流动相进行测定,记录色谱图;另取对照品溶液200 μl 注入色谱仪,以流动相B 为流动相进行测定,记录色谱图,按外标法计算,并将计算结果乘以0.994。测定结果为3 批样品(200909001-3、200909002-3、200909003-3) 聚合物含量均为0%。
3 讨论
根据在特定条件下,法罗培南可以缔合形成分子量较大的缔合物,缔合物在Sephadex G10 凝胶色谱系统中和高分子杂质一样,都在Kav=0处表现为单一的色谱峰的特点,本文采用法罗培南作为外标法的对照品对聚合物峰进行定量。用凝胶色谱法测定比阿培南聚合物的含量,方法简便,结果可靠,可以用于比阿培南中高分子聚合物杂质的检测。
[参考文献]
[1]Schwartz MA. Chemical aspects of penicillin allergy[J].J Pham Sci,1969,58(6):643.
[2]Ahlstedt S,Kristofferson A,Svard PO,et al. Ampicillin polymers as elicitiors of passive cutaneous anaphylaxis[J].Int Arch Allergy Appl Immunol,1976,51(1):131.
[3]胡昌勤,金少鸿,孙学兰. 离子对凝胶色谱法分离头孢菌素中高分子杂质[J].中国抗生素,1990,15(5):357.
[4]Changqin H,Shaohong J,Kaimin W. Chromatographic behaviour of cephalosperins in gel filtration chromatography,a novel method to separate high molecular weight impurities[J].J Pharmaceutic B,1994,12(4):533.
[5]胡昌勤,孙丽丽,金少鸿.β内酰胺抗生素在Sephadex G10凝胶色谱中色谱行为的定量关系[J].药物分析杂志,1997,12(2):78.
[6]胡昌勤,金少鸿. 自身对照外标法定量测定β内酰胺类抗生素中的高分子杂质[J].中国抗生素杂志,1997,22(1):23.
【关键词】头孢菌素类药物；凝胶色谱技术；高分子杂质
【中图分类号】R927，2
【文献标识码】A
【文章编号】1672-5158（2012）12-0391-01
目前经国内外临床试验研究证明多数抗生素所致的速发型过敏反应与药品中的高分子杂质有关，可见高分子杂质的含量对药品质量影响很大。所以为了有效提高药品的纯度及减少不良反应的发生，就要不断采取措施减少头孢菌素类药物中的高分子杂质的含量。
一、仪器与实验准备上的注意事项
在采用液相色谱仪测定抗生素中的高分子杂质含量时，应该严格遵守实验室液相色谱仪的检定规程定期进行检定。在仪器的使用过程中要认真参阅操作说明书，严格按照规范操作才能使得测量结果更加准确。
1、仪器准备
在实验准备中，如果采用自行配置的简易仪器或系统应包括输液单元、检测单元和记录及数据处理单元三部分。输液单元应能在实验过程中提供稳定的流速，而检测单元应该满足紫外检测能力，应能向色谱工作站或积分记录仪输出模拟信号，以进行数据的记录和处理。在自行配置的仪器系统中也可以参照液相色谱仪的检测规定，拟定自检规程和技术指标，也要注意定期的检定以此来保证实验的重现性。
2、凝胶色谱柱准备
在色谱柱规格的选择上应该从仪器系统的最大进样能力、所分析样品的溶解能力以及检测限度等方面综合进行考虑。通常凝胶色谱柱的体积小于柱床体积，所以一般头孢菌素抗生素高分子杂质测定的柱床体积应为60ml以上。
3、玻璃柱管的分端及凝胶介质的选取
在玻璃柱管的分端上，一般开口的玻璃柱管可以采用玻璃棉加开口橡胶塞来封端，也可以在一端烧结石英过滤板或者通过直接购买带调节头的商品玻璃柱管。凝胶色谱法在凝胶介质的选取上可选用的凝胶有很多种，目前对抗生素高分子杂质的测定多数采用的是葡聚糖凝胶，选取这种凝胶介质后一定要注意在使用之前需用水充分的溶胀，可以根据需要填制的凝胶柱柱床体积来具体计算用量。如果溶胀使采用蒸馏水浸泡的方式，也可以在温度为4℃的冰箱中放置48小时，也可在水浴中煮沸一小时，这样才能保证溶胀充分。在这两种溶胀方式中都应该注意随时搅拌出去气泡，必要情况下还可以进一步的进行真空脱气。
4、装柱
将溶胀好的凝胶介质用蒸馏水悬浮静置后，每次倾去上层液，以去除凝胶碎屑和杂质。按照这种方法进行多次洗涤，直到上层的精置液澄清为止。实践中可将凝胶介质用水制成悬浆，然后一次性的倒人垂直放置的玻璃柱管中，待凝胶颗粒沉降完毕后即完成装柱。也可在垂直放置的玻璃柱管和漏斗上放开柱管下口，保持液流顺畅，用滴灌逐管从漏斗中加入凝胶悬浆，让凝胶颗粒在蒸馏水中缓慢沉降，注意让漏斗中随时保持一定的凝胶悬浆。运用此种方法会使装柱得时间较长，必要时可以在出柱口增加负压加快装柱时间。另外需要注意新填装的色谱柱要先用水连续冲洗，这样才能让凝胶紧密均匀地填充在柱管中。
5、凝胶柱的维护及恢复
凝胶柱的维护方面要保证柱床的连续性和平整性，如果发现凝胶出现收缩或气泡的情形，就应该及时将凝胶从柱管中倒出以便重新进行装柱。如果仅仅在柱头发现少许污染或破坏，可用小勺将该部分的凝胶挖掉，然后往内加入少量水用玻棒扰动凝胶面，静置到凝胶颗粒达到重新沉降以后封闭柱头。如果在色谱柱中发生严重的非特异性吸附，就有可能改变凝胶色谱柱的分离机制，还有可能造成柱得堵塞使柱压升高，在这种晴况下就要对凝胶进行恢复性的处理。
二、系统适用性实验
系统适用性试验对溶液的制备更加注重方便性和可操作性，系统适用性试验用溶液的配制方法为用主成分对照品与杂质对照品混合配制，但还是会使得有些杂质对照品不能得到，如性质不稳定或分离提取技术要求太高等，但这些杂质峰恰恰又是与主成分峰最难分离的色谱峰。系统适用性试验目前包括很多内容，主要考察对照品测定系统与高分子杂质测定系统中蓝色葡聚糖2000溶液峰的保留时间的比值，以及理论板数和拖尾因子，以此来控制对照品测定与高分子杂质测定时仪器状态的同一性。在以蓝色葡聚糖2000的保留时间来表示高分子杂质的保留特征时，对照品色谱峰及高分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖2000溶液色谱峰保留时间的比值都应控制在一定的限度内，由此才能实现对色谱柱状态的正常控制。
三、操作方法上的注意事项
1、样品溶液及对照溶液的制备
具体操作中必须要按规定的标准来配制样品溶液，由于某些高浓度抗生素溶液具有一定的不稳定性，所以通常对样品溶液采取即溶即进的形式。对照溶液的制备上，要注意头孢菌高分子杂质的含量测定，通常以样品自身在SDS水溶液或纯水中的缔合物作为对照进行定量。在制备缔合物时特别要注意对浓度及水的纯度的控制，以此来保证缔合完全。
2、进样及进样方式
由于头孢菌素高分子杂质的含量测定，需要对照溶液分别在不同流动相状态下进样，所以更换流动相后凝胶色谱柱应充分平衡后才能进样。进样方式可以采用色谱仪自动进样，也可以选取手动的方式，但是两种进样方式都必须要做到色谱柱端没有死体积，这样才能避免样品的扩散造成峰展宽甚至影响分离。在自动进样操作时可以参照有关液相色谱操作规程进行，手动进样方式主要用于开口柱。
3、凝胶面的平整
手动进样时还要注意保持凝胶面的表面平整。进样前用滴灌吸掉凝胶上的液体保持色谱柱下端流畅，待柱内液体降至凝胶面之下时再用定量器具精密量取规定体积的样品溶液，然后加入到色谱柱凝胶表面上，等到样品溶液降至凝胶表面以下时再吸取少量流动相沿色谱柱管内壁缓缓加入，以洗下残留在色谱柱管壁的样品溶液，再从柱顶端加入一定量的流动相，并恢复流路，开始记录进样时间。
4、记录对照及结果
要分别记录样品和对照溶液的色谱图，积分对照溶液的峰面积和样品溶液中处于外水体积的高聚物杂质面积，按外标法以峰面积计算样品中高分子杂质的含量。按平行实验的平均值作为样品中高分子杂质含量的最终结果，并与标准规定限度比较后作出是否符合规定的判断。
5、样量分析
在一般高效液相色谱仪上使用凝胶柱，应严格限制泵压。由于一般高压液相色谱管路和检测器通路狭窄，极易发生堵塞，所以要注意尽量减少将出柱液连接到检测器的时间，尤其是新填充的色谱柱更应经水或流动相充分平衡后再连接到检测器。
结束语
【关键词】 高效凝胶色谱法； 多花黄精多糖； 分子量及其分布
多花黄精多糖是从传统中药百合科植物多花黄精中发现并分离出一种低分子量活性多糖，为新药(中药)原二类,全国第一个治疗病毒性角膜炎的中药。多花黄精多糖抗单纯疱疹病毒i型的体外细胞培养试验结果结果表明,多花黄精多糖有明显的抗单纯疱疹病毒i型的作用。多糖为单糖的天然聚合物，多糖的性质和药理作用与其分子量大小，分子量分布及其结构密切相关。多糖的分子量不是均一的，具多分散性，需要用统计方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝胶色谱法测定多糖的分子量及其分布，具有快速，重现性好等优点，在国内外得到了广泛的应用[1]。多花黄精多糖为水溶性多糖，针对其单糖组成和空间结构与葡聚糖相似，在色谱柱的选择上倾向于更适合于水溶性多糖分离测定用的shodex ohpak sb?803hq系列（对葡聚糖的排阻极限为1×105）。有关多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布尚未见相关报道，本文应用凝胶渗透色谱（gpc）法测定多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布[2]，为考察生产工艺的稳定一致性及控制产品质量提供了科学依据，为多花黄精多糖分子大小和药理作用的相关性研究打下了一定基础。
1实验部分
1.1仪器与试药
agilent 1100型高效液相色谱仪（自动进样器），示差折光检测器。shodex ohpak sb?803hq凝胶色谱柱。北京龙智达公司提供gpc专用软件。
