时间：2023-03-20 12:09:09
【关键词】凝胶渗透色谱；农药残留分析；全球经济一体化；监测系统
1 引言
随着经济的不断发展和人民生活水平的不断提高，健康问题已得到社会各界的广泛关注，食品安全问题也提上记事议程，环境的破坏和食品农药残留问题不断涌现，逐渐成为阻碍我国出口贸易发展的屏障。农药是一种农业生产不可或缺的生产资料，在适量的条件下，对生存与农业、林业和畜牧业之间的害虫和细菌有积极的预防作用，也能在一定程度上促进动植物的生长，预防各种虫害，为农业的创收增产和预防传染病方面有不可磨灭的突出作用。在有限的科技手段中，农药仍是预防疾病、增产创收、缓解粮食压力的最快捷、最便利、最廉价、最有效的方法之一。可是，农药也不是面面俱到，农药的使用本身存在着巨大的隐患，由于我国是农业大国，农药的大量长期使用不仅污染土地和大气，还造成生态环境的严重失衡，更严重的是，农药可残留于食物中，使牲畜和人类中毒，产生严重的后果。然而，农药残留的原因复杂繁多：使用了价格低廉，不易分解的农药；使用农药过量；畜牧业药浴；在动物即将宰杀前仍使用农药；饲养牲畜的饲料为受过农药污染的产品等。近日，农药残留分析方法及检测技术得到了突飞猛进的发展，但食品分类复杂以及农药品种的化学性质千差万别，为农药残留分析检测带来了更大的挑战。其中，农药残留分析的样品前处理技术包含先进的固相萃取技术、基质固相分散萃取技术、凝胶渗透色谱技术以及加速溶剂萃取技术等等。这些技术的功能特点不尽相同，有的是专门分析水源和土壤的，有的是分析果蔬的，有的是分析生物样品的，而本文讨论的凝胶渗透色谱技术在大分子样品分离净化脂肪、色素等方面有显著效果。
2 凝胶渗透色谱技术
前处理和测定是农药残留分析处理的主要手段，而分析的关键是样品的前处理问题。凝胶渗透色谱技术大部分使用的是XAD系列的凝胶，其洗脱剂是配比不同的乙酸乙酯和环乙烷，将大小分子不同的多孔凝胶分离，把油脂、叶绿素、聚合物和生物碱等大分子物质首先淋洗处理，分子质小的后淋洗处理。然后将洗脱液收集起来再次进行分析。凝胶渗透色谱分离的关键因素是柱填料，它分为有机凝胶和无机凝胶，这要求其必须具备强韧的机械强度和化学惰性，还要有流动性小，分离广等特点。一般的分离方法有机溶剂消耗量极大，误差也大，从而操作繁琐，而凝胶渗透色谱技术分离样品运用物理方法分离蛋白质脂肪，并且过程简单，误差小。
2.1 凝胶渗透色谱技术的应用原理
检验农药残留的方法颇多，目前主要有两种____生化法和色谱法。生化法操作简单，测速快效率高。色谱法是使用色谱分离技术，选取合适的仪器测定农药残留的方法，也是农药残留检测的常见方法。凝胶渗透色谱技术是根据溶质分子的大小进行分离的技术，它可用于分析化学性质相同但分子体积有差异的同系物质。先用洗脱机把注射进色谱柱中的预处理浓缩样品洗脱分离完成，使样品的形状和分子大小各异，在通过固定凝胶直径使大分子样品首先被洗脱出来，小分子随之被洗脱出来。凝胶渗透色谱是一项十分有发展前景的分子量测量方式的课题，从一开始的生物学向生化、高分子化学、无机化学等广泛扩展领域，可见其应用范围之广泛，渗透领域之普遍，是农药残留分析的关键性的净化方法。
2.2 凝胶渗透色谱技术在农药残留分析中的应用
农药残留分析同时需要灵敏度极高的检测技术和操作精良的方式方法，其难点就是在除掉杂质的时候保持较高的回收率。提取液的选择要根据农药的极性来判断，即极性弱的提取液配备极性小的有机氯农药。，而极性强的农药配备丙酮提取液。对于特殊的复杂基质，如油脂较高的物质常常不能使用较为普遍的液态萃取或者柱层净化萃取法，使用凝胶渗透色谱技术则可以在柱填料和被分离式样无相互作用的情况下按自身大小进行自动分离。值得欣慰的是，此技术完全可以在常温下进行，没有可逆吸附，能使每一个凝胶渗透色谱技术的分离样品完全洗脱。并且凝胶渗透色谱净化法能够排除大分子的干涉，对各种形态大小复杂的基质都适用。
随着科技的进步，农药品种不断增多，溶剂体系也不断加强完善，Bio-Beads SX-3作为凝胶渗透体系的柱填材料也有迅猛发展。我们对凝胶渗透色谱技术在粮食中的应用为例做简要的分析。粮食中包含脂肪，蛋白质，淀粉等多种材料，这位提取农药残留时排除干扰物进入溶剂增加了困难，因此必须用合适的净化手段对基质的干扰进行解除。将研究人员分为ABCD四个小组，A组用凝胶渗透色谱技术对糙米进行净化，对糙米中的有机氯农药和多氯联苯农药进行分析时采用气相色谱技术，测出的平均回收率约为80%-92%。B组还引用了新的气质联用技术，分析检验了玉米中的三唑醇和三唑酮，结果为农药回收率大约为96%-115%。而C组使用凝胶渗透色谱技术净化糙米，对其中可能存在的60多种有机磷农药进行残留分析，其中35种农药回收率在65%-110%之间。D组用词技术净化和气相色谱技术建立大豆中8种二硝基苯胺类除草剂的残留分析方法，去除量很高。又如，运用凝胶渗透色谱技术同样能对水果蔬菜的农药残留净化起到积极作用。实验表明，运用凝胶渗透色谱技术对果蔬进行抽样净化，其中有机磷农药进行分析的结果为回收率67%～105%。
2.3 凝胶渗透色谱技术的缺陷
运用凝胶渗透色谱技术净化的方法是利用分离大分子干扰杂质，最终可将农药从基质中脱离出来，其最终效果的如何与分子大小、形状和阻碍情况有关。但其中也包含一些不可避免的问题。首先，分子分离可能不彻底，这是由于小分子可以被洗脱到农药里，可大分子极可能跟随油脂先流出去，这时便需要使用柱色谱来净化。其次，GPC所耗费的溶剂量很大，这样当柱色谱内直径比较大时，处理较多样品时速度就会减慢，消耗的能量也多。为了避免这一弊端，科学家研制出了自动化的凝胶渗透色谱净化仪，让净化柱更加趋向柱内直径小，载荷量大和体积小的进样发展，使其分离度得到改善，应用范围得以拓宽。第三，其限制的条件较多。基质的选择和情况对化合物的准确定性和定量有较强的影响力，当从事食品样品的残留分析时，必须考虑多种因素才能得到精确的结果，这要求我们既要对基质反复评估又要通过有效途径进行消除和补偿。
3 总结
凝胶渗透色谱技术目前已日臻成熟，其提取和净化方法的研究和实验已十分常见，此方法除了农药外，还被广泛运用到药材、甘蓝、蜂蜜等成分的分析中，其在农药残留方面的贡献还要远大的发展前景。
参考文献：
[1]赵子刚，王建，贾斌.凝胶渗透色谱-气相色谱法检测小麦中的24种农药残留[J].河南工业大学学报（自然科学版），2010（3）.
[2]崔淑华，郭庆龙，张峰.气相色谱-质谱法测定花生及制品中17种菊酯类农药残留[J].分析化学，2013（6）.
关键词：在线凝胶渗透色谱-气相色谱/质谱 食品 农药残留
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1007-3973（2013）007-131-02
农药，以造福人类，提高农产品的产量走进了我们的世界，但是随着农药的广泛使用，大量食用含有农药残留的食品会导致机体正常生理功能失调，引起病理改变和毒性危害，它对人类健康，生态环境构成了严重的威胁。食品安全问题已经受到各国政府的密切关注，目前，农药残留分析技术已经不能满足当前社会的需求，GPC-GC/MS在线联用技术具备样品处理简单，分析时间快、溶剂使用量少，定性准确等优势，近几年，逐渐受到食品检测工作者的青睐。在线GPC-GC/MS已经用于粮食、蔬菜、水果、坚果等中的多农药残留分析。
1 在线GPC-GC/MS简介
GPC-GC/MS主要包括两部分：凝胶渗透色谱和气相色谱/质谱。GPC主要目的是去除样品基质中可能干扰目标化物检测的大分子油脂、色素等组分。系统流路图如图1，GPC根据尺寸排阻原理先将分子量较大的脂肪和色素等先从色谱柱中洗脱，通过六通阀位置的切换将这些基质干扰物排出系统，之后将所需检测物质导入试样捕集环中，最后导入GC/MS进行分离检测。
图1 系统流路图
2 在线GPC-GC/MS在农药残留分析中的应用概况
2.1 蔬菜、水果中的农药残留测定
苯氧羧酸类农药凭借其高效、内吸、高选择性的特征广泛用于农业生产中，目前在土壤、水体等环境样品及粮谷类农作物中已经测出苯氧羧酸类农药。张帆等建立了水果中的11种苯氧羧酸类农药在线GPC-GC/MS分析方法。该方法在0.02～0.10mg/kg加标范围内，回收率为66%～112%，相对标准偏差为3.4%～11.5%，定量下限为7～10 g/kg。在柑橘样品中11种苯氧羧酸类农药均有检出；香蕉中检测出2，4-D，含量为0.058mg/kg，其他农药成分未检出。欧阳运富等将蔬菜、水果样品经二氯甲烷-丙酮（1：1，v/v）加速溶剂提取，活性炭柱-氨基柱串联净化结合在线GPC-GC/MS分析了22种农药残留，在0.02， 0.05， 0.4mg/kg 3个添加水平下的回收率为70.5%～107.5%，相对标准偏差为2.1%～8.7%。在线GPC-GC/MS把GPC净化和GC-MS分析检测合二为一，自动化除去为除尽的干扰物质，保证了方法的可靠性和有效性，大大的提高了分析的准确度和有效性。薛丽等利用固相萃取-在线GPC-GC/MS测定了梅菜干中18种有机磷和拟除虫菊酯农药残留，该方法的农药回收率均在80%～120%之间，精密度均小于15%。
2.2 坚果中农药残留测定
吴岩，康庆贺等线GPC-GC/MS测定板栗、松子仁中多农药残留分析。板栗经乙腈-水（4：1，v/v）为提取剂，ENVI-18固相萃取柱净化，除去样品中的大量脂肪和甾醇等干扰基质，在经过在线GPC进一步净化，最后经过GC/MS分析。44种有机磷农药中大部分农药的回收率为65%～120%，相对标准偏差小于15%，检出限为0.002～0.05mg/kg。松子仁也用同样的方法进行了处理，与板栗不同的是提取液经Aluminum-N固相萃取柱净化。28种有机氯农药和拟除虫菊酯农药的回收率为70%～120%，相对标准偏差小于15%，检测限为0.002～0.05mg/kg。固相萃取结合在线GPC-GC/MS有效的解决了低水分高脂质样品前处理复杂、基质干扰严重的难题。
2.3 茶叶中农药残留测定
茶叶作为我国对外出口的传统商品，近年来，欧盟等国对进口茶叶的农药残留限量标准日趋严格。因此，茶叶的农药残留检测成为我们面临的共同问题。李军明等利用乙腈萃取、ENVI-carb固相萃取柱净化结合在线GPC-GC/MS测定了普洱茶、绿茶、红茶、乌龙茶中的153种农药残留量。该方法检出限能够满足欧盟等国的限量要求，为茶叶中的多农药残留提供了检测方法。
2.4 粮食作物中农药残留测定
粮食作物作为人们生活的基本食品，粮食安全与人的生活息息相关，各个国家对粮食中的农药残留都设有严格的限量标准。粮食中含有高的脂肪和淀粉，使得粮食中农药残留的测定样品前处理方法较为复杂。近年利用在线GPC-GC/MS测定粮食中的农药残留减少了样品前处理的繁复过程，缩短了分析时间，挺高了工作效率，减少了溶剂的使用。
3 总结
在线GPC-GC/MS在能够有效的去除复杂基质中的干扰物质，降低背景、改善峰形、减小基质效应。简化了样品前处理、提高了检测的重现性、缩短了分析时间、提高了工作效率、减小了有害溶剂的使用，将成为食品检测中的一颗璀璨明星。
参考文献：
[1] 张帆，付善良，施雅梅，等.在线凝胶渗透色谱/气相色谱-质谱联用法测定水果中11种苯氧羧酸类农药[J].分析测试学报，2013，32（1）：79-83.
