细胞自噬与病毒感染综述

细胞自噬是真核生物通过分解代谢维持细胞自稳态的一种生命现象。早在二十世纪六十年代，Ashford和Porter利用透射电镜观察到细胞内存在“自食(self-eating)”现象(AshfordandPorter,1962)，随后，ChristiandeDuve正式将这种现象定义为自噬(Autophagy)(DeDuveandWattiaux,1966)。之后的一系列研究证实自噬与肿瘤、神经退行性疾病、病原体感染等方面密切相关。过去的十几年里自噬领域已成为科研工作者关注的对象，尤其自2007年第一届国际性自噬会议召开以来，自噬成为继凋亡之后当前生命科学研究热点。病毒的存活和增殖是通过侵染宿主细胞来实现的。伴随着病毒的介入，细胞自然会产生一系列应答反应。而自噬作为“细胞的管家”、“机体的卫士”，必然会通过某些途径来抵御病毒的侵袭。因此阐明细胞自噬与病毒之间的关系，对采用干预自噬途径控制病毒性疾病的发生具有重要意义。本文概述了自噬的基本概念与研究方法，并从细胞自噬清除病毒与病毒利用自噬促进自身复制两个方面总结了自噬与病毒之间的关系，以期为抗病毒研究提供参考。

1细胞自噬概论

1.1自噬的定义和类型

自噬是一种在真核生物中普遍存在、进化高度保守的适用机制。该机制是通过双层膜囊泡将受损的细胞器、错误折叠的蛋白以及侵入胞内的病原体包裹，然后运送到溶酶体(动物)或液泡(植物和酵母)中进行降解，降解所产生的物质和能量可供细胞循环利用。根据该过程中双层膜来源以及运送渠道不同，可将自噬分为大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperonemediatedautophagy)3种类型(Münz,2009;JinandKlionsky,2014)。其中对大自噬的研究最为广泛，通常所说的自噬即指大自噬。小自噬过程基本与大自噬类似，但其双层膜由溶酶体膜内陷而来；目前只在哺乳动物细胞中发现存在分子伴侣介导的自噬，这类自噬是通过分子伴侣识别胞浆蛋白的特定氨基酸序列，再与溶酶体膜上的受体结合进而介导底物的降解(LevineandKroemer,2008;JordanandRandall,2012)。

1.2自噬的诱因、过程和机理

正常情况下，细胞保持较低水平的自噬以维持内环境稳定。当某些应激条件出现时，如病毒感染，自噬水平可能会迅速升高以清除或抑制病毒增殖，从而度过生存“危机”(孙英杰,2013;陈全刚,2013)。最初认为自噬发生是营养缺乏所致，因此被看作是细胞能量和代谢的感受器。然而，大量研究表明许多因素皆可诱发自噬：(1)细胞损伤信号，如活性氧(ROS)、神经酰胺、线粒体去极化和内质网应激等；(2)病原体侵染信号，如模式识别受体的激活和细胞因子的产生等(JordanandRandall,2012)。自噬发生过程可分为4个阶段：(1)起始：胞浆中形成一杯状的双层分隔膜，然后向两边延伸成扁平“碗”状，称为自噬前体(pre-autophagy)或自噬泡(phagophore)；(2)延伸：自噬前体把待降解的胞浆成分收入“碗”中，不断弯曲成密闭的球状，称为自噬体(autophagosome)；(3)成熟：自噬体形成后，可与细胞内吞噬泡、吞饮泡和内体融合，形成自噬内涵体(amphisome)；(4)降解：自噬体或自噬内涵体与细胞中的溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，降解底物的同时释放物质和能量供细胞循环利用(FaderandColombo,2009)。一系列自噬相关基因(autophagy-relatedgenes,Atg)构成了自噬过程的调控网络。第一个自噬基因(Atg1)在酵母中发现(Matsuuraetal.,1997)，其在哺乳动物中的同源蛋白为ULK1，目前已经有三十多个Atg被克隆(Klionskyetal.,2011)，这些基因在自噬过程中发挥着各自的作用。其中Atg1、Atg13和Atg17构成了ULK1复合物，是自噬发生的正调控因子(唐海双等,2015)。正常情况下，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白与ULK1复合物结合，抑制自噬。在饥饿或其他诱发因子存在时，mTORC1从该复合物上脱离，启动自噬发生。Beclin1(与酵母Atg6同源)复合物由膜泡分拣蛋白34(vacuolarproteinsorting34,VPS34)、p150、Beclin1(VPS30)和ATG14组成，是III型磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)复合体的支架蛋白。ULK复合物和PI3K复合物靶向募集到自噬体起始部位后，分别产生自噬体特异性的磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns(3)P)池，招募Atg10、Atg7、Atg3、Atg8/LC3、Atg4和Atg12-Atg5-Atg16L1等蛋白参与自噬体膜的延伸和成熟。最后，自噬体膜的受体多聚泛素结合蛋白p62/SQSTM1(p62)可与微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白结合在一起成为自噬降解的底物，进而清除线粒体、内质网等受损细胞器,释放出能量和营养物质供细胞再利用。