供分子量测定用右旋糖酐分子量标准对照品（中国药品生物制品检定所提供，d0、d1、d2、d3、d5、d6、d8、d2000分子量依次为180、2500、4600、7100、21400、41100、133800、2000000）；其余试剂均为分析纯；高纯水用millipore?q超纯水系统制得。
试验用样品多花黄精多糖由四川泰华堂制药有限公司提供。
1.2方法与结果
1.2.1色谱条件色谱柱为shodex ohpak sb?803hq，流动相为0.71%硫酸钠溶液（内含0.02%叠氮钠），柱温：35 ℃，示差折光检测器（检测器温度35 ℃），流速0.5 ml·min－1，取供试品溶液及对照品溶液各20μl注入液相色谱仪。
1.2.2溶液的制备取多花黄精多糖适量，加流动相制成每1 ml中约含10 mg的溶液，振摇，室温放置过夜，作为供试品溶液。另取d0，d2000及4～6个已知分子量的葡聚糖对照品，同法制成每1ml中各含10 mg的溶液作为对照品溶液。
1.2.2.5系统适应性试验取葡萄糖对照品溶液（d0），按1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，按葡萄糖峰计算理论塔板数n=5.54×trw1/2=16083；另取d2000对照品溶液，1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，计算分配系数，kd=tr?t0tt?t0=0.52，kd在0～1之间，符合中国药典2005年版的要求。式中tr为供试品峰保留时间，t0为蓝色葡聚糖（d2000）峰保留时间，tt为葡萄糖（d0）峰保留时间。
1.2.3标准曲线的制备及样品测定
取上述右旋糖酐系列对照品溶液分别进样，记录洗脱峰的保留时间，由gpc专用软件绘制标准曲线，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得回归方程。该方法的标准校正曲线线性良好，相关系数达0.9997。根据gpc专用软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间采用gpc专用软件计算样品各组分的重均分子量及其分子量分布。 表1 右旋糖酐分子量标准对照品保留时间及其相应的对数值
1.2.4 精密度试验取供试品溶液20 μl，按“1.2.1”项下色谱条件，连续测定5次，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5018，5009，5009，5028，5017，rsd为0.16%，表明该系统测定样品分子量的精密度良好。
1.2.5重复性试验取批号为060701的样品，按“1.2.2”项下方法分别制备供试品溶液5份，按“1.2.1”项下色谱条件测定分子量及其分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5020，5028，5044，5054，5053，rsd为0.30%。表明该分析方法测定样品分子量精密度良好。
1.2.6稳定性试验取同一供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件，在0h、2h、4h、8h、12h和24h分别进样，测定分子量及分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5055，5090，5100，5126，5160、5046，rsd为0.84%。表明供试品溶液在24小时内稳定。
1.2.7样品的测定取不同批号的多花黄精多糖样品，按“1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，然后按“1.2.1”项下的色谱条件测定分子量及分子量分布，结果见表2。表2 3 批样品重均分子量及其分布情况表
2讨论
根据以上测定结果可见，测定的三批多花黄精多糖的重均分子量分布在2500～7500之间，分布宽度小于2.0。用本方法测定多花黄精多糖的分子量与分子量分布，准确可行，简便快捷，精密度好。
分布宽度的引入，使多花黄精多糖的分子量分布更具可控性，能够通过检测该指标反映生产该样品的工艺的变化以及样品质量的变化，使得样品的质量更具有可控性。
【参考文献】
[关键词] 复方鬼臼毒素凝胶；有关物质测定；高效液相色谱法
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）01（b）-114-04
RP-HPLC determination related substances of Podophyllotoxin of Compound Podophyllotoxin Gel
FENG Caili1 YU Yong2 JIANG Lixin1 ZHANG Hongshan1
1.Beijing Staidson New Medicine Research Limited Company, Beijing 100176, China; 2.Beijing Saisheng Pharmceutical Co., Ltd, Beijing 100176, China
[Abstract] Objective To establish the HPLC method for determination related substances of Podophyllotoxin in Compound Podophyllotoxin Gel. Methods Kromasil ODS-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used as stationary phase. The mobile phase was the solution containing Phosphoric acid salt solution (Dipotassium hydrogen phosphate 17.12 g, dissolved with the 1 000 mL water, shaking to adjust the pH value to 7.5 with the thin Phosphoric acid) - methanol (48∶52); flow rate was 1.0 mL/min, wavelength of UV detection was 292 nm, and temperature of column was 30℃. Results The detection limits was 1.22 ng (S/N=3), which met the requirement with the impurity resolution and the repeatability for related substances for Podophyllotoxin. Conclusion This method is simple, accurate, quick and very good specificity, and can be applied to the determination related substances of Podophyllotoxin in Compound Podophyllotoxin Gel.
[Key words] Compound Podophyllotoxin Gel; Determination related substances; HPLC
高纯度的鬼臼毒素治疗生殖器疣疗效显著，且无系统性毒副作用。作为目前治疗尖锐湿疣的一线药物，鬼臼毒素酊剂在临床已应用多年，其治疗作用得到广泛的肯定。酊剂在使用过程中会对皮肤产生较大的刺激性，应用后局部皮肤黏膜糜烂，给患者造成较大的痛苦。为提高患者的依从性，临床使用时会联合局麻药，比如盐酸利多卡因等，以减少鬼臼毒素的刺激性，从而增加患者的依从性。本公司通过摸索应用现代制剂技术将鬼臼毒素和盐酸利多卡因两个药物进行组合研制出复方鬼臼毒素凝胶剂，该剂型比现有的酊剂、膏剂、激光治疗有明显应用优势，大大提高了患者的依从性。以往文献中均报道鬼臼毒素的各种含量测定方法，但无有关物质方面的研究，实际鬼臼毒素受pH影响，易被氧化，本制剂中除含有凝胶剂的常用辅料，还含有盐酸利多卡因局麻药，为考察本复方中鬼臼毒素是否稳定，并且不受盐酸利多卡因的干扰，笔者通过摸索建立了鬼臼毒素的有关物质测定方法，从而更好地评价含鬼臼毒素的各种制剂的质量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（岛津：型号LC-20AT，LC-solution工作站，SPD-20A检测器，CBM-20A控制器），CX-250型超声波清洗器（北京市医疗设备二厂）。
复方鬼臼毒素凝胶（北京舒泰神新药研究有限公司，批号：20100111、20100114、20100118），鬼臼毒素原料药（福建华海药业有限公司，批号：091201），盐酸利多卡因原料药（山西新宝源制药有限公司，批号：20070501），鬼臼毒素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111645-200301），甲醇（Burdick & Jackson，色谱纯），其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
2.1.1 色谱柱
Kromasil ODS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以磷酸盐溶液（取磷酸氢二钾17.12 g，置1 000 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用稀磷酸调pH值至7.5）-甲醇（48∶52）为流动相；检测波长为292 nm；柱温为30℃。理论塔板数按鬼臼毒素峰计算应不少于5 000。
2.1.2 测定方法
