中药秦艽和习用品中5种环烯醚萜类成分的HPLC含量测定

[摘要] 环烯醚萜类成分是中药秦艽的主要活性成分，其中马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、 龙胆苦苷、獐牙菜苷在秦艽药材中的含量相对较高且具有良好的药理活性。实验中建立了中药秦艽中5种环烯醚萜的含量测定方法：Shiseido SPOLAR C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.04%甲酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脱；体积流量0.8 mL・min-1；检测波长240 nm；柱温30 ℃；进样量5 μL。该方法分离度良好，标准曲线在线性范围内相关性良好，加样回收率均值在97.35%～106.2%。对8种39份秦艽药材进行含量测定，结果显示5种环烯醚萜类成分在8种秦艽类药材中均有分布。种内含量差异较大表明含量除了与物种有关外，与种质资源、环境和生长年限都密切相关。小秦艽中各组分的含量明显低于其他3种正品秦艽。

[关键词] 秦艽；HPLC；环烯醚萜

中药秦艽临床应用广泛，是治疗风湿关节痛、结核病潮热、黄疸等证的主药之一。2010年版《中国药典》收载了秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花艽G. straminea Maxim.、粗茎秦艽G. crassicaulis Duthie ex Burk.和小秦艽G. dahurica Fisch.的根入药。目前这4种秦艽野生资源均处于濒危状态[1]。同时龙胆科龙胆属秦艽组中多种植物的根在地方临床用药及民族药中被用做秦艽。秦艽药材中主要活性成分是环稀醚萜类化合物，其中龙胆苦苷和马钱苷酸在药材中含量较高[2-3]。2010年版《中国药典》将这2个化合物作为药材质量评价的指标性成分。现代药理学研究结果显示，除了龙胆苦苷和马钱苷酸，其他多种环烯醚萜成分均具有良好的药理活性。獐牙菜苦苷、獐牙菜苷以及6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷均对fMLP诱导产生的超氧化物的生成有抑制作用[4]。曹晓燕等建立了秦艽中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和马钱苷酸的含量测定方法，结果显示不同来源的6种秦艽药材（秦艽、粗茎秦艽、达乌里秦艽、麻花艽、管花秦艽G. siphonantha、黄管秦艽G. officinalis）中4种成分含量没有显著性差异而同种的不同器官中这4种成分的含量有显著性差异[5-6]。张明燕等[7]建立了UPLC测定秦艽中龙胆苦苷和马钱苷酸含量的方法。文献报道中均没有测定6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷的含量，习用品仅涉及秦艽组2种植物。考虑到报道中的这些不足，本研究建立了同时测定马钱苷酸、龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷5种环烯醚萜类成分的含量测定方法，并对中国药典收录的秦艽及同属近缘种（粗壮秦艽G. robusta、长梗秦艽G. waltonii、全萼秦艽G. lhassica和秦艽G. tibetica）8种39份样品的含量进行测定，为秦艽类药材的质量评价提供基础研究资料。

1 材料

Agilent高效液相色谱仪（Agilent 1260系列）、Sartorius BP211D型电子分析天平、KD-2500B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、Milli-Q纯水仪（美国Millipore 公司）、甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、乙腈（色谱纯，Fisher Scientific）、甲酸（色谱纯，Fisher Scientific）。龙胆苦苷gentiopicroside（纯度>98%，批号200712），购自上海中药标准化中心；马钱苷酸loganic acid（纯度>98%，批号20100915）、獐牙菜苦苷swertiamarin（纯度>98%，批号20110323）、獐牙菜苷sweroside （ 纯度>98%，批号20100520），均购自上海鼎睿化工有限公司；6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷6′-O-β-D-glucopyranosylgentiopicroside（纯度>98%，批号201211），购自北京德威钠生物技术有限公司。实验用秦艽药材共39批见表1。所有样品原植物采集后均由上海中医药大学中药学院赵志礼教授鉴定。其凭证标本保存于上海中医药大学中药学院药用植物标本室。用于建立含量测定方法的秦艽药材（SP1）购自安徽亳州药材市场，作者经形态、显微及化学鉴定为粗茎秦艽。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shiseido SPOLAR C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相为0.04%甲酸水（A）-乙腈（B），B为0～10 min（9%～11%），10～20 min（11%～12%），20～22 min（12%～12%）；体积流量0.8 mL・min-1；检测波长 240 nm；柱温 30 ℃；进样量 5 μL。在上述色谱条件下，各成分之间分离度良好，色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备 分别取对照品适量，精密称定，加水溶解，制成每1 mL含马钱苷酸 0.452 mg、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷0.196 mg、獐牙菜苦苷0.068 mg、龙胆苦苷 1.296 mg、獐牙菜苷0.041 8 mg的混合对照品溶液A。精密吸取混合对照品溶液A 2 mL定容至10 mL量瓶中，制备稀释后的混合对照品溶液B。

2.3 供试品溶液的制备 精密称定药材粉末约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇20 mL，称重，超声处理（功率120 W）30 min，取出，冷却后补重，摇匀，静置。经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.4 线性关系的考察 分别精密吸取对照品A溶液10，8，6，4，2 μL以及对照品B溶液10，8，6，4，2 μL注入液相色谱仪，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程分别为马钱苷酸y=4 622.8x+71.164，R2=0.999 6；6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷y=4 026x+29.97，R2=0.999 7；獐牙菜苦苷y=9 912.4x+25.208，R2=0.999 4；龙胆苦苷y=6 526.4x+308.11，R2=0.999 6；獐牙菜苷y=12 292x+12.137，R2=0.999 5。表明马钱苷酸在0.181～4.53 μg，6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷在0.078 3～1.96 μg，獐牙菜苦苷在0.027 4～0.684 μg，龙胆苦苷在0.518～13.0 μg，獐牙菜苷在0.016 7～0.418 μg线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液（SP1） 5 μL，连续进样5次，记录色谱峰的峰面积，结果马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷峰面积的RSD分别是1.6%，3.6%，2.6%，2.6%，4.3%。结果表示，仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液（SP1） 分别于0，4，12，24，72 h进样5次，记录色谱峰的峰面积，结果马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷峰面积的RSD分别是2.0%，2.0%，4.8%，0.76%，3.3%。结果表示，供试品溶液稳定性良好。