1.3自噬研究方法

研究自噬通常用一些诱导剂或抑制剂来处理细胞，常用的自噬诱导剂是雷帕霉素(rapamycin)，常用的自噬抑制剂有氯喹(CQ)、渥曼青霉素和3-甲基腺嘌呤(3-MA)等(张海亮和唐圣松,2014)。检测自噬可以通过透射电镜观察膜状结构的自噬泡、自噬体以及其他相关亚细胞结构。转染绿色荧光蛋白GFP和LC3融合质粒的细胞发生自噬时，LC3-I会与磷脂酰乙醇(PE)结合成脂酰化LC3-II，以点状聚集的形式定位在自噬泡的双层膜表面，可通过激光共聚焦显微镜观察其点状聚集而检测自噬的发生。LC3-II含量与自噬泡数量成正比，因此GFP-LC3融合表达载体可作为一种荧光报告系统来判断自噬发生情况。自噬过程中LC3由LC3-I向LC3-II转化，脂酰化LC3-II在聚丙烯酰氨凝胶中的泳动速度比LC3-I快，所以LC3蛋白的免疫印迹中会出现两条蛋白带：LC3-I(18kD)和LC3-II(16kD)，可通过LC3-II/LC3-I值对自噬进行定量检测(MizushimaandYoshimori,2007)。此外，p62作为自噬降解的底物，与自噬活性呈负相关，通过检测细胞内p62蛋白的表达情况可以得知自噬溶酶体溶解酶活性和自噬潮(autophagicflux)的强弱。

2细胞自噬清除病毒感染

一般情况下，细胞受到病毒侵染后，自噬水平会增强以抑制病毒增殖，保护细胞免于病原体的破坏。病毒入侵诱导自噬产生的方式大致可分为两种：(1)受体配体互作，包括膜表面受体和胞内的模式识别受体(PRRs)。膜表面受体CD46可与多种病毒结合产生诱导自噬的信号。例如Hela细胞被麻疹病毒(measlesvirus,MeV)侵染后，CD46识别病毒囊膜糖蛋白并借助骨架蛋白GOPC与Vps34/Beclin1复合物结合，即通过CD46-cyt-1/GOPC途径激活自噬(Joubertetal.,2009)；另外，胞内的模式识别受体如Toll样受体(TLRs)或RIG-I样受体(RLRs)可识别病毒的病原相关分子模式(PAMP)，通过先天性免疫受体诱导自噬。(2)胞内压力的产生，包括内质网应激以及ROS水平上调等。病毒感染后，细胞不能迅速将大量病毒编码的蛋白在内质网内翻译修饰并正确折叠，造成这些蛋白在内质网堆积，引起细胞的未折叠反应，导致内质网应激(Qinetal.,2010)。在丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)以及登革热病毒(denguevirus,DNV)的感染过程中，病毒都是通过这种蛋白蓄积的方式诱导自噬产生(Siretal.,2008;McLeanetal.,2011)。此外，体内的ROS水平上调也会刺激细胞发生自噬(Lietal.,2015)。病毒能够诱导自噬的发生，从宿主细胞的生存角度来说，自噬机制无疑是要清除病原体。研究表明自噬不仅能够将病毒核酸转运到胞内感受器激活固有免疫，也可以将病毒抗原呈递给主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)激活适应性免疫；还可以直接将入侵的病毒运送到溶酶体中，以异源吞噬(xenophagy)的方式进行降解。