取本品3 g（约相当于鬼臼毒素15 mg，盐酸利多卡因60 mg），置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，强力振摇，使凝胶溶解，过滤，弃去初滤液，取续滤液即为供试品溶液。精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液Ⅰ。另取不含鬼臼毒素的凝胶空白辅料同法配制，作为空白辅料溶液。精密量取对照溶液20 μL，注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主峰峰高约为满量程的20％。再精密量取空白辅料溶液及供试品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的4倍，供试品溶液若显杂质峰，扣除空白辅料溶液色谱峰后，量取各杂质峰的峰面积总和，应不大于对照溶液主峰面积的2倍。
2.2 方法验证过程
2.2.1 专属性试验研究
为使方法具有很好的专属性，分别进行了如下试验研究：
2.2.1.1 复方鬼臼毒素凝胶（不加盐酸利多卡因）样品的破坏试验 凝胶样品（不加盐酸利多卡因）溶液：取本品3 g（约相当于鬼臼毒素15 mg），置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，强力振摇，使凝胶溶解，过滤，弃去初滤液，取续滤液作为凝胶样品溶液A。分别取凝胶样品溶液A适量进行酸、碱、氧、高温、光照的破坏试验，分别取各破坏样品过滤后，精密量取20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，由图1可知，不加盐酸利多卡因的凝胶破坏色谱图中，各色谱峰均在50 min之前出峰，各峰分离度符合要求。
2.2.1.2 复方鬼臼毒素凝胶（不加鬼臼毒素）样品的破坏试验 取凝胶（不加鬼臼毒素）样品3 g（约相当于盐酸利多卡因60 mg），置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，强力振摇，使凝胶溶解，过滤，弃去初滤液，取续滤液作为凝胶样品溶液B。分别取凝胶样品溶液B适量进行酸、碱、氧、高温、光照的破坏试验，分别取各破坏样品过滤后，精密量取20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，由图2可知，不加鬼臼毒素的凝胶破坏色谱图中，扣除溶剂峰后，只在50 min之后出现一个色谱峰，即盐酸利多卡因的色谱峰，由于出峰时间比较长，所以保留时间有波动，但不干扰鬼臼毒素各峰的检验。
2.2.1.3 复方鬼臼毒素凝胶样品的破坏试验 取凝胶样品3 g（约相当于鬼臼毒素15 mg，盐酸利多卡因60 mg），置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，强力振摇，使凝胶溶解，过滤，弃去初滤液，取续滤液即为供试品溶液。分别取供试品溶液适量进行酸、碱、氧、高温、光照的破坏试验，分别取上述溶液样品过滤后，精密量取20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，由图3可知，50 min之前出现的色谱峰与不加盐酸利多卡因的凝胶破坏色谱图中出现的色谱峰基本一致，即均为鬼臼毒素产生，而在50 min之后出现的色谱峰，均与不加鬼臼毒素的凝胶（只含盐酸利多卡因）破坏色谱图中出现的色谱峰一致，即扣除50 min之后色谱峰后，即为鬼臼毒素产生的色谱峰，不干扰鬼臼毒素各峰的检验。
2.2.2 检测限
取鬼臼毒素对照品适量，精密称定，用甲醇-水=40∶60（pH=4.0）溶解稀释制成浓度为0.061 μg/mL的溶液，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，此时主峰峰高约为基线噪音的3倍，即检测限（S/N=3）为0.61 ng。
2.2.3 精密度试验
取鬼臼毒素对照品适量，精密称定，用甲醇-水=40∶60（pH 4.0）溶解稀释制成浓度为0.3 mg/mL的溶液，连续进样6次，主峰峰面积的RSD为0.27%，符合要求。
2.2.4 稳定性试验
取凝胶样品3 g，按“2.1”项下方法，制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h测定，记录色谱图中鬼臼毒素的杂质峰面积，提示溶液在8 h内稳定。结果见表1。
2.2.5 重复性试验
取凝胶样品，照“2.1”项下测定方法平行配制6份供试品溶液并测定有关物质，结果6份样品的有关物质平均值为0.20%，RSD符合要求。
2.3 三批样品有关物质测定
取复方鬼臼毒素凝胶样品（批号：20100111、20100114、20100118）及空白辅料适量，精密称定，按“2.1”项下方法测定，三批样品的有关物质分别为0.21%、0.23%、0.25%。
所有检测均在仪器通道A（Channel A）下进行。
3 讨论
3.1 流动相的选择
参考文献[1-3]并根据大量预实验液相条件摸索结果可知，在甲醇-0.1 mol/L磷酸氢二钾（pH=7.5）系统中，鬼臼毒素保留时间适中，峰形较好，对该流动相系统进一步考察发现，当甲醇-0.075 mol/L磷酸氢二钾（调pH=7.5）为48∶52时可获得最优峰形，且杂质与主峰分离良好，因此确定流动相为：磷酸盐溶液（取磷酸氢二钾17.12 g，置1 000 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用稀磷酸调pH值至7.5）－甲醇（48∶52）。在流动相摸索过程中，发现柱温对本品的的鬼臼毒素及盐酸利多卡因保留时间有影响，因此控制本品的柱温为30℃
3.2 溶解样品溶剂的选择
由于鬼臼毒素在pH值高的环境下不稳定，且鬼臼毒素几乎不溶于水，而略溶于甲醇及无水乙醇；盐酸利多卡因易溶于水及无水乙醇。所以应选择pH值低的、并含有一定比例的有机溶剂来溶解鬼臼毒素原料，通过试验可知，在甲醇-水=40∶60（pH=2.0～4.0）的溶剂中，鬼臼毒素稳定，但低pH值下，损伤色谱柱，因此选择甲醇-水=40∶60（pH=4.0）作为溶剂来溶解鬼臼毒素及盐酸利多卡因原料。
凝胶样品的辅料中含有增溶剂及水溶性高分子物质，并且pH值（3.0～5.0）较低。曾采用甲醇-水=40∶60（pH=4.0）的溶剂来溶解样品，结果过滤困难，所以考虑直接用水稀释样品，具体方法为取凝胶样品3 g，置50 mL量瓶中，加水适量，振摇使凝胶溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液备用。试验结果表明，采用水来溶解样品，易于过滤，并且样品溶液的稳定性符合要求。
3.3 测定波长的选择
称取鬼臼毒素对照品适量，用甲醇-水=40∶60（pH=4.0）的溶剂配制成每毫升约含50 μg的溶液，作为供试品溶液，取供试品溶液适量，照紫外分光光度法在200～400 nm波长范围内扫描。结果显示，鬼臼毒素在292 nm、216 nm波长处有最大吸收。另取原料、辅料及专属性项下破坏的样品，采用液相色谱法分别在220 nm（因216 nm波长太低，基线不平稳）、292 nm下检测，结果显示，在292 nm波长处检出的杂质峰个数及响应值均比220 nm波长处检出的多，但在292 nm波长处检出的辅料峰更少，因此，为减少辅料干扰以及近紫外区易造成的基线漂移和噪声干扰，同时参考国家药品标准WS1-（X-043）-2002Z鬼臼毒素项下有关物质的检测波长为292 nm，因此本品选择292 nm作为有关物质检查的测定波长。
3.4 有关物质研究
本品为复方制剂，对复方制剂的有关物质研究的文献报道较少，一般由于主药成分性质的差异，很难采用一个色谱条件将主成分各杂质峰及降解产物峰分开，本实验中曾摸索采用同一个色谱条件分析鬼臼毒素与盐酸利多卡因有关物质，结果或是杂质与主峰的分离度达不到要求，或是两个主峰的杂质峰之间相互干扰，降解产物峰分不开，或是保留时间太长。所以考虑采用两种液相条件分别对鬼臼毒素及盐酸利多卡因进行有关物质考察，本文对鬼臼毒素的有关物质进行了详细研究，从专属性研究结果可知，采用本色谱条件，空白辅料及盐酸利多卡因不干扰鬼臼毒素有关物质的检测，破坏条件下产生的色谱峰均为鬼臼毒素产生的色谱峰，与主峰的分离度符合要求。
综上所述，采用HPLC测定复方鬼臼毒素凝胶中鬼臼毒素的有关物质，专属性好，准确度高，重现性好，可用于本品的质量控制，同时本研究也为复方制剂的有关物质研究提供了一种研究思路。
[参考文献]
[1] 刘婵，陈志良，李国锋，等.高效液相色谱法测定鬼臼毒素固体脂质纳米粒的含量[J].医药导报，2006，25（9）：953-954.
[2] 杜丹荣，陈华兵，常雪灵，等.反相高效液相色谱法测定微乳凝胶剂中鬼臼毒素的含量[J].中国新药杂志，2007，16（10）：788-791.
[3] 张杰，周春山，向大雄，等，高效液相色谱法测定小八角莲中鬼臼毒素含量[J].湖南中医杂志，2007，23（4）：101-102.
关键词：SBS改性沥青；GPC ；改性机理
Abstract: Through the microscopic analyses of modified asphalt with different variety and different SBS dosage in Gel permeation chromatography, the relation between the dosage of SBS and the area ratio of Spectrum of SBS modified asphalt is obtained. the basis of evaluating the quality of SBS modified asphalt in thermal performance Microscopic analysis is provided.