[2] 欧阳运富，唐宏兵，吴英，等.加速溶剂萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱联用法快速测定蔬菜和水果中多农药残留[J].色谱，2012，30（7）：654-659.
[3] 薛丽，钟艳梅.固相萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱质谱联用测定蔬菜干制品中的 18 种有机磷和拟除虫菊酯残留[J].现代食品科技，2012，28（8）：1088-1090.
[4] 吴岩，康庆贺，高凯扬，等.固相萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱/质谱法测定板栗中44种有机磷农药残留[J].分析化学，2009，37（5）：753-757.
[5] 康庆贺，吴岩，高凯扬，等.固相萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱/质谱法测定松子仁中的28种有机氯农药和拟除虫菊酯农药[J].色谱，2009，27（2）：181-185.
[6] 李军明，钟读波，王亚琴，等.在线凝胶渗透色谱-气相色谱/质谱法检测茶叶中的153种农药残留[J].色谱，2010，28（9）：840-848.
一 、凝胶渗透色谱的发展概况
茨维特（Tswett）创立的液体色谱技术，由于分离效率低、分离时间长、适用范围窄等缺点，使它的发展一直受到很大的限制，长期停留在原始的实验阶段。直到1959年，Porath和Flodin用交联的缩聚葡萄糖制成的凝胶来分离水溶液中不同相对分子量的物质，如蛋白质、核酸、酶和多糖等。他们制备的具有一定孔度和强度的凝胶立即以商品“Sephadex”出售，并正式以“凝胶过滤”一词表示这一分离过程。
有机溶剂体系的凝胶色谱首先需要解决适用于有机溶剂的凝胶的制备问题。1964年，Moore以苯乙烯和二乙烯苯在不同的稀释剂存在下制成一系列孔径不同的凝胶这些凝胶可以在有机溶剂中分离相对分子量从几千到几百万的试样。第二年，Maly以示差折光仪为浓度检测器、以体积指示器为相对分子质量检测器制成凝胶色谱仪，这些凝胶和仪器立即被制成商品出售。这样，凝胶色谱技术很快就成为在高分子科学领域内被广泛应用。几十年来，凝胶色谱一直是一个非常活跃的研究课题，无论在凝胶制备、仪器技术性能、数据处理和理论研究上都有较大进展，它的应用范围逐步从生物化学、高分子化学、无机化学向其它领域渗透，已经成为化学领域内一种重要的分离手段。
二 、凝胶色谱测定相对分子质量或排布的方法
1.直接法
直接法是指凝胶色谱仪和粘度计或光散射仪联用；而最常用的间接法则用一系列分子量已知的单分散的（分子量比较均一）标准样品，求得其各自的淋出体积Ve，作出logM对Ve校正曲线（图1）。
图1 凝胶色谱分离范围
logM=A-BVe， 当logM>logMa时，曲线与纵轴平行，表明此时的流出体积（V0）和样品的分子是无关，V0即为柱中填料的粒间体积，Ma就是这种填料的渗透极限。当logM
2.普适法
上述订定的校准曲线只能用于与标准物质化学结构相同的高聚物，若待分析样品的结构不同于标准物质，需用普适校准线。SEC法是按分子尺寸大小分离的，即淋出体积与分子线团体积有关，利用Flory的粘度公式：
R为分子线团等效球体半径。[η]M是体积量纲，称为流体力学体积。众多的实验中得出[η]M的对数与Ve有线性关系。这种关系对绝大多数的高聚物具有普适性。普适校准曲线为
因为在相同的淋洗体积时，有[η]1M1=[η]2M2
式中下标1和2分别代表标样和试样。它们的Mark-Houwink方程分别为
因此可得
或
将上式代入，即得待测试样的标准曲线方程
K1、K2、α1、α2可以从手册查到，从而由第一种聚合物的M-Ve校正曲线，换算成第二种聚合物的M-Ve曲线，即从聚苯乙稀标样作出的M-Ve校正曲线，可以换算成各种聚合物的校正曲线。
三、凝胶渗透色谱在制浆造纸中的应用
1.测定木素相对分子质量及其分布
凝胶色谱法广泛地应用于木素样品相对分子质量及其分布的测定，然而由于木素结构的复杂性和特殊性，在溶剂中表现出不同的流体力学性质。因此，并没有一个普遍适用的测定木素相对分子量及其分布的色谱条件。对于不同的样品，需要用不同的凝胶柱、流动相和标样相配合，才能收到良好的效果。
另一方面，除了木素磺酸盐易溶于水外，各种木素在四氢呋喃（THF）中溶解度都很小。若不能充分溶解，会影响结果的准确性。另外，木素的酚羟基可以与THF形成氢键，从而使其流体力学体积增大，使测定结果偏高，因此木素样品需经衍生化处理才能测定，一般木素、硫酸盐木素、碱木素、有机溶解木素都用乙酰化或甲基化处理。
乙酰化方法：将木素样品溶解与已经纯化的吡啶-醋酐混合液（体积比1∶1）中，通N2保护，在室温下置于暗处反应24h以上。反应结束后，过量的酸酐可以通过加入甲醇-冰水分解。混合蒸干后，加甲苯，使乙酰混合物悬浮于甲苯中，再蒸去甲苯。残留的乙酰化试剂随共沸物蒸去。这种方法有不能使全部羟基乙酰化以及可能造成木素级分丢失的缺点，有人提出在常规乙酰化之后，用醋酐、吡啶和甲苯进行共沸蒸馏改进。
甲基化方法：将木素溶解或悬浮于二氧六环-甲醇（体积比9∶1）中，每2mL溶剂加入一滴，在N2保护下加入重氮甲烷，室温下反应20min。继续加入重氮甲烷进行甲基化反应。此过程反复进行三次，以保证反应完全。反应结束后，通N2排除未反应的甲基化试剂。反产物用硫酸镁干燥，蒸去溶剂，将衍生后的木素溶于THF。
关键词 凝胶渗透色谱 净化 溶剂消耗量 农残
概 述
凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，简称GPC）技术是一种相对分子质量及其分布的快速测定方法，其分离原理基于体积排阻，按照化合物的分子量不同从大到小顺序出峰。GPC应用范围逐步从生物化学、高分子化学、无机化学向其他领域渗透，目前已成为国际公认的农残分析中有效的净化手段，被列入多项标准中，如《AOAC Method No.984.21 动物脂肪中的有机氯农药残留检测》、《EN 12393食品中农药多残留检测 气相色谱法》、《GB/T 19650-2006 动物肌肉中478种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》等。GPC技术对于含大分子油脂、色素的样品净化十分有效，并且易于实现自动化操作，可大大缩短样品前处理操作时间和减轻繁杂的手工劳动[1]。
目前，GPC净化技术在有机磷、有机氯、拟除虫菊酯以及农药多残留分析中的应用十分广泛[2～8]，商品化全自动GPC净化仪器也已经得到发展，但是在实际应用中往往受到限制，除仪器设备成本之外，溶剂用量大是GPC应用的最大问题[9]。在常规GPC净化方法中，为获得足够灵敏度，往往采用较大规格净化柱（柱直径一般在2.5cm左右），以承受更大的进样量（一般为5mL）。获得洗脱液之后，再经过浓缩步骤，才得到待测样品溶液。虽然增大进样量有助于提高检测方法灵敏度，但洗脱溶剂量消耗也大大增加。一般来说单个样品处理时间约为40min（其中净化收集时间约为18～20min），按流速5mL/min计算，需消耗200mL洗脱溶剂。本文针对以上实际问题，采用小型化净化柱，优化洗脱条件，建立一套更为经济合理、环保的净化方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
JMS-Q1000GC气质联用仪，配有电子轰击源（EI）（日本电子株式会社）； FA2004电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；T25分散机（德国IKA）；TGL-16-A离心机（上海安亭科学仪器有限公司）；MTN-2800D氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；GPC样品前处理设备（自制）。
乙腈：色谱纯；环己烷：色谱纯；乙酸乙酯：色谱纯；无水硫酸钠：分析纯；氯化钠：分析纯；农药标准品：敌敌畏、β-六六六、毒死蜱、丙草胺、溴氰菊酯、环氧七氯（J&K Scientific Ltd.）。
1.2 样品提取
称取20g试样（精确至0.01g），放于烧杯中，加入40mL乙腈-乙酸乙酯（1：1）混合溶液，用均质器在15000r/min均质提取1min；加入5g氯化钠和5g无水硫酸钠，再均质提取1min；将提取液转移至离心管中，放入离心机，6000r/min离心5min；取上清液20mL，氮吹浓缩至5mL，待净化。
1.3 GPC净化条件
净化柱：Shodex CLNpak EV-200（2.0mm×150mm）；检测波长：254nm；流动相：环己烷-乙酸乙酯（1：1）；流速：0.1mL/min；进样量：20μL；开始收集时间：2.9min；结束收集时间：4.9min。得到样品体积200μL，加入5μL环氧七氯内标液（300μg/mL），作为待测样品溶液。采用GC-MS进行后续分析检测。
2 结果与讨论
2.1 测试样品选择
由于GPC净化是基于体积排阻原理，因此在测试净化效果时，选取分子量差异较大的农药品种，包括敌敌畏（分子量220.98）、溴氰菊酯（分子量505.24）。为验证该方法对不同类型农药残留的净化效果，选取测试样品：有机氯类农药（β-六六六）、有机磷类农药（敌敌畏、毒死蜱）、拟除虫菊酯类农药（溴氰菊酯）、除草剂（丙草胺），涵盖GC-MS能检测的绝大部分农药类型。
2.2 提取溶剂优化
在多农残检测中，最常用的溶剂是乙腈；GPC净化所使用的溶剂通常为环己烷-丙酮或环己烷-乙酸乙酯，两者极性差异大。为此，对提取溶剂进行优化。比较乙腈和乙腈-乙酸乙酯（1：1）提取效果，对于选取的5种农残，两者没有显著差异（见表1），乙腈-乙酸乙酯（1：1）提取回收率稍微高于乙腈提取回收率。考虑到后续净化GPC所用溶剂的兼容性，选用乙腈-乙酸乙酯（1：1）作为样品提取溶剂。
2.3 净化柱选择和条件优化
常规使用净化柱内径为2.5cm，流速5mL/min，收集时间22～40min，每个样品消耗溶剂至少200mL，处理1个样品的时间在40min以上，不仅耗时，且溶剂消耗量大，还需要进行后续浓缩处理。而GPC净化柱规格为2.0mm× 150mm，可在流速0.07～0.1mL/min下使用，收集时间为2～8min，净化每个样品所需时间在10min以内。除提高工作效率、缩短净化时间以外，还可达到节省溶剂、环保的效果（见表2），检测限也能满足目前国家标准[10]，可用于日常检测。
GPC净化常用流动相为环己烷-乙酸乙酯和环己烷-丙酮，对这2种混合溶剂的净化效果进样考察，均获得较好效果。考虑到与提取溶剂的兼容性，选择环己烷-乙酸乙酯作为净化流动相。流动相比例对杂质和目标物的分离有一定影响，提高乙酸乙酯比例可缩短目标物出峰时间，减小收集馏分体积，有利于达到较低的检出限。所以选择环己烷-乙酸乙酯（1：1）作为流动相，得到的样品溶液经GC-MS分析。净化前后的效果（见图1）。
2.4 方法重现性及加标回收率
在已知含量的样品中添加一定量标准品，按上述前处理方法制备，平行制备3份，GC-MS分析，计算加标回收率和相对标准偏差（见表3）。
2.5 检测限
按2倍信噪比计算最低检测限，以苹果样品为例，检测限分别为：β-六六六0.0105mg/kg，敌敌畏0.0042
mg/kg，毒死蜱0.0062mg/kg，溴氰菊酯0.0367mg/kg，丙草胺0.0113mg/kg。
2.6 实际样品测定
从市场上购买菠菜和胡萝卜，采用本方法进行分析检测，含量测定及加标回收率的结果（见表4）。
3 结论
本方法采用自制GPC净化设备，净化处理单个样品时间在10min以内，溶剂用量不到常规GPC消耗量的10%，样品处理效率提高2～4倍，解决常规GPC净化应用中溶剂消耗量大的实际问题，可达到更为环保的效果。自制GPC净化设备运用于农残检测前处理中，并对其在农残检测中实际应用的效果进行考察，效果令人满意。
参考文献
[1] 易军， 李云春， 弓振斌. 食品中农药残留分析的样品前处理技术进展[J]. 化学进展， 2002， 14（6）：415-424.
