高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素的含量

作者：陈云华,赵晓霞,王文全,段天璇

【摘要】 目的 建立同时测定甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法对甘草粉末的67%甲醇提取物进行分析。用c18反相色谱柱,1%磷酸水-乙腈梯度洗脱,对不同色谱峰分别采用248、276、360、370 nm紫外波长检测。结果 甘草酸的回归方程为y＝1×106x＋16 220,r2＝1；甘草苷的回归方程为y＝2×106x＋49 444,r2＝0.999 5；异甘草素的回归方程为y＝1×107x＋4.466 7,r2＝1。甘草酸、甘草苷和异甘草素的加样回收率分别为98.01%、102.63%、98.18%。结论 本方法准确、稳定、可靠,可用于甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素3种成分的同时测定。

【关键词】 甘草；甘草酸；甘草苷；异甘草素；高效液相色谱法；含量测定

abstract：objective to develop a hplc quantitatively test method of glycyrrhizin, liquiritin and isoliquritigenin simultaneously for licorice. methods the 67% methanol extracts of licorice powder were analyzed by reverse-phase hplc on an ods column, using a gradient elution with a mixture of 1% h3po4 and acetonitrile. the eluate was monitored by uv absorption at 248, 276, 360 and 370 nm. results the linear equation of glycyrrhizin was y＝1×106x＋16 220, r2＝1. the linear equation of liquiritin was y＝2×106x＋49 444, r2＝0.999 5. the linear equation of isoliquritigenin was y＝1×107x＋4.466 7, r2＝1. the recovery rate of glycyrrhizin, liquiritin and isoliquritigenin was 98.01%, 102.63% and 98.18% respectively. conclusion the method is accurate, stable amd reliable, and can be used to determine the three main chemical contents simultaneously.

key words：licorice；glycyrrhizin；liquiritin；isoliquritigenin；hplc；content determination

在甘草质量研究中,建立稳定可靠的甘草多种成分含量测定非常必要。甘草酸、甘草苷、异甘草素是甘草中代表性成分,甘草酸是皂苷类代表,甘草苷是黄酮类代表,而异甘草素是一种异黄酮类成分。我们此次在以往工作的基础上[1],完善了甘草含量测定方法,使其同时可以对甘草酸、甘草苷、异甘草素进行含量测定。

1 仪器与试药

agilent 1100型高效液相色谱仪(配有g1314a紫外检测器、1315b dad检测器、g1311a四元梯度泵、g1322a在线脱气装置、g1316a柱温箱)；agilent 1100化学工作站；sartorius bs110s 1/万、bp211d 1/(10万)电子分析天平；kl3120d超声清洗机。

甘草glycyrrhiza uralensis fisch. 3年生采自甘肃总寨,1～5年生采自内蒙古杭锦旗,由北京中医药大学王文全教

授鉴定。60 ℃干燥过夜并粉碎。甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品(批号分别为060520、061009、060801)由上海康九化工公司提供(供含量测定用)。乙腈为色谱纯；水为市售娃哈哈纯净水；甲醇、甲酸、磷酸、冰醋酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 检测波长的确定

分别称取甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品适量,分别加甲醇配制成每1 ml约含0.1 mg的对照品溶液。以甲醇为空白,在波长190～400 nm范围内扫描,结果甘草酸的最大吸收波长为248 nm和360 nm,甘草苷的最大吸收波长为276 nm,而异甘草素的最大吸收波长为370 nm。

2.2 色谱条件

色谱柱：agilent zorbax extend分析柱(4.6 mm×250 mm,

5 μm)；柱温：25 ℃；进行梯度洗脱,流动相a为1%磷酸水溶液,流动相b为乙腈；梯度程序、流速及检测波长变化见表1。进样量为10 μl。表1 流动相梯度条件及检测波长（略）

2.3 供试品溶液的制备

精密称取甘草粉末(过60目筛,60 ℃干燥12 h)0.1 g,置25 ml容量瓶中,加入20 ml 67%甲醇冷浸24 h,超声30 min,放至室温,加67%甲醇至刻度,摇匀,以0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液即得。