2.1自噬参与先天性免疫抵抗病毒感染

PRRs能与配体作用诱导自噬，相应地，自噬的产生有助于激活天然免疫发挥抗病毒作用。Liang等首次发现自噬具有抗辛德毕斯病毒(sindbisvirus,SV)的作用(Liangetal.,1998)。对果蝇的ATG1、ATG5进行RNA干扰会导致水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)大量增殖，其包膜蛋白G蛋白能有效地诱导自噬产生，意味着该蛋白可能通过某一受体结合，引发机体的天然免疫，这些结果说明自噬能够抵抗VSV的侵袭(Shellyetal.,2009)。病毒感染时，其核酸可被胞质和内体中的免疫感应器识别，其中内体中的感受器包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9等，分别识别双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)、单链RNA(single-strandRNA,ssRNA)、CpGDNA等；胞质中的免疫感应器(如DNA感应器)可识别视黄酸诱导基因1样RNA解旋酶受体(retinoicacid-induciblegene-IlikeRNAhelicasereceptors,RLR)、双链RNA依赖性蛋白激酶R(dsRNA-dependentproteinkinaseR,PKR)、核苷酸寡聚和结合结构域样受体(nucleotideoligomerizationandbindingdomainlikereceptor,NLR)以及环一磷酸鸟苷-磷酸腺苷合成酶(cyclicGMP-AMPsynthetase,cGAS)等。另外，TLRs在调节抗病毒免疫方面具有重要作用。浆细胞样树突状细胞(plasmacytoiddendriticcells,pDCs)通过TLR7识别ssRNA病毒，而TLR7位于内体膜上，自噬可将病毒核酸复制的中间体运送至内体中供TLR7识别；而且TLR7分泌IFNα也依赖于自噬过程(Leeetal.,2007)。

2.2自噬参与获得性免疫抵抗病毒的感染

除了参与天然免疫外，自噬还可以通过影响MHCI和MHCII类分子的抗原递呈参与获得性免疫。早期研究提出自噬过程有利于MHCII类分子的抗原递呈。通过药物抑制溶酶体的酸化或通过RNAi沉默Atg12可以阻断人类疱疹病毒核抗原A(epstein-barrvirusnuclearantigen1,EBNA1)经MHCII类分子递呈，抑制自噬降低了EBNA1特异性CD4+T细胞对抗原的识别(Paludanetal.,2005)。除了CD4+T细胞之外，抗病毒免疫反应还依赖于树突状细胞活化的CD8+T细胞(cytotoxicTlymphogytes,CTL)，而MHCⅠ类分子对病毒抗原的有效递呈是启动CTL反应的前提。HSV-1感染时，自噬有助于内源性病毒蛋白递呈给MHCI类分子(Englishetal.,2009)。此外，异源吞噬在抵抗SV、HSV-1等病毒的感染过程中发挥重要作用(LevineandDeretic,2007)。ATG5可以保护鼠中枢神经系统不受SV病毒侵害，ATG5功能的缺失则导致病毒蛋白清除延迟、p62接头蛋白堆积以及神经元细胞死亡。此外，敲除p62基因使病毒衣壳蛋白不能在自噬体中降解，增加病毒衣壳蛋白的聚集，促使细胞死亡。因此，可认为p62接头蛋白介导的自噬能够清除病毒蛋白，保护细胞免受破坏(Orvedahletal.,2010)。

3病毒劫持细胞自噬利于自身增殖

3.1病毒阻碍自噬的启动

病毒之所以能在宿主体内潜伏和增殖，是因为病毒在与其宿主长期共同进化过程中，发展了多种对抗宿主免疫系统的机制，完成自身的生命周期。研究表明不同的病毒可能在不同阶段劫持自噬破坏其抗病毒作用，而且病毒劫持自噬的途径并不唯一。单纯疱疹病毒1型(herpessimplesvirustype1,HSV-1)的神经毒性蛋白ICP34.5能结合Beclin1而阻碍自噬的发生，其突变体的ICP34.5蛋白缺乏与Beclin1结合的结构域而不能抑制神经细胞的自噬活性(Orvedahletal.,2007)；除以Beclin1为靶点外，HSV-1的ICP34.5蛋白还能通过招募PP1α使PKR下游蛋白eIF2α去磷酸化抑制自噬体的形成。人疱疹病毒(humanherpesvirus,HHV)可以通过抑制自噬的上游激活信号通路、影响自噬相关蛋白的功能、干扰自噬的调节机制以及抑制自噬相关的免疫应答等方式来破坏自噬、阻滞自噬的清除作用(黄媛等,2014)。