[2] 潘灿平， 王丽敏， 孔祥雨， 等. 凝胶色谱净化-毛细管气相色谱法测定黄瓜、番茄和青椒中15种有机磷农药[J]. 色谱， 2002， 20（6）：565-568.
[3] 张伟国， 高金山， 陈姗姗， 等. 凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱测定玉米中3种农药的残留[J]. 分析化学， 2005， 33（10）：1442-1444.
[4] 吴刚， 鲍晓霞， 王华雄， 等. 加速溶剂萃取-凝胶绳头色谱净化-气相色谱快速分析动物源性食品中残留的多种有机磷农药[J]. 色谱， 2008， 26（5）：577-582.
[5] 于胜良， 杨桂朋， 付萌. 凝胶渗透色谱净化-气相色谱/串联质谱分析蘑菇中的36种农药残留[J]. 色谱， 2007， 25（4）：581-585.
[6] 方敦煌， 师君丽， 宋春满. 凝胶渗透色谱净化烟叶有机磷、拟除虫菊酯类农药残留的研究[J]. 中国农学通报， 2011， 27（5）：269-273.
[7] 祁彦， 占春瑞， 张新忠， 等. 高效液相色谱法测定大豆中13种三嗪类除草剂多残留量[J]. 分析化学， 2006， 34（6）： 787-790.
[8] J. Engebreston， G. Hall， M. Hengel， et al. Analysis of pendimethalin residues in fruit， nuts， vegetables， grass， and mint by gas chromatography[J]. Agric. Food Chem. 2001， 49：2198-2206.
[9] 刘咏梅， 王志华， 储晓刚. 凝胶渗透色谱技术在农药残留分析中的应用. 分析测试学报[J]， 2005，24（2）：123-127.
关键词 QuEChERS方法； 在线； 凝胶渗透色谱； 气相色谱-串联质谱； 烟叶； 农药残留
1 引 言
为了防治病虫害，烟草在育种、种植、调制和保存期间要使用农药。残留农药会降低烟叶质量，加剧环境污染， 并威胁人类和其它生物的健康[1]。因此，烟叶中的农药残留检测对保证烟叶质量和环境安全具有重要意义。由于烟叶样品基质复杂，其中残留农药含量低（低至ng/g级），因此通常需要样品预处理过程才能进行后续测定[2]。目前，液-液萃取[3]、固相萃取[4]、固相微萃取[5]等方法已用于烟叶中农药残留测定。这些方法存在有机溶剂消耗量大、操作繁冗费时、回收率低等不足。Anastassiades等[6]开发了“快速、简便、经济、高效、耐用且安全（Quick， easy， cheap， effective， rugged and safe， QuEChERS）”的样品前处理技术。QuEChERS方法具有回收率高、稳定性强和被分析目标物范围广等优点，因此在农药残留检测中广泛应用[3]。常规QuEChERS方法在净化步骤中通过离心或过滤将吸附剂与样品液分离，耗时费力。为了克服这一缺陷，本研究组以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基键合硅烷/四氯化三铁（GCB/PSA/Fe3O4）复合材料为吸附剂，改进了QuEChERS方法[7]，吸附剂可以在磁场作用下与提取液快速分离，具有操作简单、快速高效的优点。
在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱（GPC-GC-MS）是将凝胶渗透色谱和气相色谱-质谱在线联用的分析检测技术，不但具有抗基质干扰能力强、灵敏度高的优点，而且可以连续自动分析，能提高分析速度和结果的准确性，已被应用于农药残留检测[8～10]。本研究采用改进QuEChERS方法对烟叶样品前处理，以在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱（GPC-GC-MS/MS）检测，选取烟草种植生产中对烟叶质量和烟草制品产品安全有影响的常用10种除草剂、抑芽剂和杀虫剂为代表性化合物，建立了烟叶中农药残留量的快速、准确、灵敏分析方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
在线GPC-GC-MS/MS系统（日本岛津公司），GPC配有LC-20AD泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，DGU-20A3R脱气机和SPD-20A紫外检测器；GC-MS/MS包括日本岛津2010-plus气相色谱和TQ 8030三重四级杆质谱，由FCV-12AH电磁阀实现GPC和GC-MS/MS的在线连接。用Quanta 200 扫描电镜（Quanta 200，FEI，Holland）对材料形貌进行表征。
环己烷和丙酮（色谱纯，韩国德山纯化工有限公司）。所用水由Milli-Q系统（Milford， MA， USA）制得。10种目标物和内标（磷酸三苯酯）均购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司，以甲苯（必要时添加丙酮或甲醇）为溶剂配制目标物母液（100 μg/mL）。混合标准工作溶液（内标浓度为20 ng/mL）以甲苯配制，并在-20℃下避光保存。采用溶剂热方法制备Fe3O4[7]：在200 mL反应釜内将5.0 g FeCl3・6H2O 溶解在100 mL 乙二醇中并搅拌得到澄清溶液，再加入15.0 g NaAc 和50 mL乙二胺，搅拌30 min，将反应釜于200℃下反应8 h。待反应釜降温后，用水和乙醇清洗产物， 60℃下干燥，备用。制备磁性吸附剂时，将0.4 g GCB、 0.5 g PSA和1 g Fe3O4置于15 mL具盖玻璃瓶内，用5 mL乙腈清洗3次后，将产物在60℃下干燥即可。
2.2 仪器条件
GPC条件：色谱柱为Shodex CLNpak EV-200（150 mm × 2 mm，16 μm）；柱温为40℃；流动相为环己烷-丙酮（70∶30， V/V）；流速0.1 mL/min；进样量10 μL；GPC收集时间为3.30～5.30 min；GC-MS/MS条件：惰性前置柱5 m × 0.53 mm空柱；预柱DB-35 ms（5 m × 0.25 mm × 0.25 μm），分离柱DB-35 ms（25 m × 0.25 mm × 0.25 μm），柱温箱程序：初始温度82℃，保持5.0 min，再以8℃/min升至300℃，保持7.75 min；不分流进样，进样时间7.0 min；高纯He为载气，压力程序：由120 kPa开始，以100 kPa/min升至180 kPa，保持4.4 min，再以49.8 kPa/min恢复至原始压力，保持33.8 min；程序升温进样口程序：120℃保持5 min，以100℃/min升至250℃，保持33.7 min；接口和离子源温度为300℃和200℃；电离源为EI源；电离电压70 eV；溶剂延迟时间15 min；目标物及内标的多反应监测（MRM）参数如表1所示，碰撞气为Ar，压力200 kPa。
2.3 样品制备
本研究建立烟叶提取液快速净化和检测的方法，因此直接采用文献＼[2＼]报道的方法提取烟叶： 称取2.00 g 烟叶于离心管中，加入10 mL水浸润样品；静置10 min后加入10 mL 乙腈和100 μL 内标溶液，振荡2 min；于-20℃下保持10 min后加入5 mL甲苯、4 g 无水Na2SO4、1 g NaCl＼， 1 g柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠，振荡2 min后离心5 min，收集上层提取液；提取液的净化和检测方法为：取0.5 mL提取液到装有磁性吸附剂的离心管中，振荡1 min；在磁场下将磁性吸附剂与溶液分离，所得溶液为待测液，可进行在线GPC-GC-MS/MS分析。将不含目标物的净化液浓缩吹干，再加入相同体积、不同浓度的系列标准工作溶液，混匀溶解即得到基质匹配标准曲线。
3 结果与讨论
3.1 磁性吸附剂的表征
如图1a所示， PSA表面光滑，而磁性吸附剂中PSA表面粗糙（图1b），且在PSA颗粒之间也有材料均匀分布，观察是GCB和Fe3O4颗粒（图1c）。Fe3O4能使吸附剂在磁场作用下与样品溶液快速分离，同时PSA和GCB能分离提取液中的杂质。
3.2 GPC收集时间考察
图2为在线GPC-GC-MS/MS系统的示意图。其原理为：样品经GPC柱分离，废液直接排出系统，含有目标物的馏分先被储存在定量环（0.2 mL）中，再全部注入GC。注入GC的样品通过打开溶剂蒸气出口实现溶剂的排出，同时目标分析物在保留在预柱中。待溶剂排出口关闭后柱，温箱开始升温，目标物进入分析柱分离。因此选择收集时间显得尤为重要。目标物的分子量在溴氰菊酯和灭螨蜢之间，因此目标物在GPC上的保留时间也介于二者之间，二者在GPC上的保留时间为3.50和5.08 min。考虑灵敏度和基质去除效果，确定收集时间为3.30～5.30 min。
3.3 改进QuEChERS方法的优化
为了得到较好的净化效果，优化了磁性吸附剂的用量和净化时间（GCB、PSA和Fe3O4之间的质量比为4∶5∶10）。如图3a所示，随着吸附剂用量增加，提取液的颜色由黄色逐渐变为近无色，当吸附剂用量达到80 mg时，继续增加用量对净化效果改善不大。且在考察的范围内，各目标物的峰面积没有变化，这可能是因为在烟叶提取液中含有甲苯，使吸附剂与含苯环目标物之间的相互作用力减弱而引起的。考虑净化效果和吸附剂用量，将吸附剂的用量定为80 mg。在0.5～6.0 min范围内，净化时间对净化效果影响不大，且目标物的峰面积没有变化，这是因为吸附剂在净化时是分散的，可以使吸附快速达到平衡，因此净化时间对净化效果没有太大影响。为了稳定净化效果，净化时间选取1.0 min。
比较了本方法与常规QuEChERS方法的净化效果，如图3b所示，未经净化的烟叶提取液颜色为黄色，经过常规QuEChERS方法净化后，提取液颜色变浅；经过本方法净化后，提取液几乎无色（Ⅲ）。因此，本方法对色素等杂质的去除效果较好。
3.4 方法确认
在优化条件下，考察了方法的检出限、定量限、线性范围和重现性。检出限和定量限为目标物信噪比为3和10时对应的浓度。以目标物浓度及其与内标峰面积之比为横、纵坐标，绘制工作曲线。如表2所示，10种目标物的检出限在0.94～100 ng/L之间，定量限在3.1～34 ng/L之间，线性相关系数R2≥0.9989。本方法提取烟叶的结果与标准方法[11]相同，其中9种目标物（甲氰菊酯除外）的检出限为40～600 ng/L。本方法能显著提高灵敏度，是由吸附剂降低基质干扰和在线GPC-GC-MS/MS提高进样量引起的。
为了考察本方法的重现性，配制3种浓度（各目标物线性范围最低值的2、10和100倍）的样品，以一天内配制的4个样品和连续3天配制的样品进行分析，计算日内和日间相对标准偏差。如表3所示，目标物的日内及日间精密度分别小于15.1%和19.8%，其中目标物在中浓度和高浓度下的日内及日间精密度数值不高于8.5%，低浓度下的日内及日间精密度数值相对较高，这可能是由于测定误差引起的。美国分析化学家学会（Association of Official Analytical Chemists， AOAC）提出[12]，可接受的精密度数值随着分析物的浓度或含量降低而升高。本研究中目标物在低浓度（1.52～4.00 μg/L）下的精密度数值低于21%（目标物浓度为10 μg/L时所能接受的精密度数值），说明本方法的重现性可以接受。