Key words: SBS modified asphalt, GPC , Mechanism of Modification
中图分类号：TF526+.3文献标识码：A 文章编号：
1.前言
凝胶渗透色谱法又称分子排阻色谱法，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试[[
参考文献：
[1] 赵晶, 张肖宁. 凝胶渗透色谱法研究改性沥青机理[J]. 哈尔滨：哈尔滨建筑大学学报，2000.]]。
凝胶渗透色谱的分析原理是：让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。当聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。自试样进入色谱柱直到被淋洗出来，所接受得到淋出液的总体积称为该试样的淋出体积[[[2] 施良和. 凝胶色谱法[M]. 北京: 科学出版社,1980.11. ]]。
当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。
试验基于凝胶色谱技术，对比分析SBS改性剂分子改性前后分子量数值，从而研究改性后SBS改性沥青粘度增长原因。在前面的章节中，已经了解到SBS种类、SBS剂量大小等对改性沥青粘度的影响，希望可以借助GPC从微观或亚微观角度给出合理解释。
2.GPC对SBS改性沥青结构分析
基于凝胶色谱分离速度高、适用性广、重现性佳以及自动化高等优点，被广泛用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试的研究工作中。对于SBS改性沥青而言，SBS改性剂与沥青小分子间，分子量显著差异是应用GPC最直接的理由。通过GPC试验，可以快捷、准确的测定SBS改性剂分子的数均分子量、重均分子量等，分析SBS改性剂平均分子量的变化与流变特性变化的关系。
在SBS改性剂的体系中，数均分子量等于SBS改性剂的总重量除以所含SBS改性剂中各种分子量的总摩尔数。由式1所示：
（式1）
SBS改性剂的重均分子量，是指体系中各种分子量的质量分数与相应分子量相乘，所得乘积的总和。可由式2表示：
（式2）
2.1 GPC试验数据
本文在试验中，应用GPC对不同种类改性沥青的SBS改性剂分别进行分子量测试。分别记作L-YY、S-YY、L-YS、S-YS。试验结果如表1。试验数据表明，SBS改性剂在改性之后平均相对分子质量均增大，表明在改性过程中，SBS微粒之间发生交联反应，生成交联结构，从而使平均相对分子质量增大。
在图1、图2、图3和图4中，改性剂掺量为零时，粘度值最小，当加入SBS改性剂进行改性后，其粘度值增加，这与表1中，改性沥青分子量增加相一致，即随着分子量的增加，其粘度值也随之增加。
根据表2中150℃时的粘度数据，分别绘制线性结构L-YS与星型结构S-YS在150℃下的粘度图，如图5与图6所示。在图中，可以发现与图.3相同的变化规律，即随着改性后分子量的增加，粘度值增大。
图5SL-YS改性前后150℃粘度比较
表1中，L-YS的Mn，由139 721上升至214 567，变化了74846；S-YS的Mn，由158 782上升至257 335，变化了98573。在图5中，L-YS粘度值变化的趋势线斜率为130，而在图6中，S-YS粘度值变化趋势线的斜率为247.5，大于L-YS变化趋势。图5与图6比较发现：不同改性剂改性后，粘度增加速率不同，即改性后分子量增加的多少，会影响粘度值增加的快慢。
图6SS-YS改性前后150℃粘度比较
2.2 GPC试验分析
SBS作为一种高聚物分子（分子量大于10万），它与分子量低于5万的沥青分子性质迥异，由于分子量差别巨大，致使其溶解度参数也呈现出明显差异，因此SBS改性剂在沥青中根本不可能自发主动相容，亦不会均匀分散其中，因此，SBS改性剂与沥青的改性过程必然需要外力的推动，即：高温条件，高速剪切。
SBS改性剂是一种高分子聚合物，硬段、软段兼而有之。当改性沥青进行改性时，温度升高，使分子的热运动加剧，SBS高分子聚合物的化学键在高速剪切的情况下，也会出现不稳定，继而与SBS高分子或与沥青的小分子发生交联反应，聚合而成分子量更高的聚合物。同时，由于稳定剂的作用，SBS改性剂的更多嵌段打开生成自由基，也为SBS改性剂的聚合提供了条件。当SBS改性沥青中，改性剂分子之间发生物理缠结或化学胶结，空间结构更为复杂、发达，粘滞性增强，使沥青的路用性能
改善[[[3] 赵晶, 张肖宁, 于桂珍等. 应用凝胶渗透色谱法研究改性沥青机理[J]. 哈尔滨建筑大学学报，2000，33(2)：83―85．
]]。SBS改性的过程就是一个交联的过程，SBS分子量逐渐增加，其抵抗外力作用的内摩阻力增加，在宏观表现出来的便是粘度值增大。
由图7改性沥青分子量的变化示意图可以看到：改性后，大分子量的颗粒增加，对应分子量含量增加，分子量对数值增加，亦如图中箭头所示。
图7SBS改性后分子量变化示意图
根据图7，同样可以确认利用GPC分析SBS改性剂分子量变化，从而研究SBS改性沥青在改性机理的微观分析是可行的。同样，为SBS改性沥青中各组分含量的测试，质量监控提供了新的监督思路与途径。
3．结论
在试验中，借助凝胶色谱对分子量的分析，为了更好的研究SBS改性沥青改性过程中后，SBS微粒及沥青的变化，以及SBS微粒与沥青数量比的问题。根据试验结果，可以发现SBS微粒在与沥青改性后，分子量增大。SBS高分子或与沥青的小分子发生交联反应，聚合而成分子量更高的聚合物。同时，由于稳定剂的作用，SBS改性剂的更多嵌段打开生成自由基，也为SBS改性剂的聚合提供了条件，这也是沥青性能得以改善的重要原因。该方法也有效表征了在改性沥青改性过程中，改性剂SBS与沥青交联结构的变化过程。改性沥青加工中，SBS发生交联反应，平均分子量增大。
由试验数据同样可以得到：以图6为例，随着SBS改性剂掺量的增加，改性后的SBS分子量增加，其粘度值增加，即粘度值变化与SBS微粒与沥青数量比有很大关系。当SBS在改性后，分子量增加，其分子量与沥青的分子量将会产生更大的差异，根据凝胶渗透色谱的分析原理中分子量差距越大，越容易分析可知：GPC可以成为一种快捷、准确、客观评定SBS改性剂掺量的方法。
参考文献：
[1] 赵晶, 张肖宁. 凝胶渗透色谱法研究改性沥青机理[J]. 哈尔滨：哈尔滨建筑大学学报，2000.
[2] 施良和. 凝胶色谱法[M]. 北京: 科学出版社,1980.11.
[3] 赵晶, 张肖宁, 于桂珍等. 应用凝胶渗透色谱法研究改性沥青机理[J]. 哈尔滨建筑大学学报，2000，33(2)：83―85．
【关键词】：中药材 色谱法
【中图分类号】R45;R96【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2008)4-0044-04
我国中药材品种繁多､资源丰富药用动植物达1万余种，在当今世界“回归自然”思潮影响下，寻找天然药物的呼声日渐高涨，因而对于我国这样的中药材大国首要任务是建立一套切实可行的鉴别方法和质量保障体系。很多中药材形态相似，加工处理后形态结构易发生改变，目前采用的经典植物鉴定，性状鉴定和显微鉴定等研究方法由于鉴定标识建立在个体形态和客观观测水平上，因而存在主观性强､重现性和稳定性差等不足[1]。而分子标记技术又存在方法不够完善，资料不丰富，成本偏高无法推广到生产第一线的缺点[2]。相比之下，色普法已成为中药材鉴定中不可缺少的常规而有效的方法，尤其是对成分复杂的中药材有分离分析鉴定的双重优势。随着化学分析色谱技术的成熟和广泛应用，20世纪70年代，人们将中药中的化学成分展开于由各种不同载体制成的薄层板､纸片､胶片等物体上，不同的生药成分显现出不形状，颜色的斑点或条纹等，人们可根据斑点或条纹的位置(Rf值)､颜色､数目等特征来鉴别生药真伪和质量，从而创立了色谱法。目前常用的色谱法有薄层色谱法､气相色谱法､纸色谱法､高效液相色谱法､毛细管电泳和凝胶电泳等。
1 薄层色谱法(TLC)
薄层色谱(TLC)由于操作简单､直观､经济､适用范围广阔，在中药鉴别中应用频率最高。目前，常用的薄层色谱法有高效薄层层析法､薄层扫描法和反相薄层色谱法等[3]。
1.高效薄层层析法(HPTLC)：HPTLC的薄板采用更加细致均匀的吸附剂用喷雾法制成，提高了分离效果，增强了重现性。张虹将榧属植物叶的提取物经TLC法初步分离，再用HPTLC法测定紫杉酸的含量，具有良好的回收率，可用于定量检测[4];米莉莉等用高效薄层色谱扫描法对天然虫草与人工虫草菌丝体中核苷类有效成分进行含量测定，同时建立了不同虫草样品的荧光淬灭薄层色谱图谱[5];伍庆等用HPTLC法建立了快速测定知母药材中菝琪皂苷元的方法[6];曾长青等用高效硅胶薄层板对动物药不同蛇胆胆汁酸的14种组分进行测定，发现有相似组成[7]。
1.薄层扫描法(TLCS)：应用薄层扫描仪将薄层板转换成薄层图谱的方法叫做薄层扫描法(TLCS)[8]。TLCS所得到的图谱比目测的层析图谱更为客观准确。张尊听等以高效薄层色谱扫描法测定野葛根中游离葛根素和总葛根素含量[9];苏淑分等使用薄层扫描法测定不同品种和产地化甘草并建立了指纹图谱，可以快速的对药材品质作出评判[10];颜玉贞等完成了黄连的指纹图谱研究[11];苏微微等完成了黄参的薄层扫描指纹图谱[12]。
1.3 反相薄层色谱(RPTLC)：当薄层色谱中流动相的极性大于固定相极性时，就形成了反相薄层色谱(RPTLC)，RPTLC主要用于极性成分复杂的药材样品。张子忠等对不同产地不同时间采收的蔓荆2种》荆素和对羟基苯甲酸进行了RPTLC定量分析比较考察了多种因素对结果的影响，同时优化了实验条件，用于蔓荆子中上述两种成分分析前者回收率93.9%，后者回收率91.2%[13]。
2 气相色谱法(GC)
气相色谱法(GC)以气体为流动相，适合于挥发性成分或通过衍生化后能汽化的成分的定性定量分析，有灵敏度高､操作简便､样品无须化学前处理､提供信息量大等优点。目前使用频率较高的有裂解气相色谱(适用于不挥发成分)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)等。
2.裂解气相色谱：该发将样品放入裂解器内，在一定条件下加热样品使其瞬间裂解，生成可挥发的小分子，立即被载气带入气相色谱系统分析拄上，分离后得到裂解气相色谱图。袁敏等用此法比较了不同产地连翅的气相色谱图，13种样品的色谱图近似，重叠率达89%以上[14]。