3.2病毒利用自噬囊泡作为病毒加工工厂

研究证实有些病毒能够利用自噬体作为自身复制的平台，甚至借助自噬完成病毒粒子的包装和释放(李红圆,2013;王安娜等,2015;Jackson,2015)。某些在胞浆内复制的病毒可将自噬泡作为附着场所(Münz,2011;ItakuraandMizushima,2009;Wangetal.,2014)，自噬泡为这些病毒的增殖提供了一个有利环境。人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染早期出现了核衣壳蛋白与LC3-II共定位的现象，脑心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus,EMCV)感染宿主细胞后也发现病毒3A和VP1蛋白与LC3的共定位的现象，这些现象说明自噬小体中有病毒复制复合物的存在(Zhangetal.,2011)。此外，自噬在许多病毒晚期复制过程中至关重要。HIV病毒表面的Gag蛋白能与LC3-II互作促进Gagp24亚单位的加工，利于病毒粒子的成熟和包装；而且HIV的负调控因子(negtivefactor,Nef)蛋白与Beclin1结合，通过抑制自噬体的酸化使病毒粒子免受溶酶体降解，从而促进成熟病毒粒子的释放(Kyeietal.,2009)。人巨细胞病毒(HCMV)感染早期促进自噬，在感染的后期阻断自噬，mTOR通路参与其中(Chaumorceletal.,2008;赵俊,2014)。在新城疫病毒(NDV)感染人宫颈癌细胞(Hela)和人胚肾细胞(HEK)实验中发现使用RNAi干扰分别沉默Atg5和Beclin1后，病毒滴度显著下降(孙英杰,2013)。鲑传染性贫血病毒(infectioussalmonanemiavirus,ISAV)感染大西洋鲑鱼细胞后，电镜下观察到自噬体的出现，转染GFP-LC3融合质粒的细胞发生了LC3的再分布，用抑制自噬体形成的3-MA处理细胞后LC3-GFP的点状聚集以及病毒的滴度均有下降，表明自噬参与了ISAV的感染和复制(Schitzetal.,2010)。鲤春病毒血症病毒(springviremiaofcarpvirus,SVCV)感染鲤上皮瘤细胞(EPC)也可以诱导自噬发生，利用Rapamycin诱导自噬可以促进病毒增殖，3-MA抑制自噬可以抑制病毒增殖，并且通过干扰自噬特异性基因LC3和Beclin-1证实细胞自噬对SVCV复制及病毒粒子的释放具有促进作用(柳力月,2014;Liuetal.,2015)。

4总结及展望

最初认为自噬主要功能是应答饥饿。目前已证实其具有多方面的功能。自噬不仅可以感受到能量匮乏，也具有持家本领，能够及时降解对细胞有害或无用的蛋白、核酸等物质，分解产物以及分解代谢产生的ATP又可以供细胞循环利用。自噬对衰老、肿瘤和传染病等的发生有重要影响，在肿瘤学领域对自噬的研究是当前的一大热点，自噬通路中mTOR、Beclin1对肿瘤细胞的生长和恶化密切相关(王远航等,2015)。除此之外，自噬在病原体感染中的作用也不容忽视，自噬可以激活天然免疫和获得性免疫进而抵抗病原体的感染。随着研究的深入，细胞噬与病毒感染之间的相互关系也逐渐被阐明。自噬作为机体的防御机制，积极抵抗病毒的侵袭；而病毒则进化出抵抗或逃逸宿主细胞自噬的策略，甚至能够劫持自噬为己所用，促进自身的复制、成熟和释放。因此，在病毒感染过程中,通过干预宿主细胞自噬信号通路可以影响病毒的复制及其致病性。目前对于自噬与病毒关系的研究已在高等动物中取得了较大进展。然而对自噬起源、信号转导及其对细胞生存影响等有待进一步研究。自噬发生机制也有待进一步阐明，如自噬泡膜的来源、自噬前体的生长和闭合以及自噬泡与溶酶体的融合机制等仍未解析清楚(唐海双等,2015)。细胞在营养缺乏时，胞浆中会产生大量的自噬体膜，这些自噬体膜在细胞的某种机制下会聚集成自噬体，但对于自噬体膜的起源和形成机制仍未诠释清楚。目前比较一致的观点是在哺乳动物细胞中，自噬体膜主要来源于内质网，也有一些证据表明高尔基体、质膜和线粒体在自噬体膜形成初期也发挥着重要作用。对于单个自噬体来说，它的膜来源可能不是唯一的，而是由几种细胞器各自提供一部分(李文等,2014)。细胞自噬是一个多步骤、复杂的过程，在不同细胞、不同病毒感染、不同状态下存在着不同的信号通路和生物功能。随着对病毒与自噬相互作用研究的深入，这些机理将逐步得以阐释，为开发新型有效的抗病毒药物和治疗方法最终控制病毒性疾病提供契机。因此，研究自噬与病毒感染之间的作用关系，不仅具有生物学和医学方面的理论意义，同时对促进人和动物健康具有十分重要的实践价值。

作者：李趁 付小哲 李宁求 林强 单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所 农业部渔用药物创制重点实验室 广东省水产动物免疫技术重点实验 上海海洋大学水产与生命学院