3.5 实际样品分析
为了证明本方法在实际样品中应用的效果，采用本方法和现行标准方法[11]处理3种烟叶样品并进行测定。在样品A中测到了七氟菊酯、二甲戊灵和联苯菊酯，采用本方法和标准方法均无法对其进行定量分析；在样品B中测到了七氟菊酯，两种方法的测定结果为1.06和1.03 μg/L，对氟节胺和联苯菊酯均无法进行定量分析；在样品C中测到了仲丁灵、二甲戊灵和氟节胺，两种方法的测定结果为92.1和92.7 μg/L、108.2和112.2 μg/L以及3.68和3.70 μg/L，对七氟菊酯也均无法进行定量分析。结果表明，本方法与标准方法[11]的检测结果相吻合。样品C中测到的目标物数目最多，给出了其中被测到目标物的典型色谱图。如图4所示，目标物均不存在干扰。同时，对净化前的烟叶提取液直接进行在线GPC-GC-MS/MS分析，检测结果与以上两种方法不存在显著性差异：在样品B中测到了七氟菊酯，其浓度为1.01 μg/L；在样品C中测到了仲丁灵、二甲戊灵和氟节胺，其浓度为92.8， 110.2和3.81 μg/L。
将上述3种样品加标后用本方法测定，将所测量与实际加标量相比得到相对回收率。如表4所示，目标物的相对回收率在68.8%～132.2%之间，不同实际样品中目标物在不同浓度下的回收率相差较大，可能是因为不同产地烟叶样品的基质差异引起的。使用气相色谱-串联质谱检测烟叶中的农药残留时，基质增强效应和基质抑制效应同时都存在[13]，其中含有氨基的极性农药化合物在气相色谱分析时主要表现为基质增强效应（如二甲戊灵和联苯菊酯，回收率最高为132.2%），但含有同一功能基团的化合物由于理化特性的差异所呈现的基质效应也会有较大差别（如七氟菊酯，回收率最低为68.8%），而且同一化合物在不同浓度水平和样品基质下产生的基质效应程度也不尽相同（如甲氰菊酯）[14]。
4 结 论
采用磁性吸附剂净化烟叶提取液，再用在线GPC-GC-MS/MS检测，优化了在线GPC-GC-MS/MS条件和影响净化效果的因素，在最佳的条件下建立了烟叶样品中10种农药残留量的测定新方法，并用于实际烟叶样品的测定。由于磁性吸附剂可以在磁场作用下实现快速回收，且在线GPC-GC-MS/MS系统可以提高进样量。与现有标准方法[11]相比，本方法具有样品前处理过程操作简单、净化能力强、灵敏度高等优点，为日常烟叶样品中农药残留量的测定提供了一种可选择的方法。
References
1 Damalas C A， Eleftherohorinos I G. Int. J. Environ. Res. Public Health， 2011， 8（5）： 1402-1419
2 Chen X S， Bian Z Y， Hou H W， Yang F， Liu S S， Tang G L， Hu Q Y. J. Agric. Food Chem.， 2013， 61（24）： 5746-5757
3 Lee J M， Park J W， Jang G C， Hwang K J. J. Chromatogr. A， 2008， 1187（1-2）： 25-33
4 Haib J， Hofer I， Renaud J M. J. Chromatogr. A， 2003， 1020（2）： 173-187
5 Shen A C， Xu Z X， Cai J B， Shao X G. Anal. Sci.， 2006， 22（2）： 241-244
6 Anastassiades M， Lehotay S J， Stajnbaher D， Schenck F J. J. AOAC Int.， 2003， 86（2）： 412-431
7 Zheng H B， Zhao Q， Mo J Z， Huang Y Q， Luo Y B， Yu Q W， Feng Y Q. J. Chromatogr. A， 2013， 1300（1）： 127-133
8 Liu L B， Hashi Y， Qin Y P， Zhou H X， Lin J M. J. Chromatogr. B， 2007， 845（1）： 61-68
9 Lu D S， Qiu X L， Feng C.， Jin Y E， Lin Y J， Xiong L B， Wen Y M， Wang D L， Wang G Q. J. Chromatogr. B， 2012， 895-896 （1）： 17-24
10 RUAN Hua， RONG Wei-Guang， SONG Ning-Hui， JI Wen-Liang， LIU Hua-Liang， MA Yong-Jian. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（8）： 1110-1116
阮 华， 荣维广， 宋宁慧， 吉文亮， 刘华良， 马永建. 分析化学， 2014， 42（8）： 1110-1116
11 YQ/T 47.1- 2014， Tobacco and Tobacco Products Determination of Multi-pesticide Residues Part 1： Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method. Tobacco Industry Standards of the People′s Republic of China.
烟草及烟草制品 多种农药残留量的测定 第1部分： 气相色谱-串联质谱联用法. 中华人民共和国烟草企业标准. YQ/T 47.1-2014
12 Rambla-Alegre M， Esteve-Romero J， Carda-Broch S. J. Chromatogr. A， 2012， 1232 （1）： 101-109
13 CHEN Xiao-Shui， BIAN Zhao-Yang， TANG Gang-Ling， HU Qing-Yuan. Chinese Journal of Chromatography， 2012， 30（10）： 1043-1055
陈晓水， 边照阳， 唐纲岭， 胡清源. 色谱， 2012， 30（10）： 1043-1055
14 HUANG Bao-Yong， OUYANG Xi-Hui， PAN Can-Ping. Chinese J. Pestic. Sci.， 2005， 7（4）： 299-305
关键词 ：食品； 氯丙醇； 在线凝胶渗透色谱气相色谱串联质谱； 固相支持液液萃取净化； 非衍生化
1 引 言
氯丙醇类化合物（包括3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP）早期在于酸水解植物蛋白液及以其为原料的调味品（如酱油等）中发现[1～3]，之后又陆续在面包、香肠、咖啡、谷物类等食品中检出[4～8]。
毒理学研究表明，3MCPD可以通过血睾屏障和血脑屏障，并在体液中广泛分布，具有生殖、肾脏和神经毒性[9，10]。WHO/FAO食品添加剂和污染物联合专家委员会（JECFA）确定1，3DCP具有体外遗传毒性和生殖毒性，会引起大鼠肝、肾脏、甲状腺等的癌变[11]；2，3DCP会对肝、肾脏及产生影响[11]。
目前，食品中氯丙醇的检测通常采用七氟丁酰咪唑（HFBI）、七氟丁酰酐（HFBA）[12]、三氟乙酸酐（TFAA）[13]和苯硼酸[1]等衍生试剂将氯丙醇衍生，利用气相色谱质谱（GCMS或GCMS/MS）法进行测定[14～18]。我国食品安全国家标准 GB/T 5009.1912006《食品中氯丙醇含量的测定》中氯丙醇的测定采用的是以HFBI衍生化的GCMS方法[19]。在上述方法中，衍生化步骤繁冗复杂；衍生物稳定性较差，需衍生后尽快完成测定；衍生试剂昂贵，增加样品检测成本，并且对环境湿度要求极高，否则易吸潮变质。
Online GPCGCMS是将凝胶渗透色谱和GCMS在线联用的分析检测技术，能将样品净化液中分子量较大的脂类、色素等干扰物质与目标物分离，减少基质影响，降低分析背景，提高重现性，实现连续自动的部分前处理和仪器测定的在线分析，加快分析速度和提高分析结果的准确性。与GCMS相比，GCMS/MS将离子碎片施予适当能量再次打碎，形成二级离子碎片，增强了结构解析和定性能力，更有效地排除基质干扰。本研究建立了非衍生化的Online GPCGCMS/MS法直接测定食品中氯丙醇的检测方法，同时对食品样品的前处理方法进行了优化。本方法对样品的适用性广泛，不仅适用于调味品，也适用于面包、糕点等其它食品样品。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
Online GPCGCMS/MS系统（日本Shimadzu公司），GPC系统包括SIL20ADvp自动进样器、ShodexEV200AC凝胶渗透色谱柱（150 mm × 2 mm）、CTO20ASvp柱温箱、SPD20Avp紫外检测器；GCMS/MS系统包括QP2010Plus气相色谱仪、TQ8040型质谱联用仪，并配有PTV2010大体积进样器；MilliQ超纯水器（美国Millipore公司）；G560E型涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；NEVAPTM111型吹氮浓缩仪（美国Organomation Associates公司）；G560E涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；AL204分析天平（瑞士梅特勒公司）；NDO400型电热恒温鼓风干燥箱（杭州汇尔仪器设备有限公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）。
3MCPD（纯度98%，德国Aldrich公司）；五氘代3氯1，2丙二醇（D53MCPD，纯度≥99%，德国DrEhrenstorfer公司）；1，3DCP、2，3DCP、五氘代1，3二氯2丙醇（D51，3DCP）和五氘代2，3二氯1丙醇（D52，3DCP）（纯度≥97%，德国Fluka公司）；2MCPD、五氘代2氯1，3丙二醇（D52MCPD）（纯度≥98%，加拿大TRC公司）；正己烷、乙酸乙酯（色谱纯，美国J.T. Baker公司）；无水Na2SO4（优级纯，天津市津科精细化工研究所，使用前经195℃烘烤8 h使用）；ExtrelutTM NT硅藻土填料（德国Merck公司）。
2.2 标准溶液的配制
分别准确称取各氯丙醇和氘代氯丙醇标准品10 mg（精确至0.01 mg），用乙酸乙酯溶解并定容至不同的10 mL棕色容量瓶中，配制成1000 mg/L标准储备液，于20℃贮存。准确吸取各氯丙醇标准储备液， 用正己烷逐级稀释，配制成10 mg/L氯丙醇混合标准使用液。准确吸取各氘代氯丙醇标准储备液，用正己烷稀释，配制成10 mg/L氘代氯丙醇混合标准使用液。分别准确吸取适量氯丙醇标准使用液和适量氘代氯丙醇标准使用液， 用正己烷稀释，配制成0.01， 0.02， 0.05， 0.1， 0.2， 0.5和1.0 mg/L的氯丙醇系列混合标准工作液，其中氘代氯丙醇的含量均为0.2 mg/L。