2.7 重复性试验 取药材粉末（SP1） 共5份，按供试品制备方法制备，分别进样后记录色谱峰的峰面积，结果马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷峰面积的RSD分别是2.1%，3.0%，3.4%，2.5%，4.1%。结果表示，本方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（SP1） 0.40 g共5份，分别加入适量对照品，按供试品溶液制备方法制备。精密吸取加样回收溶液5 μL，注入液相色谱仪，测定其含量。计算平均回收率，结果见表2。

2.9 样品的含量测定 取秦艽药材粉末，按照供试品制备方法进行制备。每个样品平行2份。精密吸取供试品溶液5 μL，注入色谱仪进行测定。使用外标法计算秦艽药材中5种环烯醚萜成分的含量，结果见表3。

3 讨论

本研究建立了秦艽及其地方习用品中5种环烯醚萜类成分的hplc含量测定方法，该方法分离度好，操作简单，结果准确，具有良好的重复性和稳定性。采用该方法对39批秦艽药材进行定量测定。

3.1 检测波长的确定 分别对5种环烯醚萜类化合物进行190～400 nm全波长扫描，结果显示马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆苦苷的最大吸收波长分别是240 nm；250，275 nm；250 nm ；240 nm；250，275 nm。为了兼顾5个成分的最大吸收，选用240 nm做为最终检测波长。

3.2 提取方法和色谱条件的优化 通过对提取方法（回流、超声、温浸）、提取溶剂（甲醇、水、95%乙醇）考察优化确定提取方法，通过对色谱系统（甲醇-水、乙腈-水）、酸水浓度及流动相梯度优化确定分离度较好的色谱条件。

3.3 不同来源的秦艽药材中5种环烯醚萜成分的含量比较 在8个不同来源的药材中，龙胆苦苷均为5种成分中含量最高的化合物。以17批不同产地的粗茎秦艽为例，龙胆苦苷含量为1.587～5.998 mg・g-1，龙胆苦苷占5种化合物质量分数总和的34%～72%，同时将龙胆苦苷与其他4种环烯醚萜类成分进行比较发现龙胆苦苷与马钱苷酸质量分数的比值为0.70～10.51；龙胆苦苷与6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷质量分数的比值为1.66～9.31；龙胆苦苷与獐牙菜苦苷质量分数的比值为7.65～72.16；龙胆苦苷与獐牙菜苷质量分数的比值为4.21～270.71。同样11批同一产地的麻花艽中龙胆苦苷含量为1.360～6.913 mg・g-1，龙胆苦苷占5种化合物质量分数总和的24%～69%，龙胆苦苷与马钱苷酸质量分数的比值为0.91～4.13；龙胆苦苷与6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷质量分数的比值为0.94～9.68；龙胆苦苷与獐牙菜苦苷质量分数的比值为1.38～13.17；龙胆苦苷与獐牙菜苷质量分数的比值为3.45～72.77。这些数值波动范围较大，提示5种成分含量除了与物种有关外，与生长环境、生长年限、种质资源等都具有密切关系。

与其他3种正品秦艽比较，达乌里秦艽5个成分的含量均值偏低。其中有2批药材不含有獐牙菜苦苷，5种成分总量以及龙胆苦苷和马钱苷酸总和都偏低。其他4种秦艽代用品的实验结果显示：粗壮秦艽、秦艽、长梗秦艽和全萼秦艽均具有这5种成分，粗壮秦艽、秦艽和长梗秦艽5种成分的含量测定结果均在药典规定的4种秦艽波动范围内，全萼秦艽含量测定结果偏低。结合已知文献报道[6]，目前龙胆属秦艽组下10种植物均含有这五种化学成分，为该组植物的共同化学模式研究提供基础资料。目前4种正品秦艽的野生资源量濒危，临床用药供不应求。粗壮秦艽等4个非药典品种主要分布在西南及西北部分地区，在、四川等地的资源量丰富。结合本实验的含量测定结果和资源分布情况，有必要深入对秦艽组多种植物的药理作用进行深入研究，最终确定合适的秦艽替代资源。

[参考文献]

[1] 周秀佳，徐宏发，顺庆生. 中药资源学[M].上海：上海科学技术文献出版社，2007：368.

[2] 王妍妍，赵志礼，吴靳荣，等. 粗茎秦艽药材HPLC指纹图谱研究[J]. 中草药，2009，40（1）：120.

[3] 吴靳荣，赵志礼，王妍妍，等. 云南丽江产粗茎秦艽栽培品种的品质评价[J]. 中成药，2010，32（2）：250.

[4] Wei S H，Cheng G，He W F，et al. Inhibitory effects of secoiridoids from the roots of Gentiana straminea on stimulus induced superoxide generation，phosphorylation and translocation of cytosolic compounds to plasma membrane in human neutrophils[J]. Phytother Res，2012，26（5）：168.

[5] 曹晓燕，王政军，王之. 4种秦艽属植物不同器官中4种环烯醚萜苷成分含量的比较分析[J].植物资源与环境学报，2012，21（1）：58.