高效液相色谱法同时测定动物饲料中的4种雌激素

摘要：采用反相高效液相色谱法同时测定动物饲料中的4种雌激素（雌酮、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚）。检测条件为色谱柱Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇-水（60∶40，V/V），流速1 mL/min，检测波长279 nm，柱温25 ℃。结果表明，4种雌激素成分在0.02～200 μg/mL浓度范围内与其对应峰面积呈良好线性关系。样品平均加标回收率为92.4%～109.3%，RSD为2.4%～3.4%，饲料中4种雌激素的检出限为0.010～0.030 mg/kg。该法操作简便、灵敏度高，可同时检测动物饲料中4种雌激素含量。

关键词：高效液相色谱法；雌激素；动物饲料

中图分类号：O657.72 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）12-2907-02

Determination of Four Estrogens in Animal Feeds by HPLC

YU Xiao1，ZHAI Hai-yun1，LIN Hai-dan2，ZHAO Chun-hua1，LU Qi-wen1，PAN Yu-fang1

（1. Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006，China；

2. Guangdong Institute of Veterinary Drug and Feedstuffs Control， Guangzhou 510230，China）

Abstract： The simultaneous determination method of four estrogen （estrone， estriol， ethiny， diethylstilbestrol） in animal feeds were established by RP-HPLC with Kromasil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm） column at 25 ℃. The mobile phase consisted of methanol-water （60∶40，V/V）. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 279 nm. The results revealed that there were good linear responses in the range of 0.02～200 μg/mL of 4 estrogens， and LODs were 0.010～0.030 mg/kg. The average recoveries were 92.4%～109.3% with RSD of 2.4%～3.4%. Consequently， the method was simple， sensitive for quality control of these estrogens in animal feeds.

Key words： HPLC； estrogen； animal feeds

饲料安全是动物性食品安全的重要环节，近年来，由饲料安全问题引发的食品安全事件时有发生。在饲料和动物饮用水中非法添加的雌激素能促进机体的代谢、生长、发育和繁殖。雌激素在动物体内一般难以降解，人食用后可在人体内（主要是内脏、血液中）积累，扰乱内源雌激素的正常作用，诱发癌症、早熟、女性男性化和男性女性化等症状，其毒性还可通过母体胎盘和母乳传给后代，对人类健康危害极大[1]。我国农业部176号文件明确禁止在动物饲料和饮用水中添加雌激素。目前激素分析技术主要包括气相色谱-质谱联用法[2]、高效液相色谱法[3，4]、液相色谱-质谱联用法[5，6]等。本试验建立了高效液相色谱同时测定动物饲料中4种雌激素（雌酮、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚）的方法，该方法将为动物饲料中上述4种雌激素的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

市售鸡、猪、虾、鱼配合饲料。

1.2 试剂与仪器

色谱纯甲醇，购于Dima公司；去离子水；其余试剂均为分析纯。雌三醇对照品（批号100935-200701）、炔雌醇对照品（批号100052-200308）、雌酮对照品（批号100849-200501）、己烯雌酚对照品（批号100033-200607）均购于中国药品生物制品检定所。

高效液相色谱仪（LC-10ATvp型输液泵，SCL-10Avp型控制器，二极管阵列检测器，LC Solution色谱工作站，日本岛津）、超声仪（昆山市超声仪器有限公司）、离心机（巩义市予华仪器有限公司）、数控恒温水浴锅（北京康林科技有限责任公司）、电子分析天平、0.45 μm微孔滤膜及配套注射器。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇-水（60∶40，V/V），流速：1 mL/min，柱温：25 ℃，检测波长：279 nm，进样量：20 μL。样品测定采用色谱峰的保留时间定性，并以紫外吸收光谱图辅助定性，外标法峰面积定量。

1.3.2 对照品和供试品溶液的制备 分别称取雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚对照品各1 mg，用甲醇溶解并定容至1 mL，配成质量浓度为1 mg/mL的标准溶液。分别移取适量上述标准溶液到5 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成浓度为0.02～200 μg/mL的混合标准溶液。称取饲料样品1.000 g于10 mL离心管中，加入9 mL甲醇，超声波处理60 min，离心，移取上层清液至另一支10 mL离心管，氮气吹干；加入4 mL甲醇，超声波溶解5 min后转至5 mL离心管，并用1 mL甲醇洗涤原离心管，合并于5 mL离心管中，氮气吹干；加1 mL甲醇超声波溶解残渣5 min，溶液经 0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液待测。

2 结果与分析

2.1 色谱条件

在上述色谱条件下4种对照品的色谱图见图1。

2.2 方法评价

2.2.1 线性关系及检出限 在设定色谱条件下，标准工作液的浓度为0.02～200 μg/mL，分别取20 μL进行HPLC分析。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明4种雌激素均在0.02～200 μg/mL范围内波度与峰面积线性关系良好，相关系数大于0.999 9，各标准品的线性回归方程和检出限（s/n=3）如表1所示。

2.2.2 精密度试验 用浓度为10 μg/mL的混合标准溶液重复进样6次，分别测定4种雌激素的峰面积，并计算出相对标准偏差为2.1%～3.3%。

2.2.3 加标回收率试验 准确称取不同种类的不含雌激素的饲料样品1.000 g，平行6份，分别添加适量混合标准溶液，充分混匀后按照“1.3.2”制备供试品溶液，按色谱条件测定，结果见表2。雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚的平均加标回收率分别为92.4%～99.3%、102.8%～109.3%、90.5%～95.7%和100.6%～107.8%，平均RSD分别为3.0%、2.7%、2.4和3.4%。

2.3 样品分析

按本方法对市售动物饲料样品进行测定，色谱图见图2。以保留时间和检出峰的光谱图定性分析，外标法定量。结果表明，鸡、猪、虾和鱼配合饲料中均检出含有雌三醇，含量分别为1.11、1.87、0.919和3.13 mg/kg，但未检出雌酮、炔雌醇和己烯雌酚。另外，从图2可见，样品经前处理后，各饲料基质对雌激素的检出无干扰。

3 小结

在预试验中比较了不同配比甲醇-水、乙腈-水流动相体系对各雌激素分离以及饲料基质干扰的影响，结果表明，在60∶40体积比的甲醇-水流动相条件下，4种雌激素分离良好，饲料中基质成分不干扰测定。采用二极管阵列紫外检测器对物质进行检测，可通过保留时间和检出峰的光谱图进行雌激素的定性分析，避免了普通紫外检测器的假阳性结果。由于本试验所用的几种动物饲料中均检出雌三醇，故提示相关部门应加强相关食用动物饲料中相关雌激素的管理和监督。

参考文献：

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[2] 曾东平，林翠萍，曾振灵，等. 气相色谱-质谱法检测猪肌肉中8种性激素的残留[J]. 动物毒物学，2008，41（9）：2776-2782.

[3] 刘红菊，闫 冲，刘宏果. 反相高效液相色谱法同时测定饲料中的10种性激素[J].中国饲料，2010（18）：34-36.

[4] 张建勋，田 颖，李雪兰，等. 高效液相色谱法测定饲料中雌二醇含量的方法研究[J].饲料工业，2005，26（13）：47-48.

[5] 丛培福，柯润辉，程劲松.超高压液相色谱一串联质谱法测定乳制品中性激素类兴奋剂多残留的研究[J].食品安全质量检测学报，2010，27（1）：36-42.

[6] 张 毅，蓝 芳，张 峰，等. 液相色谱-串联质谱法测定谷物类饲料中的41种激素[J].色谱，2011，29（6）：523-534.