2.气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)：将气相色谱与质谱联合使用的一项技术即为GC-MS。徐勤等GC-MS对前胡中的白花前胡丙素，丁素和紫花前胡苷的含量进行研究，发现前胡两种标准药材的图谱差异显著，证实了药典前胡的2个品种化学成分不同的说法[15];魏刚等采用GC-MS法对不同产地广藿香､组织培养广藿香､超临界提取广藿香､广藿香对照品共21品种进行了组分分析，发现石牌藿香与高要海南藿香相比，11个成分相对含量均有显著差异，而高要与海南藿香无明显差异[16];徐春艳等用此法测定出黄连与肉桂配伍后桂皮醛含量下降，下降程度与黄连比例有关[17];梁永枢等在水蒸气蒸馏法提取的挥发油中，用GC-MS对其成分进行分析，分离出20个组分，鉴定出其中的6种组分，并首次从沉香挥发油中分析得到Guaiol和α-Copaen-11-ol[18]。
3 纸色谱
纸色谱(纸上层析)属于分配色谱的一种。主要用于多功能团或高极性化合物如糖､氨基酸等水溶性成分的分析分离。目前在中药材中应用较少。
4 高效液相色谱法(HPLC)
HPLC和其他分离方法相比有柱效高､灵敏度高､分离迅速性和重复性好等特点，若配以不同的检测器，可对多种药物成分进行分析，一般用于含量测定，也可根据特征色谱峰进行定性分析[19～20]。曾宪仪等用HPLC法测定枳壳､枳实中辛弗林和N-甲基酪胺的含量，结果发现枳实中辛弗林和N-甲基酪胺的含量高于枳壳[21];曹爱民等用HPLC法测定出了决明子中大黄酚含量，含量测定结果线性关系良好，平均回收率99%[22];杨国红采用HPLC法对中成药两个制剂中桂皮醛进行测量，样品量在0～0.15范围内呈线性关系，表明本法适用于对含桂皮醛成分的中成药进行质量控制[23];另有文献建立连翘､红花､刺五加等的HPLC指纹图谱，以鉴别区分不同来源､不同产地中药材[24～25]。HPLC与现代检测器相结合又产生了一些新技术：液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)，Park等用HPLC-ELSD法同时分离和测定了人参皂甙Rb､Rc､Rd､Re､Rf､Rg和Rh等[26];液相色谱-质谱(LC-MS)，Van Breemen等首次将LC-MS技术用于人参粗提取物中的人参皂甙[27];反相高效液相色谱，张丽艳等用此法测定喜树碱含量随生长月份增加而递增规律，为药材采收时间的确定提供了依据[28]。
5 高效毛细管电泳(HPCE)
HPCE是20世纪末发展起来的一种高效快速分离技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物[29]，有分离模式多､分离效率高､速度快和分析范围广阔的特点。王演以HPCE法对不同属群大青叶药材的理化特征进行分析，发现异地栽培的不同属群大青叶药材的化学成分和含量差异显著[30];沈阳等测定不同种类甘草药材中甘草酸的含量程良好线性关系，本法适用于甘草酸含量的测定[31];张朝晖等用高效液相色谱法测出大海马､线纹海马､刁海马､刺海马､小海马､贡氏柄颌海龙､三斑海马､粗吻海龙､海鱼､拟海龙､尖海龙和宝珈海龙12种海马海龙类药材的电泳图谱，为海马海龙类药材鉴定提供了依据[32]。等提取菟丝子种子植物蛋白用高效液相色谱法进行生药鉴定，结果表明，同属不同种菟丝子的碱溶性和酸溶性蛋白在成分和含量上均有显著差异，根据其种子植物蛋白的电泳图谱可有效鉴别菟丝子的来源[33];孙国祥等用HPCE法对射干的水提取液进行指纹图谱研究，计算出不同产地射干的CEFP的相思度(S)大于0.92，证明不同产地的射干在化学成分的分布上是十分相似的[34];王实强等采用HPCE，用外标峰面积法测定婴栗壳中可待因吗啡和婴栗碱的含量取得了满意的效果[35];丁原菊等采用高校毛细管电泳法对紫柴胡中柴胡皂甙a与d对映体进行分离和测定取得良好的结果，柴胡皂甙a与d的回收率达97.1%[36]。
6 凝胶电泳
凝胶电泳技术自20世纪80年代初传入我国，石俊英教授等率先将现代生物技术与传统的中药学科相接合，经多年潜心研究和实践，创建了“中药电泳鉴别法”新技术，并在动植物类中药材鉴别中广泛应用。目前重要的电泳鉴别多集中在蛋白质的鉴别上，蛋白质又分为贮藏蛋白和同功酶两种。
6.贮藏蛋白电泳(凝胶蛋白电泳)：不同蛋白质因存在分子大小空间结构和电荷数目上的差异，可以通过电泳得到分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)与其他分析手段相比具有分辨率高､性能稳定､凝胶孔径可调等优点，是目前常用的蛋白质分离分析手段。金跃明等用缓冲叶提取样品中蛋白质，在10%连续的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，结果鹿鞭与其主要伪品牛鞭的电泳图谱有明显区别，不同品种鹿鞭电泳图谱也有明显区别[37];赵华英等应用蛋白质电泳得出青葙子､牛膝子､鸡冠花子､皱果苋子､苋子和反枝苋子的6种种子电泳图谱，准确的鉴别出了苋科6种种子类药材[38];赵晓荣等用蛋白质电泳得出了马鹿鞭､海狗鞭､黄狗鞭和海象鞭的清晰图谱，准确的鉴别出了4种鞭类药材，还观测出黄狗鞭与马鹿鞭样品图谱极为相似，从而提出用黄狗鞭代替马鹿鞭的设想[39];李锋等用SDS-PAGE法对羚羊角山羊角､黄羊角､绵羊角和藏羚羊角急性了电泳图谱比较，发现各样品有不同的蛋白质成分，成功的区分了这5种角类药材[40]。
6.同功酶电泳研究：同功酶是指催化作用相同而分子结构不同的一组酶，它存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中。同功酶的结构差异来源于基因差异，能稳定的遗传给后代。因此可以根据同功酶分子结构差异用电泳法来分离。常由于电泳法分离的同功酶有乳酸脱氢酶同功酶､过氧化物酶同功酶和酯酶同功酶等。
6.2.乳酸脱氢酶(LDH)同功酶：20世纪50年现乳酸脱氢酶以来[41]，同功酶用于动植物的分析鉴别也紧随而至。李大均采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对巨蜥的血清､脑､肾､肝､心肌､骨骼肌和小肠的乳酸脱氢酶(LDH)同工酶进行分离和测定.结果表明，LDH同工酶具有明显的组织特异性[42];任文华等采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对刺猬(Erinaceusdealbatus)及游蛇科的黑眉锦蛇 (Elaphetaeniura)､红点锦蛇(E.rufodorsata)和赤链蛇(Dinodonrufozonatum)等在冬眠期和活动期骨骼肌､心肌､肝等的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)同工酶谱进行了分析，并用比色法测定了以上各种组织的LDH活性，结果表明：LDH同工酶的电泳图谱只有红点锦蛇的肝和骨骼肌中存在活动期和冬眠期的明显差异，在其余动物两个时期的组织中未表现出明显变化，刺猬的肝脏LDH活性在冬眠期显著地高于活动期，而其余的动物组织冬眠期LDH活性均显著低于活动期，三种蛇类组织LDH4均未见表达[43]。
6.2.过氧化物酶(POD)同工酶：在高等动植物中，过氧化物酶广泛而大量的存在着，并有较多的同工酶。李桂兰采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳对菘蓝不同器官的POD同工酶进行分析测定，发现菘蓝的POD同工酶酶谱具有一定的器官特异性和稳定性，并且同工酶变化与生物的生长发育之间具有特异性关系，可为生物生长发育的调控研究提供参考[44];于晶等用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术对不同种源黄芩过氧化物同工酶进行研究，再利用过氧化物同工酶谱带聚类分析，可为不同种源黄芩的划分提供参考[45];陈文强等采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对天麻3种变型的过氧化物酶(POD)的同工酶进行了研究结果表明，天麻3种变型的过氧化物酶的同工酶活性不同，酶谱条带数在5～7条之间，且具有特征谱带.其中乌天麻和红天麻的酶谱条带数相同，两者的酶谱条带数均多于绿天麻;绿天麻､乌天麻和红天麻的酶谱条数依次分别为5条､7条和7条;其中基本酶带有5条，Rf值分别为0.06､0.24､0.83，0.89､0.98;乌天麻与红天麻的相似度指数为0.86，说明这两个种亲缘关系近;乌天麻与绿天麻的相似度指数为0.71，反映它们之间的亲缘关系相对较远[46]。
6.2.3 酯酶同工酶：酯酶同工酶是一类水解酶，能催化分子中酯键，酯酶同工酶在动植物体内广泛分布。张丽萍等用同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳快速简便的鉴别了蒙古黄芪和膜荚黄芪种子，为蒙古黄芪种子真实性的检验提供理论依据[47]。
综上所述，色谱法在中药材分析和鉴别中的应用已达到一定水平，但仍然存在一些不足，需要我们在逐步探索中去改进，从而达到更有效､更简便的鉴别中药材的目的。
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关键词：气相色谱 固相萃取法 农药残留 GC SPE
中图分类号：O65 文献标识码：A 文章编号：1007-3973（2012）002-055-02
1 农药残留以及气相色谱在农药残留分析检测中的应用现状
1.1 农药残留的现状
自上个世纪50年代以来，化学农药的使用在全世界范围内得到推广，化学农药的使用在防治农业病虫害和增加农业产量方面起到了至关重要的作用，显然，化学农药的应用极大的促进了人类社会的进步和发展。然而科学技术在为人类创造财富的同时，也在不断危害人类生存的自然环境以及人类的身体健康等。近几年来不断有因食有残留农药的蔬菜和水果而导致中毒的报道出现，可见，农药残留问题已成为当今世界上危害人类健康的一个重要问题，解决农药残留问题已刻不容缓。
1.2 气相色谱在农药残留分析检测中的应用现状
就当前的农药残留分析的研究现状来看，在农药残留的定量分析方法中是以GC即气相色谱法为主要的分析检测方法，另外用的相对比较多的一种分析检测方法就是HPLC即液相色谱分析法。由于气相色谱法具有容易操作、分离效果好以及灵敏度高等特点而广泛的应用于那些相对分子量较小、易气化、热稳定性比较强的农药残留的分析检测中，其中比较常见的有有机氯、有机磷等化学的农药残留分析。同时近些年随着气相色谱法研究的进一步深入，毛细管柱和新型检测器得以在气相色谱法中出现和应用，这样一来，有80%以上的农药残留均可采用气相色谱法进行分析检测。
2 气相色谱在农药残留分析中的样品前处理技术
2.1 固相萃取法