2.4 工作曲线

称取甘草苷对照品6.28 mg、甘草酸对照品5.99 mg,分别用甲醇定容于25 ml容量瓶中,作为甘草苷和甘草酸对照品储备液。另取异甘草素对照品4.35 mg,置25 ml容量瓶中,以甲醇溶解并稀释至刻度,再精密吸取0.4 ml置10 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得异甘草素储备液。分别精密吸取甘草苷储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml,甘草酸储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml,异甘草素储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml,置6个10 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,作为系列混合标准溶液。分别进样20 μl,记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积。以峰面积对进样量(μg)进行回归,得回归方程。甘草酸：y＝1×106x＋16 220,r2＝1；甘草苷：y＝2×106x＋49 444,r2＝0.999 5；异甘草素：y＝1×107x＋4.466 7,r2＝1。色谱图见图1。甘草苷、甘草酸、异甘草素色谱峰理论塔板数分别为4万、14万和21万。

2.5 精密度试验

取上述混合标准溶液,连续进样6次,结果甘草酸、甘草苷、异甘草素的峰面积rsd分别为0.65%、0.35%、0.40%,表明精密度符合要求。

2.6 稳定性试验

取甘肃总寨甘草样品1份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,室温放置并于0、2、4、6、8、10 h进样,记录色谱图,代表性色谱图如图2。故以甘草酸、甘草苷和异甘草素三者的峰面积计算10 h的稳定性。结果甘草酸、甘草苷、异甘草素峰面积rsd分别为0.29%、0.49%、0.85%,表明甘草供试品在10 h内稳定。

2.7 重复性试验

取甘肃总寨甘草样品6份,每份0.1 g,精密称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定,结果甘草酸、甘草苷和异甘草素的峰面积rsd分别为2.15%、2.10%、2.63%,表明本法重复性好。

2.8 加样回收率试验

称取甘草苷对照品适量,加甲醇制备成每1 ml含0.663 mg的对照品溶液；称取甘草酸对照品适量,加甲醇制备成每1 ml含0.611 5 mg的对照品溶液；取甘肃总寨甘草样品6份,每份0.05 g,精密称定,分别置6个25 ml容量瓶内,分别加入上述甘草苷对照品溶液2 ml、甘草酸对照品溶液4 ml、“2.3”项中的异甘草素储备液1 ml,再分别按照“2.3”项下方法制备得供试品溶液,依法试验,记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积,并计算加样回收率,结果加样回收率符合规定。结果见表2。表2 甘草酸、甘草苷、异甘草素的加样回收率试验结果(略)

2.9 样品测定

按上述色谱条件,依法测定了内蒙古杭锦旗1～5年生栽培甘草样本中甘草酸、甘草苷和异甘草素的含量,结果见表3。表3 杭锦旗栽培甘草不同年限3种成分的含量测定结果(略)

3 讨论

由以上试验结果可知,本法线性良好,精密度、稳定性好,重复性和加样回收符合规定,可以作为甘草中甘草苷、甘草酸和异甘草素同时测定的方法。

前期在提取溶剂的选择过程中考察过80%氨性甲醇、80%氨性甲醇提取并酸化后定容、80%甲醇(大部分测定甘草黄酮文献采用的提取溶剂)、67%甲醇[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)测定甘草酸的基本提取溶剂]、甲醇-0.2 mo1/l醋酸铵-冰醋酸(67∶33∶1)[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)测定甘草酸的提取溶剂]、70%乙醇[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)测定甘草苷的提取溶剂]、50%乙醇(日本、美国药典测定甘草酸的提取溶剂)。结果表明,除2种氨性甲醇系统外,5种溶剂对各共有成分提取效果近似,综合考虑甘草苷、甘草酸和几个主要共有成分,67%甲醇综合提取效果相对略好,且对甘草苷、甘草酸提取效果分别好于药典相应提取条件[2]。

以本法测定内蒙古杭锦旗甘草样品显示,不同年限甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素存在着一定的差异。

【参考文献】

[1] 段天璇,于密密,刘春生,等.hplc法同时测定甘草指纹图谱暨甘草苷、甘草酸含量[j].中成药,2006,28(2)：161－165.

[2] 闫永红.不同来源甘草的质量特征及评价研究[d].北京中医药大学博士研究生学位论文.北京.2006.22－47.