2.3 实验方法
2.3.1 样品提取与净化 准确称取2 g试样于10 mL离心管中（若为固体或半固体试样，则加入2 mL水，溶解后混匀），加入10 mg/L氘代氯丙醇混合标准使用液20 μL，涡旋30 s，加入到填充了2 g ExtrelutTM NT硅藻土填料的塑料层析柱（180 mm × 150 mm）中，静置10 min，用3 mL正己烷淋洗，弃去流出液，以10 mL乙酸乙酯进行固相支持液液萃取，收集流出液至装有3 g无水Na2SO4的离心管中，充分吸收水分，转移上清液并于30℃以氮气吹至近干，用正己烷定容至1 mL，涡旋混匀，无水Na2SO4除水，待测。
2.3.2 Online GPCGCMS/MS条件 Online GPC条件：泵流速0.1 mL/min；柱温40℃；载气吹扫0.1 min； 流动相为丙酮环己烷（3∶7， V/V）。
气相色谱质谱条件： 气相色谱柱系统包括空柱（惰性石英管，5 m × 0.53 mm）、预柱（DB5MS石英毛细管柱，5 m × 0.25 mm × 0.25 μm）和分析柱（DB5MS石英毛细管柱，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。进样体积：10 μL，不分流进样。进样口程序升温：120℃保持5 min，以100℃/min升至280℃，并恒温15.9 min。进样时间：7 min；柱温箱程序升温：82℃保持5 min，以8℃/min升至150℃，继续以25℃/min升至250℃，并保持5 min。载气：高纯氦气（纯度99.999%），流速为1.75 mL/min。离子源：电子轰击源，温度为200℃。溶剂延迟时间为10 min。采用多反应监测模式（MRM）扫描，主要质谱参数见表1。
3 结果与讨论
3.1 Online GPC收集时间考察
Online GPCGCMS/MS的原理是样品经Online GPC柱分离，废液通过六通阀排出，含有目标物的馏分先被储存在定量补集环路（200 μL）中，再全部注入GC，通过溶剂蒸汽出口排出溶剂，同时目标分析物保存在预柱中。待溶剂排出口关闭后柱，柱温箱开始升温，目标物进入分析柱分离，因此收集时间的选择显得尤为重要。配制0.5 mg/L氯丙醇混合标准溶液，重复进样5次，获得目标物在GPC上保留时间为3.99～ 4.05 min，考虑到灵敏度和基质去除效果，确定收集时间为3.80～4.25 min。氯丙醇及其内标混合标准溶液（0.2 mg/L）的MRM质谱图见图1， 各氯丙醇的色谱图见图2和图3。
3.2 样品净化方法的优化
文献 [20，21]利用ExtrelutTM NT硅藻土进行固相支持液液萃取净化，测定食用植物油中的氯丙醇，使提取液先吸附于硅藻土表面，经正己烷淋洗去除脂肪和色素后，以乙酸乙酯与吸附于硅藻土表面的氯丙醇进行液液萃取。本实验对乙酸乙酯溶剂（纯度≥99%）的用量（2， 4， 6， 8， 10和12 mL）进行了优化，结果见图4，当乙酸乙酯用量为10 mL时，各氯丙醇的峰面积响应值最高。因此，乙酸乙酯用量选择10 mL。
考虑到Online GPC的在线净化能力以及简化实验操作，比较了不经填料吸附直接进行液液萃取净化的传统方法与以ExtrelutTM NT硅藻土进行的固相支持液液萃取净化方法的效果，以空白酱油样品添加回收实验的方式（0.2 mg/L）测得4种氯丙醇的回收率分别为53.2%～81.2%和83.3%～110.1%。结果表明，以ExtrelutTM NT硅藻土进行的固相支持液液萃取净化的效果更好、准确度更高。
3.3 方法学验证
3.3.1 线性范围、检出限和定量限 以氯丙醇混合标准使用液及氯丙醇内标标准使用液配制浓度分别为0.005， 0.01， 0.02， 0.05， 0.1， 0.2， 0.5和1.0 mg/L（内标浓度均为0.2 mg/L）的氯丙醇系列标准工作液，经Online GPCGCMS/MS测定。以氯丙醇的色谱峰峰面积与其对应的内标的色谱峰峰面积之比（y）为纵坐标，氯丙醇与其对应内标的浓度之比（x）为横坐标，绘制标准工作曲线，结果见表2。4种氯丙醇在0.005～1.0 mg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数（R）均大于0.999。
在空白酱油样品中添加0.001， 0.002， 0.005和0.010 mg/L 4个水平的3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP标准样品。以3倍信噪比（S/N=3）所对应的含量作为方法的检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）所对应的含量作为方法的定量限（LOQ），得到氯丙醇类化合物的检出限在0.002～0.005 mg/kg之间， 定量限在0.005～0.01 mg/kg之间，结果见表2。与文献[19]报道的衍生化方法相比，本方法的检出限更低（表3）。
3.3.2准确度与精密度 以空白酱油加标回收率表示方法的准确度，以回收率的相对标准偏差（RSD）表示方法的精密度。在空白酱油样品中添加0.02， 0.1和0.5 mg/L的3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP， 2，3DCP标准样品，每个加标水平平行测定6份，结果见表4。4种氯丙醇的3个水平加标回收率和相对标准偏差（RSD）分别为94.8%～106.3%（2.2%～10.3%）， 91.8%～108.8%（2.1%～10.6%）和83.1%～109.4%（1.3%～9.4%）。结果表明，方法的精密度和准确度良好。
3.4 实际样品分析
利用本方法对于北京地区超市、农贸市场及相关食品企业采集的78份食品样品（其中包括酱油20份、料酒16份、面包糕点21份、鸡精15份、水解植物蛋白液3份、水解植物蛋白粉3份）进行了检测，结果见表5。在检测的78份样品中，3MCPD的检出率最高，为100%（78/78），2MCPD的检出率为67.9%（53/78），1，3DCP和2，3DCP的检出率相对较低。依据食品安全国家标准GB27622012《食品中污染物限量》[22]对液态调味品和固态调味品中3MCPD的限量标准（0.4和1.0 mg/kg），酱油、水解植物蛋白液、水解植物蛋白粉、料酒、鸡精样品超标率依次为4/20， 2/3， 1/3， 2/16， 0/15。由样品检测结果可见，某些食品中氯丙醇污染水平仍然较高，因此有必要对食品中氯丙醇污染进行监测，并采取相应的监督管理措施。
4 结 论
结合固相支持液液萃取净化样品前处理技术，建立了无需衍生化反应的Online GPCGCMS/MS同时测定食品中氯丙醇的方法。通过线性实验、空白加标回收实验等方法学实验验证了方法的准确性。与传统的GCMS衍生化方法相比，本方法简便、快速、经济，适于食品中氯丙醇的检测。实际样品检测结果表明，不同食品中仍存在氯丙醇污染超过我国相关限量标准的现象，因此有必要加强监测及相应的监督管理措施。
References
1 Baer I， Calle B I， Taylor P. Anal. Bioanal Chem.， 2010， 396： 443-456
2 Velíek J， Davidek J， Hajlová J， Kubelka V， Janíek G， Mánková B. Zeitschrift Fur LebensmittelUntersuchung UndForschung， 1978， 167（4）： 241-244
3 Collier P D，Cromie D D O， Davies A P. J. Am. Oil Chem. Soc.， 1991， 68： 785-790
4 Anna R S， Ewa C. J. Verbr. Lebensm.， 2015， 10： 117-122
5 Belitz H D， Grosch W， Schieberle P. Food Chemistry. Berlin Heidelberg： Springer， 2009： 938-970
6 Dolezal M， Chaloupska M， Divinova V， Svejkovska B， Velisek J. Eur. Food Res. Technol， 2005， 221： 221-225
7 Svejkovska B， Novotny O， Divinova V， Reblova Z， Dolezal M， Velisek J. Czech J. Food Sci.， 2004， 22（5）： 190-196
8 Chung H Y， Chung S W C， Chan B T P， Ho YY， Xiao Y. Food Addit. Contam. A， 2013， 30（9）： 1508-1512
9 Jones A R， Chantrill L A. Reprod. Fert. Develop.， 1989， 1： 357-367
10 Hamlet C G， Sadd P A， Gray D A. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（7）： 2067-2072
11 JECFA. JECFA Monograph on the Safety Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants.， 2001
12 LI YongJun， HUANG ZhiQiang， DAI Hua. Chin. J. Anal. Lab.， 2003， 22（4）： 47-49
李拥军， 黄志强， 戴 华. 分析试验室， 2003， 22（4）： 47-49
13 LUO RenCai， JIN QingZhong， ZHANG Zheng， ZHOU Shan， LI Jie. Food Sci.， 2000， 21（7）： 36-37
罗仁才， 金庆中， 张 正， 周 珊， 李 洁. 食品科学， 2000， 21（7）： 36-37
14 FU WuSheng， WU YongNing， ZHAO YunFeng， MA JinBo， ZHANG Qi. Chin. J. Food Hyg.， 2004， （4）： 289-294
傅武胜， 吴永宁， 赵云峰， 马金波， 张 琦. 中国食品卫生杂志， 2004， （4）： 289-294
15 GAO Jie. Chin.Brew.， 2013， 32（9）： 145-147
高 洁. 中国酿造， 2013， 32（9）： 145-147
16 HUANG Qi， JI XiaoJuan， WANG DanDan. J. Zhejiang. Univer. Sci. Techn.， 2013， 25（1）： 33-37
黄 琦， 季晓娟， 丹. 浙江科技学院学报， 2013， 25（1）： 33-37
17 XU XiaoMin， SHEN XiangHong， SONG GuoLiang. REN YiPing. Chin. J. Heal. Lab. Techn.， 2006， （6）： 661-662
徐小民， 沈向红， 宋国良， 任一平. 中国卫生检验杂志， 2006， （6）： 661-662.