固相萃取法即SPE，它是一种应用比较广泛而且相对比较成熟的样品前处理技术，其中SPE的原理是通过利用一些固体吸附剂来吸附液体样品中的那些有机的目标化合物，从而使其与样品的其他混合物质分离开来，然后在经过洗脱吸附样品，实现目标化合物与其他物质的完全分离。
作为当前应用最为广泛的一种样品前处理技术，该处理技术可以有效的将目标化合物与干扰物分离开以及回收率高和重复性好等优点。另外，SPE柱填料的种类比较多，按目标化合物的吸附原理的不同可分SPE柱填料划分为正相和反相两种，其中正相填料主要包括活性炭、硅胶和硅藻土等，而反相填料主要包括C18以及离子交换吸附树脂等。
2.2 凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法也被广泛的称为空间排阻色谱法，凝胶渗透色谱法是通过利用样品各组成分子大小的区别而造成的其在凝胶中保留时间不同这一原理来达到分离目标化合物的目的。
凝胶渗透色谱法主要应用于除去样品中分子量比较高的混合物，其中在脂肪色素等大分子混合物含量比较多的样品分离净化上的效果更是显著。相比较SPE法，该方法完全实现了净化操作的自动化，那些分子量比较高的物质首先从柱中流出，然后流入废液瓶，而目标化合物则被分离出来，并保存在收集盘的样品瓶中为检测做好准备。另外该方法还具有提取效率高、用时短和经济的特点，通常凝胶渗透色谱法比较适用于常规的大量样品分析，而且主要天然药用植物中农药残留的分析。
2.3 超临界流体萃取法
超临界流体萃取法是一种新型有效的目标化合物提取分离技术，由于超临界流体可以充当有机溶剂，而且对环境污染比较小，所以近些年也开始得到人们的广泛的应用。其中最常用的超临界流体就是CO2，因为CO2具有无毒、不易燃、临界温度低、无毒性而且不污染样品等优点，所以它常常用于超临界流体来使用。与传统的萃取分离技术相比，超临界流体萃取法具有选择性好、提取效率高、操作快捷以及无溶剂残留等优点。
2.4 基质固相扩散法
基质固相扩散法是一种将适量的固体基质与样品进行充分的研磨，并相互吸附后搅拌均匀后生成一种半固体状态的物质作为填料装柱，并结合混合物溶解度不同的原理，利用有效的有机溶剂进行洗脱以达到分离目标混合物的目的。基质固相扩散法的最大优点就是可以实现样品制备、萃取与净化一步完成的操作，而且该方法不需要进行混合物的离心、沉淀、酸碱度调节以及样品转移等操作，这种方法比较适用于多农药残留的分析。
3 气相色谱中常用的农药残留分析方法
3.1 利用电子捕获检测器进行分析的方法
电子捕获检测器是放射性离子化检测器的一种，电子捕获检测器的原理是利用放射性同位素放射的电离原理获得那些带有负电子的目标分析物后就会大量地捕获电子形成负离子，这些负离子与目标分析物中国的正离子相结合后，电子捕获检测器就会输出一个电信号，来说明目标分析物中有农药残留物的存在。其中化学农药中常见的有机氯等一些带负电的有机化合物多是利用电子捕获检测器进行分析检测的。
3.2 利用火焰亮度检测器进行分析的方法
火焰亮度检测器又被广泛的称之为硫、磷检测器，火焰亮度检测器是利用能产生较高温度的氢火焰的加热和灼烧来实现那些含硫、磷等原子的有机化合物的分解，并将其形成激发态的分子，当这些分组回到基态时，会生成一定波长的光波，进而来说明目标分析物中有农药残留物的存在。火焰亮度检测器主要用于含硫、磷等原子的有机化合物农药残留的分析检测。
3.3 利用热离子检测器进行分析的方法
热离子检测器又被广泛的称之为氮磷检测器，它的原理是利用普通的火焰电离检测器的火焰和一个碱金属盐片，将目标分析物放置在碱金属盐片上进行灼烧，碱金属盐片在灼烧的同时，上面的盐就会蒸发和分解，这时在火焰里燃烧的含电负的包括氮、磷等原子在内的有机物时就会加快碱金属盐片上盐的蒸发和分解，通过这一点就可以说明目标分析物中有农药残留物的存在。热离子检测器主要用于含氮、磷等原子的有机化合物农药残留的分析检测。
4 气相色谱在农药残留分析中的应用实例剖析
4.1 气相色谱在农药残留分析中的应用实例描述
本实例以辽宁省地区比较常见的芹菜、辣椒和豆芽这三种蔬菜为例，并以这三种蔬菜常用的化学农药即甲胺磷、乙酰甲胺磷、毒死蜱、丙溴磷以及三唑磷为检测对象，来分别从气相色谱方法中农药残留的检测结果与理论计算结果之间的对比以及气相色谱法在农药残留分析检测结果的稳定性说明这两个方面来对气相色谱在农药残留分析中的实际应用作全面的剖析。
4.2 气相色谱在农药残留分析中的应用实例分析
(1)气相色谱方法中农药残留的检测结果与理论计算结果之间的对比。
称取少量的含有上述实例说明中的化学农药的药液，并将药液用乙酸乙酯进行稀释处理，然后分别根据农药标明量计算所得的浓度等数据进行农药残留的理论计算以及采用气相色谱方法的分析检测计算。详细数据参见表1（注：表中数据单位为mg/L），由计算结果可以看出计算结果和检测结果之间的误差比较小，充分说明了气相色谱在农药残留分析中检测结果的精确度。
表1 理论计算结果与气相色谱法检测结果之间的数据比较
(2)气相色谱法在农药残留分析中检测结果的稳定性说明。
对实例中待检测的化学农药平均分成若干组，对每一组待测药液均采用气相色谱法进行分析检测，记录每一组检测结果的最小值、最大值以及平均值，然后根据这些数据计算气相色谱法在农药残留分析中检测结果的变异系数，由变异系数来对其检测结果的稳定性进行说明。详细数据参见表2（注：表中数据单位为mg/L），由表2中气相色谱法检测结果的变异系数可知气相色谱法在农药残留分析中检测结果是非常稳定的。
表2 气相色谱法在农药残留分析中检测结果统计分析表
5 结语
农药残留问题已成为严重危害人类健康的一个重要问题，为了能有效控制和解决农药残留问题，需做好农药残留的检测分析工作，然而气相色谱在农药残留分析中的应用可以有效提高农药残留分析的可靠性，所以应充分发挥气相色谱在农药残留分析中的作用，为农药残留问题的解决提供有力的技术支撑。
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关键词：分析化学;样品前处理技术;农药残留检测;教学内容研究与改革
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）06-0110-02
一、引言
《分析化学》是一门关于研究物质的化学组成、结构及性质的科学，是高等学校化学、地球化学及相关专业的专业基础课之一，是化学学科的一个重要分支，也是化学、地球化学、化工、环境等研究所需的重要技术之一。现代样品前处理技术是该课程中的重要教学内容，是国内外教育者教学研究改革的主攻领域之一。由于农药在农业生产过程中应用的严重利弊性[1]（例如，虽然在防治病虫害、增加农作物产量方面发挥着重要作用，但又是造成污染、影响食品安全、人类健康等问题的重要因素之一），因此，农药残留检测的样品前处理技术的研究已经受到国内外的广泛关注。目前，国际上较多使用固相萃取法（SPE）、固相微萃取（SPME）、凝胶渗透色谱法（GPC）、超临界流体萃取（SFE）、基质固相分散萃取（MSPDE）、加速溶剂萃取（ASE）、微波辅助萃取（MAE）等现代的样品前处理技术。
二、农药残留检测的样品前处理技术的国内外研究现状
1.固相萃取。固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）主要通过吸附填料与洗脱溶剂中的分析物质或杂质互相作用，实现组分的分离净化，实质上是一种液相色谱分离。SPE有溶剂用量少、处理过程不会产生乳化现象、所用时间短、易实现自动化操作等优点。纪淑娟等[2]用石墨化碳和PSA分离和净化了有色蔬菜中36种农药，94%以上的农药的回收率在60%～120%之间，达到了理想的检测效果;李南等[2]用ENVI-18串联PSA固相萃取柱净化了花生仁、葵花籽、核桃仁和杏仁中的农药，得出该方法准确、灵敏、简便，可用于坚果中农药残留的日常检测。
2.固相微萃取。固相微萃取（Solid Phase Microextraction，SPME），固相微萃取装置外形如微量进样器，由手柄和萃取头组成，萃取头是涂有不同吸附剂的纤维。其原理是纤维上的吸附剂极性与目标化合物相似，从而吸附目标化合物，不吸附干扰化合物。与液-液萃取和固相萃取相比，具有操作时间短，样品量少，不需要萃取溶剂，对挥发性和非挥发性物质都适用，重现性好等优点。SPME主要与GC和HPLC联用来实现对农药残留的检测。例如，K.Fytianos等[3]用顶空固相微萃取-气相色谱法测定不同水果中有机磷农药，检测限为0.03～3ppb，都低于欧盟最大残留限量标准。
3.凝胶渗透色谱法。凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，GPC）的原理是选择不同孔径的多孔凝胶作为固定相，根据多孔凝胶对大小和形状不同的分子的排阻效应进行分离，分子量不同，流出时间就不同。目标农药分子量一般小于500，而样品中的色素、油脂等大分子杂质，先于农药分子流出。它是农药多残留分析中一种常用的、有效的净化方法，优点是净化效果好，柱子可以重复使用，自动化程度高，可以同时实现样品的净化和浓缩，被广泛用于净化含脂类、色素等大分子的杂质的复杂基体[4]。
4.超临界流体萃取。超临界流体（Supercritical Fluid Extraction，SFE）原理是利用不同组分溶解度不同，且在不同压力下溶解能力会发生变化，调节萃取剂流体压力，可将组分逐一萃取。一般常用的是超临界CO2。其优点是：萃取时间短，避免使用大量溶剂，具有极好的萃取效力和速度，可与分析仪器联机，避免样品转移的损失，减少人为误差，提高了方法的精密度和灵敏度。例如，邱月明等[5]用超临界流体萃取技术测定粮谷和茶叶中的有机氯农药残留，检出限在0.01～0.05mg/kg之间，回收率在81.2%～93.7%之间，说明该方法灵敏度和重现性好。
5.基质固相分散萃取。基质固相分散（Matrix Solid-Phase Dispersion，MSPD）是类似于固相萃取的一种提取、净化、富集技术，其基本原理是将试样直接与固体吸附剂（硅胶、石墨化碳、C18等）一起研磨、混匀制成半固态，装柱，用洗脱剂洗脱。具有同时制备、萃取和净化样品的优点。例如，朱学良等[6]采用基质固相分散的样品前处理方法，从葡萄酒中提取净化5种农药，气相色谱电子捕获检测器分析测定，结果令人满意。Adou等[8]建立了气相色谱法测定梨、哈密瓜、马铃薯和卷心菜中8类28种农药残留的方法，回收率均大于70%，RSD小于10%。
6.加速溶剂萃取。加速溶剂萃取（Accelerated Solvent Extraction，ASE）原理是在较高的温度（50～200℃）和压力（10.3～20.6MPa）下用溶剂萃取固体或半固体样品的样品前处理方法。ASE与其他萃取技术比较具有萃取时间短、溶剂使用量少和减少溶剂挥发的优点。樊苑牧等[7]建立了快速溶剂萃取-气相色谱法同时测定含脂羊毛中28种有机氯、拟除虫菊酯、杀虫剂残留量的方法，得出该方法具有操作简便、快速、方便、灵敏度高等特点。
