组织工程室内带血管蒂的脂肪瓣自发生长的研究

[摘要]目的:初步探索组织工程室在兔体内脂肪组织工程中的应用;建立研究兔体内脂肪组织自发生长的动物模型。方法:制作中空的表面带孔的硅胶组织工程室;将兔体内以腹壁下浅动脉为蒂的脂肪瓣转移至中空的硅胶组织工程室后6周取材。结果:硅胶组织工程室能很好的支持室内脂肪瓣的生长;所有组织工程室内内容物体积增大,脂肪瓣外面形成一层结缔组织构成的包膜,包膜穿过组织工程室表面的孔与室外包膜交通。室内内容物体积从(0.5225±0.031)ml增加到(3.7625±0.106)ml,包膜体积大小为(0.7525±0.04)ml,脂肪瓣的体积从(0.5225±0.031)ml增加到(3.01±0.135)ml,增加了476%。结论:硅胶制作的组织工程室能应用到体内脂肪组织工程,且为室内组织提供空间生长;成功构建了兔体内组织工程室内脂肪组织自发生长的模型,带蒂的脂肪组织可以在不添加任何细胞,生长因子的情况下自发生长。

[关键词]组织工程室;脂肪瓣;脂肪组织工程;兔

[中图分类号]R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)04-0518-03

Study of spontaneous adipose tissue generation of vascularized pedicled fat flap inside tissue engineering chamber

HAO Xiao-yan, YI Cheng-gang, MENG Bao-xi, LIU Bei, FU Su, XIA Wei, GUO Shu-zhong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the application of tissue engineering chamber in in vivo adipose tissue engineering, to establish a model of spontaneous generation of new adipose tissue from an existing fat flap.MethodsA defined volume of fat flap based on the superficial inferior epigastric vascular pedicle was elevated and inset into a hollow silicon chamber implanted subcutaneously in the groin of the rabbit. The contents were analyzed after being in situ for 6 weeks.ResultsThe total volume of construct in all tissue engineering chambers increased significantly, from0.5225±0.031ml baseline compared to (3.7625±0.106)ml. The volume of the fat flap which included the adipocyte and blood vessels volume increased from (0.5225±0.031)mlat insertion to (3.01±0.135)ml(476% increase) in the perforated silicon chambers. Histomorphometric analysis rather than simple hypertrophy documented an increased number of adipocytes. The new tissue was highly vascularized and no fat necrosis or atypical changes were observed.ConclusionA novel method of spontaneous generation of new adipose tissue from an existing fat flap in rabbit is established. Tissue growth is spontaneous and needs no additional cells, growth or differentiation factors, or extracellular matrices.

Key words: tissue engineering chamber; fat flap; adipose tissue engineering; rabbit

体外组织工程产品因为没有自身的血管供应营养物质,大大限制了组织工程产品向三维立体结构的进一步发展。在目前不能构建出组织工程血管的情况下,利用在体血管是一条可行的研究途径。澳大利亚一研究小组把在体血管放入生物惰性材料制作的有一定硬度的组织工程室(tissue engineering chamber),为培养组织提供血管基础、营养物质和生长所需空间[1],这称作血管化的组织工程室(vascularized tissue engineering chamber)。基于这一方法进行体内脂肪组织工程的研究目前国外只有少数几个实验室在开展,国内仍处于起步阶段。在此实验中,我们拟制备能应用到兔体内的组织工程室,利用腹壁下浅动脉为蒂的脂肪瓣,建立一个研究较大体积脂肪组织在体内自发生长的动物模型,为下一步研究和后期应用到临床奠定基础。

1材料和方法

1.1 实验动物和主要仪器:健康6月龄新西兰大白兔8只,2.5～2.8kg, 雌雄不限,由第四军医大学实验动物中心提供。HE切片用荧光显微镜(Nikon)观察并摄像。

1.2 组织工程室的制作:组织工程室由医用硅胶制作而成,有一定的硬度,外观呈椭圆球形,由上下两半球体组成。半球内径约3.7cm,顶点距中心点约7mm。整个组织工程室内容积10ml。组织工程室表面均匀分布直径约3mm的孔(图1)。组织工程室一半球侧边有约5mm的通道,为脂肪瓣血管蒂的通道。两半球体接触部位有约5mm的缘,方便在实验过程中脂肪瓣转移到组织工程室后用缝线缝合成一室性结构。