18 YANG XueQin， LU LiXia， XIONG XiaoHui. Food Res. Develop.， 2008， 29（7）： 162-164
杨雪芹， 陆利霞， 熊晓辉. 食品研究与开发， 2008， 29（7）： 162-164
19 GB/T 5009.1912006， Ministry of Health of the People′s Republic of China. Determination of Chloropropanols in Foods， 2006
GB/T 5009.1912006， 中华人民共和国卫生部. 食品中氯丙醇含量的测定， 2006
20 LI Shan， MIAO Hong， CUI Xia， ZHAO YunFeng， WU YongNing. Chin. J. Prev. Med.， 2015， 49（6）： 102-107
李 珊， 苗 虹， 崔 霞， 赵云峰， 吴永宁. 中华预防医学， 2015， 49（6）： 102-107
21 CUI Xia， DING Hao， ZOU JianHong， LI Shan， MIAO Hong， FU WuSheng， ZHAO YunFeng， WU YongNing. Food Sci.， 2014， 35（12）： 98-102
崔 霞， 丁 灏， 邹建宏， 李 珊， 苗 虹， 傅武胜， 赵云峰， 吴永宁. 食品科学， 2014， 35（12）： 98-102
22 GB/T 2762-2012， Ministry of Health of the People′s Republic of China. The Limit of Contaminants in Foods， 2012
GB/T 2762-2012， 中华人民共和国卫生部. 食品中污染物限量， 2012
Abstract A derivatizationfree method for chloropropanols determination in food using online gel permeation chromatographygas chromatographytriple quadrupole mass spectrometry （Online GPCGCMS/MS） with free of derivatization was established. The target compounds were 3monochloropropane1，2diol （3MCPD）， 2monochloropropane1，3diol （2MCPD）， 1，3dichloropropan2ol （1，3DCP） and 2，3dichloropropan1ol （2，3DCP）. Samples were spiked with isotope internal standards， and extracted by matrix solidsupported liquidliquid extraction on the ExtrelutTM NT absorbent. Hexane was added to wash away the apolar matrix interferences and then ethyl acetate was used to extract the target compounds. The concentrated extracts were directly injected into Online GPCGCMS/MS. The good linear relationships for the four types of analytes were obtained in the concentration range of 0.005-1.000 mg/L with correlation coefficients not less than 0.999. The limits of detection and quantitation for chloropropanols in the food samples were in the ranges of 0.002-0.005 mg/kg， and 0.005-0.01 mg/kg respectively. The recoveries and the relative standard deviations （RSD， n=6） for the spiked blank samples at the levels of 0.02， 0.1， 0.5 mg/kg were in the ranges of 94.8%-106.3% （2.2%-10.3%）， 91.8%-108.8% （2.1%-10.6%） and 83.1%-109.4% （1.3%-9.4%）， respectively. The established method was applied to the samples of soy sauce， hydrolyzed vegetables protein solution and powder， cooking wine， chicken powder， bread and cake， and satisfactory results were acquired.
关键词 间苯二甲酸二辛酯；气相色谱-质谱联用法；食品塑料；包装材料；检测；加标回收率
中图分类号 O657.7+1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）19-0273-02
为了改变材料的功能或性质，在食品包装材料和容器的生产过程中通常会添加一些化学助剂，其直接与食品接触后会迁移到食品中，这其中最引入关注的就是增塑剂[1]。目前，这类物质的主要代表就是邻苯二甲酸酯类增塑剂（Phthalate Esters，PAEs）化合物，它们对人类产生的影响，主要表现为改变人体内分泌系统的正常功能，并对人体内未受损的器官或其后代造成不利影响。该类物质发挥着类似雌性激素的作用存在于人体和动物体内，它不仅使女性患乳腺癌的几率增加，而且甚至还会危害她们将来生育男婴的生殖系统[2-3]；同时，它还可减少男性的量和数量，甚至导致癌。
2011年的“起云剂”和2012年的白酒“塑化剂”等重大食品安全事件都是由邻苯二甲酸酯类化合物引起的，因此人们对这类物质的关注都很高。与邻苯二甲酸酯结构相似的间苯二甲酸酯也是一类十分重要的化工原料，广泛用于生产塑料、涂料、油漆、化学纤维等。间苯二甲酸酯类物质被列为环境激素类物质，因为它可能具有致癌、致畸、致突变的作用。这类物质可以对动物的内分泌调节作用产生重大影响，从而导致动物不能正常生长和发育。间苯二甲酸酯类物质主要通过食品生产加工和包装过程所接触材料迁移进入食品。间苯二甲酸酯也是高脂溶物质，主要污染鱼、肉、蛋及含油脂等食品。但目前我国对此类苯二甲酸酯的检测方法标准却是空白，甚至也很少有人研究包装材料中这类物质的检测方法。因此，我国目前缺少对这类污染物进行监管的技术条件。但随着间苯二甲酸二甲酯限量的制定，欧盟将会逐渐重视这类污染物的检测，这将对我国今后的食品和食品包装材料出口贸易产生重要的影响。此外，食品接触材料中的这类环境内分泌干扰物在与食品接触之后将迁移到食品中，造成食品污染，直接危害我国人民的身体健康。因此，必须尽快建立测定这类化合物的系列检测方法标准，确保食品安全和降低出口风险，消除技术壁垒[4]。本文使用环己烷-乙酸乙酯混合溶剂作为提取溶剂，采用凝胶渗透色谱净化技术，首次对塑料食品包装材料中间苯二甲酸二辛酯的含量进行了测定。试验结果表明该方法准确、简便、快速，结果令人满意，为食品包装材料的质量安全监管提供了技术手段。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试试剂。环己烷、乙酸乙酯（HPLC级，美国Fisher公司）；间苯二甲酸二辛酯（纯度均≥98%，Dr. Ehrenstorfer标准品公司，CAS：137-89-3）；其他试剂均为分析纯（上海国药集团）。
1.1.2 试验仪器。由美国Thermo Fisher Scientific公司生产提供的TSQ Quantum GC串联四极杆气质联用仪、Xcalibur数据采集处理系统；由德国LC-Tech公司生产提供的凝胶渗透色谱仪（GPC）；由昆山市超声仪器有限公司生产提供的KQ5200DE数控超声波清洗器。
1.2 试验方法
1.2.1 制备间苯二甲酸二辛酯标准溶液。称取间苯二甲酸二辛酯标准品（要求精确至0.1 mg），再利用正己烷将其配制成 1 000 mg/L的储备液。用环己烷-乙酸乙酯（1：1，v/v）逐级稀释成10、50、100、200、500 μg/L的标准工作溶液[5]。
1.2.2 样品前处理。首先将食品塑料包装材料粉碎成细小颗粒，要求粉碎程度达到单个颗粒
1.2.3 GC-MS分析条件。使用Rtx-5 MS毛细管气相色谱柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气，不分流进样，气体流速为1.0 mL/min。柱箱初始温度为初始柱温70 ℃，以40 ℃/min的速度升温，直至将温度升至280 ℃，保持6 min；进样器温度为280 ℃，检测器温度为280 ℃。EI离子源，230 ℃，70 ev；质量扫描方式：选择离子监测（SIM），监测离子为167、279、149和261；其相对丰度比为167∶279∶149∶261=100∶32∶26∶9；定量离子为167。标准谱图调谐。
1.2.4 建立间苯二甲酸二辛酯标准曲线。标准工作溶液经过GC-MS分析测定后，以间苯二甲酸二辛酯的标准溶液浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，作校准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。最终确定间苯二甲酸二辛酯含量在10～500 μg/L范围内呈现良好线性关系，其线性方程为Y=4313 3.3X-13 025.3（r2=0.999 8）。
1.2.5 凝胶渗透色谱条件。凝胶渗透色谱柱：320 mm×25 mm （内径）玻璃柱，Bio-beads（S-X3），200～400目，50 g；流动相：环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v）；流速：5 mL/min；流出液收集时间：20～35 min。取上述提取液5 mL按照凝胶色谱条件净化，收集净化液直接用于GC-MS测定[6]。
2 结果与分析
2.1 萃取溶剂的选择
在试验过程，分别选择二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷和环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v）等5种溶剂，并比较它们的萃取效率，以提高食品塑料包装材料中间苯二甲酸二辛酯的萃取效率。结果表明，当间苯二甲酸二辛酯的浓度为 100 μg/kg时，二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷和环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v）等5种溶剂的加标回收率分别为92%、95%、95%、96%、97%，即5种溶剂的萃取效率相当。但使用二氯甲烷萃取聚氯乙烯塑料时，由于二氯甲烷的浓缩液为粘稠状，因此存在污染分析仪器的风险。为减少试验步骤，考虑到GPC使用的溶剂为环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v），最终将萃取溶剂定为环己烷+乙酸乙酯。
2.2 定性分析
间苯二甲酸二辛酯标准物质的总离子流色谱图见图1，待测成分的保留时间为9.01 min，而加标的样品中间苯二甲酸二辛酯与标准物质的保留时间相同，且峰形表现为尖锐对称，待测物的色谱峰周围很少看到干扰色谱峰。此外，间苯二甲酸二辛酯标样全扫描质谱图见图2，比较两者的全扫描质谱图可以发现，其离子碎片主要是167、279、149和261等，且相对丰度比基本上是100∶32∶26∶9。这说明该方法分离比较完全，且具有抗干扰能力强的优势，完全可以用于对间苯二甲酸二辛酯的准确定性分析[7]。
2.3 净化条件的优化
食品包装材料印刷油墨的成分较复杂，通常会含有较多有机杂质，存在较大的基质效应，需对样品的提取液进行净化处理。提取液的一般采用固相萃取小柱进行净化，但考虑到GPC是除油墨中大分子杂质的较理想的净化方法，且容易实现自动化[4]，因此试验净化处理方法采用GPC。同时，分别将收集时间设定为10～15、10～20、10～25、10～30 min，考察流出液收集时间对于目标化合物回收率的影响。试验结果表明，以10～25、10～30 min时间段的间苯二甲酸二辛酯的平均回收率较好，最终将GPC流出液的收集时间定为10～25 min，以利于节约溶剂。通过GPC净化和富集，样品基质的背景噪音得到降低，效果很好。
2.4 空白样品的加标回收率和精密度
向空白样品中添加间苯二甲酸二辛酯标准溶液，浓度分别为0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/kg，然后利用上述方法进行检测分析，获得间苯二甲酸二辛酯的平均回收率分别为108%、81%、79%、93%和92%（表1）。试验结果表明，对于间苯二甲酸二辛酯定量测定的要求，该方法的回收率和精密度均可满足。根据对空白样品进行试验测定的检出限，确定方法的检出限为0.05 mg/kg。
3 结论与讨论
试验结果表明，笔者建立的食品塑料包装材料中间苯二甲酸二辛酯残留检测的GC-MS方法具有简单、灵敏和快速的优点，而且笔者还优化了食品塑料包装材料的提取溶剂等前处理方法和GC-MS分析仪器条件[7]，最终说明该方法可应用于食品塑料包装材料中间苯二甲酸二辛酯的定性定量检测，填补了国内空白。
4 参考文献
[1] 陈志锋，潘健伟，储晓刚，等.塑料食品包装材料中有毒有害化学残留物及分析方法[J].食品与机械，2006，22（2）：3-7.
[2] 陈军，柳艳.残留的检测[J].检验检疫科学，2008，18（6）：45-47.
[3] 张伟亚，王成云，刘丽.固相微食品包装材料中邻苯二甲酸酯增塑剂萃取气相色谱-质谱法测定塑料浸泡液中己二酸酯类增塑剂的溶出量[J].塑料科技，2007，35（2）：74-76.
[4] 张居舟，李静，何俊，等.凝胶渗透色谱-气相色谱串联质谱法同时测定食品包装材料印刷油墨中8种光引发剂[J].中国印刷与包装研究，2014，6（6）：118-123.
[5] 张磊，吴青，梁健华，等.高效液相色谱法同时测定食品塑料包装材料中8种邻苯二甲酸酯的含量[J].食品科学，2012（20）：184-188.
[6] 方姚，沙万忠.食品及食品包装材料中邻苯二甲酸酯类增塑剂检测技术研究进展[J].刑事技术，2016（1）：20-24.