7.微波辅助萃取。微波辅助萃取（Microwave Assisted Extraction，MAE）原理是利用极性分子可迅速吸收微波能量的原理来加热一些具有极性的溶剂，如乙醇、甲醇、丙醇或水等。它是一种萃取速度快、试剂用量少、回收率高、灵敏度高以及易于自动控制的样品制备技术。袁宁等[8]建立了微波辅助萃取-固相微萃取-气相色谱同时测定茶叶中六六六、滴滴涕类、氯氰菊酯和氰戊菊酯等10种农药残留的方法，取得了满意的结果。
三、结语
现代的样品前处理技术包括固相萃取法（SPE）、固相微萃取（SPME）、凝胶渗透色谱法（GPC）、超临界流体萃取（SFE）、基质固相分散萃取（MSPDE）、加速溶剂萃取（ASE）、微波辅助萃取（MAE）等，这些技术相对于传统的样品处理技术，具有简单、快速、引进误差小、选择性好、回收率高的优点。这些技术的研究与改革是《分析化学》教学内容的研究与改革的重要方向，具有重要意义。
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关键词 脑蛋白水解物片 质量控制 肽 分子排阻色谱 高效液相色谱
中图分类号：R282.74； R927.2； O657.72 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）03-0076-05
Optimization of a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets
TANG Xiaoshu*， LU Zhiying， FAN Qijun
（Shanghai Greatwall Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201206， China）
ABSTRACT Objective： To optimize a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets. Methods： A size-exclusion chromatography method and an HPLC method were used for the identification of peptide and the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets， respectively. Results： The result of size-exclusion chromatography method had the advantages of high specificity. The standard curve of every amino acid was linear （r>0.999）with average recovery 98.0%～102.4%. Conclusion： This method is simple， accurate， sensitive and reproducible， and can be applied in the quality control of cerebroprotein hydrolysate tablets.
KEY WORDS cerebroprotein hydrolysate tablets； quality control ； peptide； size-exclusion chromatography； HPLC
脑蛋白水解物为从健康猪新鲜大脑组织中提取的一种活性肽类水解物，其作为一种大脑所特有的肽能神经营养物质，通过作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害[1-2]。脑蛋白水解物片在临床上广泛用于改善失眠、头痛、记忆力下降、头晕及烦躁等症状，可促进脑外伤后遗症、脑血管疾病后遗症、脑炎后遗症、急性脑梗塞和急性脑外伤的康复。药理实验结果显示，脑蛋白水解物主要药效成分为小分子肽，以上肽类能通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其它激素系统，并提供神经递质、肽类激素及辅酶前体[3-4]。
脑蛋白水解物片现行的质量标准规定药品规格为6.5 mg（按氨基氮计算）或14.4 mg（按总氮计算）[5]。在该项国家标准中，只有2项显色反应作为鉴别反应，并只采用滴定法对产品的总氮、氨基氮含量进行控制，方法落后，专属性与有效性都较差。缺乏对脑蛋白水解物片中主要药效成分小分子肽质量控制的科学方法及指标。
本研究参考文献提高了脑蛋白水解物片质量标准，通过分子排阻色谱法对小分子肽进行鉴别[6-7]，并采用Waters AccQ-Tag衍生法来测定脑蛋白水解物片肽含量[8-10]，制订出针对主要药效成分小分子肽合理的质量控制指标。提高了脑蛋白水解物片质量可控性，使制剂各组分达到有效剂量范围，从而保证疗效。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
Agilent 1100液相色谱仪，DAD检测器、自动进样器（安捷伦科技中国有限公司）。Waters 2695/2487液相色谱仪，VWD检测器、自动进样器（美国Waters公司）。Sartorius BP121S电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）。Sartorius BP121S电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）。
脑蛋白水解物对照品溶液（批号：140697-200602）、16种氨基酸对照品（批号：624-200104）和D-正亮氨酸对照品（批号：140687-200401）均购自中国药品生物制品检定所。脑蛋白水解物片（批号：20131001）为本公司产品。Waters AccQ-Fluor试剂盒（美国Waters公司，氨基酸衍生用）。乙腈和异丙醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、磷酸均为分析纯。
1.2 色谱条件
1.2.1 分子排阻色谱
采用Agilent 1100液相色谱仪和TSK GEL 2000 SWxl 型凝胶色谱柱（7.8 mm×300 mm，5 μm），流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钾10.63 g与磷酸二氢钾5.31 g，加异丙醇50 ml，加水至约800 ml，用磷酸调节pH至7.0，加水稀释至1000 ml）。柱温：30 ℃。检测波长：280 nm。流速：0.6 ml/min，进样量10 μl。
1.2.2 HPLC
采用Waters 2695/2487液相色谱仪和Kromasil 100-5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A：将乙酸钠19.05 g溶解于1 000 ml水，用磷酸调pH至5.00；流动相B：60%乙腈溶液。上样后按表1进行梯度洗脱。柱温：37.0 ℃。检测波长：248 nm。流速：1.4 ml/min，进样量5 μl。
1.3 溶液制备
1.3.1 对照品溶液的制备
取中国药品生物制品检定所购得脑蛋白水解物作为对照品溶液。
按表2称取需测定的16种氨基酸的对照品置于100 ml容量瓶中，以6 mol/L盐酸5 ml溶解，加水至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取1 ml至100 ml容量瓶中，精密加入内标溶液（2 mg/ml D-正亮氨酸溶液）1 ml，加水至刻度，摇匀，作为氨基酸对照品溶液。
1.3.2 供试品溶液的制备
取脑蛋白水解物片2片，研细，加水10 ml溶解，滤过，作为脑蛋白水解物供试品溶液。
取脑蛋白水解物片20片，研细。精密称取该粉末0.72 g，置100 ml量瓶中，加1 mol/L盐酸溶液1 ml和内标溶液1 ml（2 mg/ml D-正亮氨酸溶液），加水稀释至刻度，滤过，取续滤液作为游离氨基酸含量测定供试品溶液。
精密称取同批号脑蛋白水解物片粉末0.24 g，置硬质安瓿中，加内标溶液1 ml（2 mg/ml D-正亮氨酸溶液）和盐酸2 ml，封口，110 ℃水解20 h，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸发至干，加水使残留物溶解并稀释至100 ml，作为水解氨基酸含量测定供试品溶液。
1.3.3 空白溶液的制备
取空白辅料（按处方配制，除脑蛋白水解物）适量，研细，加水10 ml溶解，滤过，作为脑蛋白水解物空白溶液。
1.4 氨基酸分析
采用AccQ-Tag氨基酸分析法，分别取对照品溶液、游离氨基酸含量测定供试品溶液、水解氨基酸含量测定供试品溶液衍生后进样，分别测定脑蛋白水解物片中游离及水解氨基酸含量，计算肽含量（肽含量=水解氨基酸含量-游离氨基酸含量）。
2 结果
2.1 方法学考察
2.1.1 系统适用性试验
取氨基酸对照品溶液和各供试品溶液，衍生后进行的系统适用性试验结果见图1。
从图1可见，在该色谱条件下，需测定的16种氨基酸均能完全分离，峰形较佳，表明该方法系统适用性好。
2.1.2 线性范围
取16种氨基酸对照品贮备液，分别稀释200倍、133倍、100倍、80倍、67倍，配制成一系列浓度的混合对照品溶液，分别取上述对照品溶液衍生后进样，并计算16种氨基酸的线性回归方程（表3）。
结果显示，在该色谱条件下，16种氨基酸均在浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（r>0.999）。
2.1.3 重复性试验
取同一批制备的游离氨基酸和水解氨基酸供试品溶液各6份，衍生后测定游离和水解氨基酸的含量，并计算脑蛋白水解物片肽含量（表4）。
肽含量均值为46.81 mg/片，RSD小于2.0%，表明采用该方法测定脑蛋白水解物片肽含量重复性较好，测定结果可靠。
2.1.4 加样回收试验
取供试品适量，按照高（120%）、中（100%）、低（80%）三个浓度加入含16种氨基酸的对照品储备液，分别依法制备加样回收的游离氨基酸供试品溶液、水解氨基酸供试品溶液，每个浓度各3份。取上述游离和水解加样溶液衍生后进样测定，并分别计算加样回收率（表5）。
结果表明，游离和水解氨基酸含量测定中16种氨基酸的回收率均在98.0%～102.4%范围内，RSD均小于2.0%，证明本方法回收率结果良好。
2.2 肽鉴别与含量测定