1.3 实验设计:①对照组:切取兔一侧以腹壁下浅动脉为蒂的脂肪瓣,腹壁下浅动脉从股动脉发出分支到穿入脂肪时血管蒂长约2cm,脂肪瓣的大小约4cm×1cm,切去皮瓣后测量皮瓣的体积(n=8),此对照组表示实验组第0天脂肪瓣的体积大小,作为实验组中脂肪瓣体积大小变化的参照。实验组所有脂肪瓣的规格都按照这个标准(图2);②实验组:按照对照组设立的标准剥离出兔另一侧脂肪瓣后,把脂肪瓣转移到带孔的组织工程室(n=8),并与周围组织固定。

1.4 手术过程:所有手术均在无菌条件下进行,3%戊巴比妥钠1ml/kg,耳缘静脉注射麻醉。动物仰卧位,剃毛,消毒。在耻骨联合上2cm做切口,切口长约5cm,按血管蒂长2cm,脂肪瓣4cm×1cm的大小剥离双侧脂肪瓣。直接切取一侧脂肪瓣测量体积,把另外一侧脂肪瓣通过室一侧的通道转移入带孔的组织工程室,确定组织工程室的位置,保证血管蒂部不受牵拉,后用不可吸收线把半球底部与下面的肌肉组织缝合固定,防止脱落,两侧边也固定在肌肉组织上,防止旋转。缝合上下两个半球缘部,上半球固定于表面皮肤。所有脂肪瓣中大血管结扎止血,小的电凝止血。最后用3-0的丝线缝合皮肤切口。所有实验动物对手术耐受良好。

1.5 取材:6周后,再次麻醉兔子,切口方向同术前,打开双侧腹股沟区,肉眼判断腹壁下浅动脉是否通畅。在切取室内内容物的过程中明显看到血液外流,并进一步用钳夹测试血流。切取组织工程室内内容物后测量体积,并进行组织形态学分析。

1.6 分析方法:取材时大体观察;对照组和实验组均采用液体容积法测量体积;组织学观察:组织块用10%的福尔马林固定,后用HE染色分析。

1.7 统计学方法:采用SPSS13.0统计软件分析。对照组和实验组脂肪瓣的体积大小采用配对样本t检验,P

2结果

2.1 大体形态观察和皮瓣体积:术后6周取材时,所有组织工程室外形成一层血管化的包膜,切开包膜后看到有淡黄色的组织液流出。观察组织工程室室内容物没有明显的炎症和组织坏死。脂肪瓣外包绕着结缔组织构成的包膜,包膜较薄,触之柔软,且包膜通过室表面的孔径与室外面的血管化的包膜交通(图3)。包膜掀开后见脂肪瓣存活情况良好,血运良好。所有组织工程室内内容物的体积均增大,体积(0.5225±0.031)ml增加到(3.7625±0.106)ml。脂肪瓣外面结缔组织构成的包膜体积(0.7525±0.04)ml,包膜占整个组织工程室内内容物体积的20%。去除薄膜后,脂肪瓣的体积从(0.5225±0.031)ml增加到(3.01±0.135)ml,增加了476%,与对照组相比两者之间的体积差异有统计学意义(P

2.2 组织学观察:对照组代表脂肪瓣插入组织工程室0天的情况,HE染色显示成熟的脂肪组织以及供应营养物质的血管和纤维间隔。6周后组织工程室内内容物包括有两种组织:结缔组织组成的包膜,以及包膜包绕的脂肪瓣(图4)。包膜主要是由纤维结缔组织构成,内有血管分布。脂肪瓣内脂肪组织的形态同正常的脂肪组织一样,被血管纤维间隔分隔成若干小叶。脂肪细胞大小正常,没有萎缩、肥大以及纤维化。在带孔的脂肪组织工程室内,结缔组织构成的包膜穿过孔与室外的包膜连接在一起。血管蒂和它发出的分支支持脂肪瓣的生长(图5)。脂肪瓣的远端依然也有血管供应营养物质(图7)。脂肪瓣内情况见图8。图4～8示6周后组织工程室内内容物的形态学观察结果。