关键词溴系阻燃剂；气相色谱负化学源质谱；高效液相色谱串联质谱；乳制品；固相萃取
1引言
自20世纪70年代以来，溴系阻燃剂（BFRs）被广泛应用于各类产品中，但其在生产、使用和产品废弃过程中不断释放到周围环境中，并通过食物链富集放大，由此带来的环境污染和人群健康危害已成为热点问题[1，2＼]。多溴联苯醚（PBDEs）、四溴双酚A（TBBPA）和六溴环十二烷（HBCD）是当前产量最大及使用时间最长的3种溴系阻燃剂。在2009年《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》缔约方大会已明确将多溴联苯醚中的五溴和八溴联苯醚列为持久性有机污染物并建议禁用。TBBPA已被欧盟列入优先控制化学品名单，我国则由于TBBPA产量和消费量巨大，已成为TBBPA污染最严重的国家[3＼]。HBCD于2013年被确定为持久性有机污染物，我国目前也是HBCD的主要生产和使用[4＼]。
随着传统阻燃剂陆续禁限用，新型溴系阻燃剂（NovelBFRs，NBFRs）逐步推广。例如十溴二苯乙烷（DBDPE）作为十溴二苯醚替代品，自2005年在我国投产以来，年均增幅达80%[5＼]。其它NBFRs（如五溴甲苯（PBT））也逐渐推广。在大气、河流底泥、生物体等多基质中均已发现NBFRs残留[6＼]，甚至在青藏高原和极地地区也发现了BTBPE等NBFRs，表明部分NBFRs也具有持久性有机污染物的特征[7＼]。
乳制品是当前消费量快速增长的一大类食品，尤其是婴幼儿配方乳消费量巨大，因此乳制品中环境污染物的污染水平需持续监控。现有研究多针对PBDEs和HBCD等传统BFRs，极少涉及乳制品中NBFRs的监测[8＼]。本研究采用凝胶渗透色谱结合固相萃取技术建立乳制品中多种BFRs的同时前处理技术，并采用色谱质谱技术建立仪器分析方法，本方法稳定可靠，适用于乳制品中BFRs的多残留检测，也可用于母乳或其它富含脂肪的食品样本的检测。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent7890B5977A气相色谱质谱仪、Agilent12006410高效液相色谱三重四级杆质谱仪（美国安捷伦公司）；AccuPrepMPS全自动凝胶渗透净化系统（美国J2Scientific公司）。
农残级或色谱级正己烷、甲醇、二氯甲烷、丙酮、环己烷、乙酸乙酯（美国J&T.Baker公司或迪马公司）；硅胶（德国默克公司），使用前经500℃烘烤5h后加入98%浓H2SO4制成44%酸化硅胶；优级纯浓H2SO4（98%）、无水Na2SO4（北京化工厂）。LCSi固相萃取柱（500mg，3mL，美国Supelco公司）。PBDEs混合标准样品（BDECM）包括美国环境保护署1614草案中列出的环境中优先关注的8种PBDEs单体：BDE28，47，99，100，153，154，183和209；新型溴系阻燃剂单体，五溴甲苯（PBT）、五溴乙苯（PBEB）、六溴苯（HBB）、2，3二溴丙基2，4，6三溴苯基醚（DPTE）、1，2双（2，4，6三溴苯氧基）乙烷（BTBPE）和十溴二苯乙烷（DBDPE）；内标：3，3′，4，4′，四溴联苯醚（BDE77）和2，2′，3，3′，4，4′，六溴联苯醚（BDE128），上述标准品均购于美国AccuStandard公司。αHBCD，βHBCD，γHBCD和TBBPA及同位素内标13C12BDE209，13C12αHBCD，13C12βHBCD，13C12γHBCD和13C12TBBPA均购自美国WellingtonLaboratories公司。
2.2样品处理
提取：纯牛奶、酸奶、奶粉等奶制品或母乳样品，根据脂肪含量取3～15g（确保脂肪含量约1g），经冷冻干燥机冻干后，于研钵中研碎后置于纤维素提取套筒中，加入内标BDE77、BDE128各1ng，13C12BDE209、13C12TBBPA与13C12α，β，γHBCD各10ng，加标实验时需再加入不同浓度的待测物混合标准液，随后以正己烷/丙酮（1KG-3∶KG-51，V/V）索氏提取16h以上。
自动凝胶色谱净化：索氏提取后蒸去溶剂，以重量法计算脂肪含量，加入乙酸乙酯/环己烷（1KG-3∶KG-51，V/V）复溶至6mL。自动凝胶净化系统采用低压填充柱，填料为50gBioBeadsSX3，柱规格50cm×2cmi.d.；紫外检测器检测波长240nm；流动相为乙酸乙酯/环己烷（1KG-3∶KG-51，V/V），流速5mL/min，进样量5mL，收集20～45min流出组分并减压蒸发至近干，加2mL正己烷复溶，待下一步净化。
酸化硅胶净化：采用自制酸化硅胶净化柱，于20cm×1cm玻璃柱中自下而上依次装填1cm高无水Na2SO4，5g酸化硅胶，1cm高无水Na2SO4。酸化硅胶柱经10mL正己烷淋洗后上样，先用30mL正己烷，再用10mL二氯甲烷洗脱待测物，洗脱液旋转蒸发至近干，加2mL正己烷复溶，待固相萃取柱分离。
方法的检测限（LOD）实验以牛奶为加标基质，测定最低加标水平的响应，计算信噪比（S/N），以S/N=3和S/N=10时对应的浓度为检出限（LOD）和定量限（LOQ）。各化合物的保留时间、线性方程、相关系数（R2）、LOD和LOQ结果见表1。各待测物的标准曲线的相关系数R2为0.9989～0.9998，表明标准曲线线性良好。
3.3.2加标回收实验以经检测无待测物残留的某品牌纯牛奶为空白基质进行加标回收实验，取样量10g，加标水平如表2所示，每个加标水平按本方法平行测定5次，加标回收率及RSD列于表2。BTBPE回收率普遍偏低且RSD值较高，说明BTBPE在前处理过程中不稳定且有较高损失，其余待测物平均回收率在80.1%～114.7%之g，RSD在0.87%～14.9%之间。
3.3.3基质效应采用提取后添加法考察HPLCMS/MS分析中的基质效应，即比较两组溶液的待测物信号峰面积，其中组1为标准品溶液，组2为某空白纯牛奶样提取液中添加标准品所得溶液，则基质效应（ME）=基质溶液中待测物峰面积/纯溶剂中待测物峰面积。通过对0.1，1.0和10ng/g3个浓度水平的测定，发现乳制品测定时存在基质抑制效应，HBCD和的基质效应比TBBPA更加明显。TBBPA的ME在0.84～0.95之间，αHBCD的ME为0.71～0.93，βHBCD和γHBCD的ME比较接近，均在0.6～0.8之间。为降低基质效应的影响，除了对样品前处理方法和检测条件进行优化之外，采用稳定性核素标记物（13C12HBCD和13C12TBBPA）作为内标是必不可少的。
3.4实际样品测定
应用所建立方法检测8份市售奶制品样本以ZH（及从某妇幼保健院采集的2份母乳样本，结果见表3。在PBDEs、TBBPA和HBCD3种传统阻燃剂中，BDE28，47和99检出率较高，但BDE209污染水平较高，TBBPA和HBCD在母乳中的污染水平比乳制品要高，因为BFRs多具有生物蓄积性，因此处在食物链高端的人类体内BFRs含量普遍高于处在食物链低端的食草类动物。HBCD的3个异构体中，由于代谢速度差异和体内生物转化，导致βHBCD和γHBCD在生物体内含量普遍低于αHBCD，本研究中αHBCD检出率较高而βHBCD和γHBCD均未检出，与文献＼[13＼]结果类似。在NBFRs中，DBDPE可能由于检出限较高的关系均未检出。PBT在所有样本中均可检出，HBB，DBTE和BTBPE检出率也较高，说明随着NBFRs的迅速推广应用，食品中NBFRs的污染水平也可能随之升高，需持续关注。ZH）
3.5小结
以索氏提取、凝胶色谱和固相萃取为前处理方法，GCNCI/MS和HPLCMS/MS为仪器分析方法，建立了乳制品中18种溴系阻燃剂的检测方法，并实现了18种溴系阻燃剂的同时提取与净化。本方法稳定可靠，可用于食品及生物样品中溴系阻燃剂的多残留分析。
References
1（#FrommeH，BecherG，HilgerB，VolkelW.Int.J.Hyg.Environ.Health，2016，219（1）：1-23
2YuG，BuQ，CaoZ，DuX，XiaJ，WuM，HuangJ.Chemosphere，2016，150：479-490
3TIANYuPing，WUJianJun，WANGDongHui，LIYiRui，ZHAYueZhen.JournalofInstrumentalAnalysis，2007，26（z1）：652-653
田玉平，吴建军，王东辉，李易瑞，查月珍.HTK分析测试学报，2007，26（z1）：652-653
4LiuK，LiJ，YanS，ZhangW，LiY，HanD.Chemosphere，2016，148：8-20
5ZHANGSheng，GUXiaoYu.PlasticsAdditives，2013，6：12-15
张胜，谷晓昱.HTK塑料助剂，2013，6：12-15
6HESongJie，LIMingYuan，JINJun，WANGYing，HEChang，BUYunJie，TIANYang.ChineseJ.Anal.Chem.，2012，40（10）：1519-1523
何松洁，李明圆，金军，王英，何畅，卜云洁，田D.HTK分析化学，2012，40（10）：1519-1523
7XiaoH，ShenL，SuY，BarresiE，DejongM，HungH，LeiYD，WaniaF，ReinerEJ，SverkoE，KangSC.Environ.Pollut.，2012，161：154-161
8FrommeH，BecherG，HilgerB，VlkelW.Int.J.Hyg.Environ.Health，2016，219：1-23
9PapachlimitzouA，BarberJL，LosadaS，BersuderP，LawR.J.Chromatogr.A，2012，1219：15-28
10MontieEW，LetcherRJ，ReddyCM，MooreMJ，RubinsteinB，HahnME.Mar.Pollut.Bull.，2010，60（8）：1160-1169
11StapletonHM，AllenJG，KellySM，KonstantinovA，KlosterhausS，WatkinsD，McCleanMD，WebsterTF.Environ.Sci.Technol.，2008，42（18）：6910-6916
关键词 大豆油；特丁基对苯二酚；凝胶渗透色谱；气相色谱仪
中图分类号 TS221 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0273-02
Abetract Using gel penetration chromatography （GPC） and gas chromatography （GC） technique to establish analysis method of soybean oil antioxid-ant tertiary butyl hydroquinone （TBHQ）. Sample by GPC automatic gel purification quantitative concentration spectrometer purification， HP-5 （30 m× 0.32 mm，0.25 μm） for the separation and deter mination of chromatographic column.The detection limit was 4 mg/kg.TBHQ had a good linearity in the detection range，the concentration in the range of 1～1 000 mg/L and the peak area was linear correlation，the correlation coefficient was 0.999 6.Recovery rate of oil sample was between 88.3% and 95.4%.The relative standard deviation （RSD） was less than 4%.