2.2.1 分子排阻色谱法鉴别试验
将供试品溶液肽色谱图与对照品溶液的比较，发现供试品溶液特征峰的保留时间与对照品溶液的基本一致。而脑蛋白水解物空白溶液对检测无干扰（图2），表明分子排阻色谱法鉴别脑蛋白水解物片中肽的专属性强。
2.2.2 肽含量测定
取5批次的脑蛋白水解物片制备游离和水解供试品溶液，衍生化后进样，测定并计算肽含量（表6）。
3 讨论
分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。凝胶色谱柱的填充剂亲水凝胶表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其粒径大小进入相应的孔径内，粒径大于凝胶孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱出，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在柱子中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。分子排阻色谱法可以用于高分子化合物，如蛋白质、肽类、核酸等的分离分析。脑蛋白水解物中具有生物活性及药效作用的成分为小分子肽，分子量在5 000～10 000之间，使用TSK GEL 2000 SWxl 型凝胶色谱柱进行分离，供试品与对照品在相同保留时间有相同的特征峰，显示其小分子肽类的分子量分布与对照品一致，提供了鉴别脑蛋白水解物中小分子肽类专属性更好的方式。
目前，常用的小分子肽类含量测定的方法为双缩脲比色法，其存在灵敏度差，测定结果不精确的缺点。我们对于脑蛋白水解物的成分进行分析，其主要成分为小分子肽类及游离氨基酸，小分子肽是由蛋白质中多种氨基酸以不同组成和排列方式通过肽键（也称酰胺键）相互连接形成的化合物。我们采用氨基酸分析方法（HPLC法）来测定脑蛋白水解物片中肽的含量，通过对样品进行完全的酸水解，测定脑蛋白水解物片中的氨基酸总量，并对脑蛋白水解物片中所含游离氨基酸进行含量测定，将水解后氨基酸总量减去样品中游离的氨基酸含量，准确的计算脑蛋白水解物片中的肽含量，制定出针对小分子肽含量的合理的HPLC测定方法，快速、准确、专属性强。
脑蛋白水解物片现行质量标准中规定氨基氮含量为6.5 mg/片，总氮含量为14.4 mg/片，即脑蛋白水解物片中肽的氮含量为7.9 mg/片。而肽类的含氮量一般在14%～18%之间，平均为16%。故可推算出脑蛋白水解物片中含肽约为43.9 ～56.4 mg/片。由表6中的5批测定结果可见，用氨基酸分析方法测定的肽含量在（46.6～54.7） mg/片之间，与原标准相印证，故我们脑蛋白水解物片中肽含量的限度为不少于（40～60） mg/片。
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关键词 超高效液相色谱；番茄酱；苏丹红染料；检测
中图分类号 O657.7+1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）09-0279-02
苏丹红染料是非生物合成的亲脂性偶氮化合物，一般不溶于水，易溶于有机溶剂，常用于汽油、机油、鞋油和汽车蜡等工业产品的着色[1]。近年来苏丹红染料被部分违法商家添加到食品表面着色以改善感官度[2]。据世界卫生组织的国际癌症研究机构（IARC）1995年确定，苏丹红属第三类致癌物质，它能够使老鼠和兔子患癌症。如果长期大剂量摄入会增加人体致癌的危险性。欧盟国家已在1995年禁止其作为食用色素，我国在《食品添加剂使用卫生标准》中也禁止将苏丹红作为食品添加剂使用[3]。在全国范围对食品中苏丹红染料进行了大规模的检测，并将其纳入了相关产品的必检指标[2]。
番茄酱是西餐中的一种重要调味品，是增色、添酸、助鲜、郁香的调味佳品。被大量用于意大利粉中，也可蘸炸鸡、炸鱼和薯条。国内对辣椒酱中苏丹红染料的检测有较多报道[2-4]，但番茄酱较少。而国内已有文献报道检测苏丹红染料残留方法均为高效液相色谱法（HPLC）[1-2，4]，但是方法普遍存在样品分析时间长、检出限高等缺点。而UPLC由于采用了1.7 μm的小粒子填充柱，柱效提高，有更好的分离效率，缩短了检测时间。超高效液相色谱快速检测苏丹红染料的方法具有简单、灵敏度高和稳定性好等特点，能够满足批量样品检测的工作要求。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
1.1.1 番茄酱样品。来自于市场上购买的若干份各种品牌的番茄酱。
1.1.2 试剂。苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对照品（购自Dr.Ehrenstorfer GmbH）。乙腈（德国Merck公司，色谱纯）；乙腈、丙酮、正己烷、无水硫酸钠（广州化学试剂厂，AR）；中性氧化铝（上海五四化学试剂有限公司，层析用）。
1.1.3 仪器与设备。电子天平（Precisa公司）；旋涡混合器（上海精科实业有限公司 XW-80A）；离心机（Sigma公司 3-30k）；高速匀浆机（IKA公司T-18 basic）；振荡器（IKA公司 Ks501digital）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司 Rotavapor R-210）；氮吹仪（天津恒奥 HGC-24A）；Waters超高效液相色谱仪（带紫外检测器）；规格为20 mm×150 mm的玻璃层析柱、铁架台。
1.2 试验方法
1.2.1 样品的提取。称取10 g（精确到0.01 g）番茄酱于100 mL离心管中，加入20 mL乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1，匀浆，加入5 g无水硫酸钠振荡，5 000 r/min离心5 min，上清液移入鸡心瓶，残渣用15 mL乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1重复提取1次，5 000 r/min离心5 min，合并上清液于鸡心瓶，旋转蒸发至近干。用5 mL正己烷溶解残渣，备用。
1.2.2 净化。向层析柱加入5 cm高的中性氧化铝粉，用5 mL正己烷预洗，不收集。备用液直接过柱，用10 mL丙酮∶正己烷（v/v）=5∶95洗脱，收集。50 ℃氮吹至近干，用1 mL流动相溶解定容，过0.22 μm滤膜，上机。
1.2.3 色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈∶水（v/v）=88∶12，等度洗脱；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长为510 nm。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
食品中苏丹红染料检测的相关报道中提取溶剂通常有乙腈和正己烷，这2种溶剂对苏丹红染料的溶解度相对较好。但正己烷提取所需的溶剂量相对较多，且对苏丹红有干扰峰，而用乙腈作为提取液时未见有干扰峰[3]。本方法通过对乙腈、正己烷、正己烷∶丙酮（v/v）=3∶1和乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1等4种提取溶剂对比，回收率都在75%以上。但在乙腈中加入一定量的丙酮有助于更好地溶解提取，回收率可达到83%以上。综合考虑，选择乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1为提取苏丹红染料的提取溶剂。
2.2 净化条件的选择
国内文献报道苏丹红染料前处理有2种方式[1，5]。一种是样品提取液未经净化就直接过滤膜上机分析。这样简化了样品前处理过程，大大缩短了样品整体检测时间。但由于番茄酱中基质比较复杂，样品经乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1提取后存在大量的干扰物质，影响目标物质的定量。本方法采用的UPLC色谱柱只有1.7 μm，大量基质干扰物质会沉积在色谱柱进样口和柱头中，导致色谱分离能力降低，影响色谱柱寿命。另一种是使用凝胶渗透色谱（GPC）进行净化，GPC是利用多孔凝胶对样品组份按照分子体积大小进行分离的一种色谱方法。用GPC对样品进行苏丹红染料净化时，天然色素和食用油类等大分子物质先流出，随后是小分子。宋 欢等[6]就用凝胶渗透色谱法测定辣椒及其制品中苏丹红含量，净化效果好，样品洁净无杂峰干扰，仪器实现了自动化连续处理，减少了工作量。但GPC价格昂贵又需要专人维护，不易普及。
本试验分别比较了某品牌商品化的3、6、12 mL中性氧化铝固相萃取小柱及手动填充中性氧化铝粉玻璃层析柱的净化效果。通过加标回收比对，结果发现3、6 mL柱的回收率都低于40%，12 mL柱的回收率高于60%，但平行测试中结果偏差较大，用商品化的中性氧化铝不太适合于苏丹红染料的前处理净化。综合考虑，本试验采用手动填充中性氧化铝玻璃层析柱进行净化，减少了检测成本，4种苏丹红染料在3 min内完全分离出峰，测试的结果符合相关要求（图1）。
2.3 方法标准曲线、检出限及定量限
取4种苏丹红染料标准品，分别配制成质量浓度为100、200、400、600、800、1 000 μg/L的系列标准溶液。在1.2.3的色谱条件下，以峰面积为y值，标准溶液的浓度为x值进行线性回归分析，求得相关的线性方程。按本方法测定结果，以3倍信噪比（S/N）确定分析物的检出限，10倍信噪比（S/N）为定量限。回归方程、相关系数以及定量的限详见表1。
2.4 回收率与精密度
以不含4种苏丹红染料的番茄酱作为空白基质添加一定量的混合标准品，做添加回收试验，每个添加浓度重复测定6次，同时做空白试验[7-11]。结果表明，4种苏丹红染料添加回收率在83.1%～90.1%，相对标准偏差（RSD）为5.6%～7.2%（表2）。说明该方法具有较好的精密度和回收率，可以满足痕量分析要求。
3 结论
通过优化提取溶剂、样品净化等前处理建立了超高效液相色谱，同时测定番茄酱中4种苏丹红染料的残留量。本方法采用超高效液相色谱法实现了苏丹红染料残留量快速高效的分离，大大节约了试剂，并降低了有机溶剂对环境的污染，较好的灵敏度和精密度满足实际样品检测的需要，加回收率在83.1%～90.1%，相对标准偏差（RSD）为5.6%～7.2%，适用于番茄酱中苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ染料的残留检测。
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