3讨论

目前用于制作体内组织工程室的材料主要是硅胶和聚碳酸酯。早期体内组织工程研究用到的组织工程室并非严格意义上的“室”,而是由双层硅胶片重叠构成,之后演变成圆桶装的半封闭的室性结构,根据实验的要求室内容积大小可调整,室表面分为有孔和无孔两种类型。组织工程室要求有一定的硬度,在体内能为室内内容物提供生长的空间,同时构建出一个相对独立的环境。Cronin[2]通过比较两种材料得出:硅胶组织工程室在保持血管通畅、血管生成以及组织形成方面要优于聚碳酸酯组织工程室。在血管模型相同,支架材料相同时,随着时间的推移室内组织生成的多少与组织工程室体积大小相关。表面带孔的组织工程室能更好地促进室内脂肪组织的生长,而且表面带孔的组织工程室内内容物表面的结缔组织包膜要比薄于不带孔的组织工程室内内容物。我们实验选用医用硅胶材料制作的中空表面带孔的组织工程室能满足进行兔体内脂肪组织工程研究的需要。Dolderer[3]报道在表面带孔的组织工程室内结缔组织构成的包膜占整个内容物的体积的53%,而我们的实验结果中结缔组织包膜占整个内容物体积的20%,这可能与我们的组织工程室表面的大孔径,高孔隙率相关,加大了室内外交通的结果。

Dolderer[3]在大鼠体内构建的以腹壁下浅动脉为蒂的脂肪瓣在组织工程室内自发生长的模型,6周后脂肪瓣在表面有孔的组织工程室内内容物体积可从0.08ml增加到1.2ml。因为大鼠模型构建的脂肪组织体积太小,为了日后应用到临床,创建更大的动物模型就很必要。为此我们成功创建了兔体内以腹壁下浅动脉为蒂的脂肪瓣自发生长的动物模型。研究结果表明把较大体积的带血管蒂的脂肪瓣转移到组织工程室,脂肪瓣的体积也会增加。

此外,本实验结果表明,组织的生长完全是自发的,不需要添加任何细胞、生长因子以及细胞外基质。组织的生长完全依赖于其固有的血管蒂,且血管蒂能以出芽生长的方式形成更大的血管网络,进一步支持了脂肪细胞的增殖。关于脂肪组织自发生长的机制有学者认为是潜在的空间促进了血管的出芽生长,血管的出芽生长进一步支持了脂肪组织的生长。我们的研究结果也表明脂肪瓣的血管网络扩展,组织学观察发现脂肪瓣的远端依然有较好血循环系统,支持脂肪组织的生长。

乳腺癌术后再造是整形外科常规的手术之一,目前常用的方法是皮瓣转移或脂肪移植来进行修复[4]。皮瓣转移包括多种岛状皮瓣和游离皮瓣,但手术塑形困难,供皮的继发损伤较大。自体游离脂肪移植后吸收率高,且远期效果欠佳。而带血管蒂的脂肪瓣,因为其有固定血供,较游离脂肪移植修复具有一定的优势,但缺陷是供区有限,也容易导致供区的继发畸形[5]。通过本实验的方法,可以在体内由小到大构建出血管化的脂肪瓣,像皮肤扩张器一样先扩张后移植,避免传统的切除脂肪瓣后造成的继发供区畸形。

这个模型也可能具有支持其他组织、细胞生长的潜能,因为已经存在的带蒂的脂肪瓣可以提供血管化的基础以及内源性的生长因子。此外组织工程室的应用,不仅为室内组织提供了生长所需的空间,而且构建出的相对独立的空间便于实验的干预,局部应用一些生长因子或者诱导因子,加速室内组织的生长,又不影响全身的组织,这可能是未来利用组织工程室进行体内组织工程研究的重点。

[参考文献]

[1]Hofer SO,Knight KM,Cooper-White JJ,et al.Increasing the volume of vascularized tissue formation in engineered constructs: an experimental study in rats[J]. Plast Reconstr Surg, 2003,111(3):1186-1192.

[2]Cronin KJ,Messina A,Knight KR,et al.New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials[J]. Plast Reconstr Surg, 2004,113(1):260-269.

[3]Dolderer JH,Abberton KM,Thompson EW,et al.Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space[J]. Tissue Eng,2007,13(4):673-681.

[4]齐彦文,李建宁,李比.乳腺癌术后即刻重建的适应证及手术方法的选择[J].中国美容医学,2009,18(4):568-571.

[5]Benditte-Klepetko H,Sommer O,Steinbach R,et al.Clinical and ultrasound evaluation of donor site morbidity after tram-flap for breast reconstruction[J]. Microsurgery, 2004,24(3):174-181.

[收稿日期]2009-11-26 [修回日期]2010-02-23