Key words soybean oil；TBHQ；gel permeation chromatography；gas chromatography
氧化是导致食品品质变劣的重要因素之一，特别是在食用油或者含油量较高的食品中更是如此。大豆油是日常生活中主要的一种食用油，为了防止大豆油氧化酸败，延长货架期，市售大豆油往往需要在其中添加适宜的抗氧化剂[1-3]。特丁基对苯二酚作为油溶性抗氧化剂的新型产品，它的抗氧化能力大于2，6-二叔丁基对甲苯（BHT），被广泛用于延迟或阻止食品油脂的氧化变质中。
食用油脂中TBHQ常用的分析方法有比色法、气相色谱法、液相色谱法，但这些前处理方法比较繁琐，同时样品油脂得不到充分的净化[2-4]。该文采用凝胶渗透色谱/气相色谱法测定大豆油中抗氧化剂特丁基对苯二酚，具有步骤简单、结果准确、灵敏度高等优点。
1 材料与方法
1.1 试验仪器与试剂
1.1.1 供试仪器。7683 Series自动进样器；GPC全自动凝胶净化-定量浓缩联用仪：Free StyleTM ；氢火焰离子化检测器（FID）；旋转蒸发仪：HEIDOLPH；漩涡混合器： IKA GENIUS 3；电子天平：梅特勒-托利多ML204；6890N气相色谱仪：Aglient。
1.1.2 供试试剂。TBHQ标准品（纯度99%）：农业部环境保护科研检测所；环己烷、乙酸乙酯均为色谱纯；市售一级大豆油。
1.2 气相色谱分析条件
HP-5非极性毛细管柱（30 m×0.32 mm i.d）， 膜厚0.25 μm （Aglient，USA） ；进样口温度：250 ℃；FID检测器温度：250 ℃；程序升温：初始温度80 ℃，保留1 min，以10 ℃/min速度升至220 ℃，保持稳定1 min；载气流速1.2 mL/min，高纯氮气。
1.3 GPC条件
GPC柱填料为BioBeads S- X3 200～400目，规格（200 mm×22 mm i.d.），流动相乙酸乙酯/环己烷（1∶1，v/v）， 进样量 5 mL， 流速为5.0 mL/min， 样品收集时间9～16 min。
1.4 样品处理
准确量取大豆油样0.5 g（精确值0.1 mg）， 用乙酸乙酯/环己烷（1∶1，v/v）准确定容至10.0 mL，过Ф25 0.45 μm有机膜，漩涡混合2 min，按1.3条件对样品进行处理，将收集液在30 ℃下真空旋转蒸发至近干，再用乙酸乙酯/环己烷（1∶1，v/v）准确定容至2 mL。进样量1.0 μL。按照1.2条件进行气相色谱分析。
2 结果与分析
2.1 GPC净化条件优化
取TBHQ标准样品10 mL，按照1.3条件进行处理，收集9～16 min的流出液，然后在30 ℃下真空旋转蒸发，准确定容至2 mL，按照1.2条件使用气相色谱进行检测，标准品、空白样品加标气相色谱图见图1。
2.2 GPC收集时间的确定
以收集时间为横坐标，以色谱图峰面积为纵坐标绘制TBHQ随时间流出曲线图，具体见图2。可以看出，TBHQ集中在9～16 min流出，因此初步确定流出时间为9～16 min。
2.3 未知样品中TBHQ的含量测定
利用本方法对市售的8种样品进行检测，由分析结果可知，TBHQ均未检出。
2.4 方法的线性关系与检出限
按照3倍信噪比进行计算，方法的检出限约为4 mg/kg。对系列标准工作溶液按照上述色谱条件进样分析，以峰面积定量，从而得到标准溶液浓度与峰面积之间的线性回归方程：Y=2 472X+1.330，保留时间为12.035 min，相关系数R2=0.9 996。
2.5 方法的回收率
在空白大豆油样品中分别添加0.1、0.4、1.0 mg/mL的TBHQ标准溶液， 3次重复，按上述色谱条件进行检测，测定TBHQ的加标回收率分别为88.3%、92.6%、95.4%，相对标准偏差均小于4%，精密度良好，满足分析要求。
3 结论
应用凝胶渗透色谱（GPC）和气相色谱（GC）技术，建立了大豆油中抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）的分析方法。样品经GPC全自动凝胶净化定量浓缩联用仪净化，HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）色谱柱进行分离测定。 本方法的检出限为4 mg/kg。TBHQ在检测范围内具有良好的线性，在浓度1～1 000 mg/L范围内与峰面积呈线性相关，相关系数R2=0.999 6。加标油样的回收率在88.3%～95.4%之间，相对标准偏差（RSD）小于4%。该方法具有步骤简单、结果准确、灵敏度高等优点，适用于大豆油中抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）的检测[7-8]。
4 参考文献
[1] 许华，穆同娜，李伟.凝胶渗透色谱/气相色谱法测定食用油脂中抗氧化剂特丁基对苯二酚[J].食品科技，2007，35（6）：217.
[2] 余以港，黄伟，林华山.特丁基对苯二酚（TBHQ）应用与检测[J].粮食与油脂，2003 （3）：42- 43.
[3] 游飞明，翁其香.气相色谱法快速测定油脂及加工食品中的BHA、BHT、TBHQ[J]. 福建分析测试，2005，14（4）：2290-2292.
[4] 张淑玲，张志胜，邢晓慧.气相色谱法测定食品中的抗氧化剂BHA，BHT，THBQ[J].现代生物医学进展，2008，8（12）：2483-2484.
[5] 程航，郭肖媚，梁莹，等.气相色谱法测定饲料中的特丁基对苯二酚[J].饲料研究，2011（8）：48-49.
[6] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫局.食品中抗氧化剂丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）与特丁基对苯二酚（TBHQ）的测定：GB/T 23373―2009[S].北京：中国标准出版社，2009.
[7] 袁勇军，戚向阳，曹少谦，等.脉冲强光及抗氧化剂对大豆油过氧化的影响[J].核农学报，2011（5）：975-979.
关键词：凝胶渗透色谱（GPC）；食品安全；应用
中图分类号： TS213.4 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2017.15.053
随着我国经济的发展和生活水平不断提高，人们对于食品安全问题也日益重视。国家对食品安全检测工作也极为重视。食品安全检测工作最重要的就是样品前处理，样品前处理的好坏直接影响到检测结果的正确性。因此，在食品检测中使用正确的前处理方法，可以提高工作效率和检测结果的准确性。
凝胶渗透色谱是最近十几年迅速发展起来的一种样品前处理方法，因其对分子量大的杂质净化效率高，可重复使用，适用范围广，自动化程度高等特点，在食品检测中应用广泛。
凝胶渗透色谱基于体积排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的固定相，来分离分子质量不同的物质。凝胶渗透色谱还可以用于分析化学性质相同而体积不同的高分子同系物[1]。
1 凝胶渗透色谱（GPC）在食品检测中的应用研究新进展
1.1 GPC技术在食品检测中的应用研究新进展
GPC技术常用在食品检测中的样品净化，宋鑫等在检测螃蟹中19种有机氯农药残留时应用全自动GPC-SPE联合净化，样品用乙腈提取，凝胶渗透色谱和氨基固相萃取柱联合净化。用Bio-Beads S-X3凝胶为填料的净化柱，以环己烷―乙酸乙酯（1∶1）为流动相，泵流速为4.7 毫升/分钟，检测波长为254纳米。收集9.0分钟和15.5分钟的流出液，并转至SPE净化。在实验中，对经GPC净化的有机氯农药的收集时间进行了优化，在单独使用GPC时样品净化不完全，与SPE联合使用后净化效果和回收率较好[2]。马杰等建立在线凝胶渗透色谱――气相色谱质谱联用法测定蔬菜、水果中有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类农药，GPC 弥补了QuEChERS 方法净化干扰物质不彻底的问题， 从而降低分析背景， 改善峰形， 提高分析结果的准确性 [3]。黄武等在检测大豆中异丙甲草胺残留量时用在线凝胶渗透色谱法，进行前处理，简化了样品前处理过程，且对环境污染较少，具有高效、经济、快速及简便等优点，显著提高前处理效率，减少分析时间，提高农药残留分析的速度和灵敏度[4]。
1.2 GPC技术在食品检测研究中存在的问题
GPC技术在国外已经普遍应用于样品的前处理，但在我国应用领域较少。GPC作为食品检测中的一种全新的样品前处理技术，能分离大分子类干扰杂质，有效地将大分子类物质从复杂的基质中提取出来。GPC技术优势是可大大降低大分子基质干扰，自动化和标准化程度高，且可以自动浓缩和定容，减少了人工带来的误差，显著提高方法的精密度和重现性。
但GPC技术作为一种新兴技术，在实际应用中还存在一些问题，需要在今后的工作中解决。由于GPC柱子内径比较大，连续处理样品的能力较慢，所需要的溶剂量较大。又因为所收集的样品体积大，对于实验室的浓缩装置要求较高，这大大减慢了实验分析的速度。此外，由于不同物质分子大小、形状以及凝胶阻滞作用的差异，可能会导致样品分离不完全，较大分子量的物质会提前流出不被收集而影响回收率，一些小分子干扰物会夹杂在样品中而影响净化效果。
2 凝胶渗透色谱（GPC）条件的选择
利用GPC技术进行样品前处理时，所需选择及优化的条件主要是色谱柱的选择，流速的选取以及收集时间的选择，溶剂的选取等。孙磊丽等在测定甘草中16种农药残留时选用填料为中性、多孔的聚苯乙烯二乙烯基苯微球体的S-X3玻璃柱作为GPC净化柱，体积比为1∶1的乙酸乙酯―环己烷溶液作为流动相，流速为5毫升/分钟，前7 分钟收集1份样品，之后每1分钟收集1份样品，共收集28份样品溶液，分别进行质谱检测[5]。吕飞等在检测动物源性食品中17种农药残留时，在线凝胶渗透色谱：色谱柱为Shodex CL NpakEV-200 柱；流动相：丙酮―环己烷（ 3∶7，V/V） ，流速0. 1毫升/分钟，柱温40 ℃，进样量10微升，检测波长210纳米，农药残留组分在线收集时间段：4.35 ～ 6.35分钟[6]。
3 展望
凝胶渗透色谱技术作为一种前处理技术已经普遍应用于样品的净化，S着GPC技术的不断优化应用范围越来越大，国外已经研究出很多种成熟的GPC前处理方法。随着国际形势发展，我国也应该对GPC技术进行研究开发。目前有很多研究都将GPC技术与QuEchERS 前处理等联合使用，使得现在的前处理可以联合处理较为复杂的样品，提高了工作效率和准确度。现在的检测仪器的精密度较高，对样品处理较严格，GPC技术与其他前处理技术联合使用可以去除杂质的干扰，对于精密仪器是一种保护。如在线GPC与QuEchERS联合串联质谱检测可以去除样品里的干扰和基质效应，对样品分析更准确。因此，发展和研究凝胶渗透色谱技术在食品检测方面有广阔的发展前景。
参考文献
[1]栾玉静.凝胶渗透色谱在不同样本检验中的应用和进展[J].刑事技术，2014（04）：41-44.
[2]宋鑫，杭学宇，等.检测螃蟹中有机氯类农药残留的全自动GPC-SPE联合净化气相色谱法[J].职业与健康，2016，32（04）：483-486.
[3]马杰.QuEChERS前处理技术与在线凝胶渗透色谱――气相色谱质谱联用法测定蔬菜水果中20种农药残留[J].食品安全质量检测学报，2016，7（01）：21-26.
[4]黄武. 在线凝胶渗透色谱――气相色谱――质谱联用法检测大豆中异丙甲草胺残留量[J].食品安全导刊，2016，64（03）：126-128.
[5]孙磊丽.凝胶渗透色谱―― 气相色谱串联质谱法同时测定甘草中16 种农药残留[J].分析测试学报，2012，31（12）：136-143.
[6]吕飞.建立同时快速测定动物源性食品中17 种农药的在线凝胶渗透色谱――气相色谱――质谱联用法[J]. 中国食品卫生杂志，2016，28（01）：69-75.