广东凉茶对热休克大鼠肝组织HSP70基因表达的影响

摘 要：目的：通过观察广东凉茶对热休克大鼠肝组织hsp70基因表达的影响，探讨广东凉茶对热休克大鼠热保护作用机制。方法：将25只大鼠随机分组，分为正常对照组、热休克模型组、王老吉凉茶组、夏桑菊凉茶组、邓老凉茶组，每组5只。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对各组大鼠肝组织进行HSP70mRNA表达的检测，观察广东凉茶对大鼠肝脏HSP70mRNA表达的影响。结果：热休克模型组HSP70水平表达增高，与正常对照组相比，有显著性差异(P

关键词：广东凉茶；热休克蛋白70；基因表达

中图分类号：R285文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)05-1079-02

Effects of Herbal Tea of Guangdong on Expression of HSP70 in Liver Tissues of Heat Shock Rats

HU Chenxia 1,WANG Jingyuan 2,TANG Yuan2

（1.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong ,China;

2.Guangdong Experimental High School, Guangzhou 510055, Guangdong, China）

Abstract：Objective:To explore the mechanism of heat protection of Herbal Tea of Guangdong by observing their effects on expression of heat shock protein 70 (HSP70) in liver tissues of heat shock rats. Methods：Twenty-five rats were randomly devided into 5 groups:control group,models of heat shock-group,Wang LaoJi's herbal tea-group,Xiasangju herbal tea-group,Deng Lao's herbal tea-group.mRNA expression of HSP70 in the liver tissues of all the groups were detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and the effects of Herbal Tea of Guangdong were observed.Results：The expression of HSP70 in models of heat shock-group was higher than that in control group(P

Keywords:Herbal Tea of Guangdong;heat shock protein 70; gene expression

广东凉茶作为一种清凉饮料，已跻身于国内外饮料市场。目前已有上百个品种如王老吉凉茶、夏桑菊凉茶、邓老凉茶等。因其药性寒凉，功能清热降火，已成为夏季人们喜爱的清热解暑健康饮品[1]。现代研究表明，机体在高温、感染、创伤等多种有害因素刺激下均可引起一种热应激蛋白即热休克蛋白70（HSP70，heat shock protein70）的过量表达。本研究通过高温处理大鼠，制备热休克大鼠模型，观察广东凉茶对热休克处理大鼠肝组织HSP70基因表达水平的影响，探讨广东凉茶对热休克大鼠进行热保护作用的机理。

1 材料和方法

1.1 研究对象

Wistar雄性大鼠，25只，SPF级，体重150～200g，由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.2 材料

王老吉凉茶（广州王老吉药业公司，批号：20070609）；夏桑菊凉茶（广州星群药业公司，批号：20070615）；邓老凉茶（广州养和医药科技公司，批号：20070716）；Taq酶（美国ABI公司）；MMLV 逆转录酶（日本TakaRa公司）；DNTPs（美国promega公司）；Trizol试剂（Gibco公司）；DL2000 DNAMarker(日本TaKaRa公司)；引物由中山医科大学达安基因公司合成。

1.3 主要仪器

YB-IA真空恒温干燥箱（天津市光学仪器厂）；制冰机（日本SANYO公司）；低温冷冻离心机(Sigma公司)；DNA／RNA纯度检测仪 (美国Pharmacia 公司)；ABI9700 PCR扩增仪(美国ABI公司)；UV transilluminator（英国UVP公司）；法国VL凝胶成像及分析系统(VLBER LOURMAT)

1.4动物分组及处理

1.4.1实验动物 完全随机分组,分为正常对照组、热休克模型组、王老吉凉茶组、夏桑菊凉茶组、邓老凉茶组，每组5只。

1.4.2热休克模型的建立 采用经典方法,即用恒温干燥箱调至55℃,观察大鼠出现烦躁、毛发竖起,此时肛温约42℃,即出现热休克反应，维持10min。

1.4.3药物处理 凉茶组选用王老吉凉茶、夏桑菊凉茶、邓老凉茶液体饮料，热休克处理后分别立即灌胃2.5mL/100g体重，正常对照组、热休克模型组给予等量纯净水。4h后处死大鼠，将取下的新鲜肝组织用锡纸包裹，立即投入液氮中，-70℃冰箱中保存备用。

1.5RT-PCR反应

1.5.1总RNA提取及cDNA的合成 取标本组织100mg加入1mL Trizol试剂匀浆，按试剂说明书提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，其A260/A280比值在1．8～2．0之间。逆转录反应体系为21μL，总RNA5μL和OligodT(16T)1μL混匀后短暂离心，70℃预变性10min。冰浴5min，加入MMLV逆转录酶1μL、RNase0.5μL、10mmol／L dNTP 2μL和MMLV缓冲液4μL，37℃逆转录90min，94℃5min灭活逆转录酶，得到cDNA产物。

1.5.2PCR反应 HSP70上游引物：5'-ATCACCGTGCCCGCCTACTT-3’，下游引物：5'-CGGTTGTCGAAGTCCTCCCC-3’，扩增片段长度为277bp；β-actin上游引物：5’-ACCCCTCAACCCCAAAATCA-3’，下游引物为5’-AGGAAGGCTGGAAAATGGCTT-3’，扩增片段长度为473bp。PCR扩增反应条件：96℃ 11min，1个循环；96℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min结束反应。取逆转录后cDNA 5μL在100μL PCR体系中扩增，体系含10×PCR 缓冲液5μL、25mmol／L MgC12 2μL、10mmol／L dNTP 1μL、10pmol/μL，HSP70上下游引物各2.5μL,3pmol/μL，β-actin上下游引物各2.5μL,Taq酶0.5μL,轻质石蜡油 50μL，反应获得RT- PCR产物。

1.5.3RT－PCR产物半定量检测 取8μL扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，采用VL凝胶成像系统摄像，Labworks 4.6分析软件获得各电泳条带的光密度值，重复3次，取均值。以HSP70／β-actin光密度值反映HSP70mRNA的表达水平。

1.6 统计学处理

实验结果以均数±标准差(±s)表示，应用SPSS11．5软件进行数据分析，经方差齐性检验后，各组两两比较采用单因素方差分析。

2 结 果

从图1可以看出，HSP70在各组大鼠肝组织中均有不同程度表达。与正常对照组相比，热休克模型组HSP70水平表达增高，有显著性差异(P

3 讨 论

广东凉茶是颇具广东特色的夏季清凉饮料，目前，凉茶已入选国家级非物质文化遗产名录，得到世界范围内的保护，著名品牌有王老吉凉茶、夏桑菊凉茶、邓老凉茶、黄振龙凉茶等。如今的凉茶已从一种清热祛湿的治病药茶演变为倍受人们喜爱的清凉饮品。但凉茶实际并不是一种简单的清凉饮料，而是根据中医辨证原理、组方原则和药物功效形成的一种特殊饮品。有些品种的凉茶（如邓老凉茶），所含的中药成分偏重于治疗保健作用，甚至可以作为OTC药物使用。凉茶具有许多功效诸如清热泻火、祛湿解毒、宁心安神等，对于表现有热、火、湿、毒等证候的人群而言，凉茶就起治疗作用。由于凉茶介乎于药品和食品之间，安全性又好，因此越来越受到欢迎，凉茶的发展也就突飞猛进。与此相应，对凉茶的作用机理研究、凉茶的适应症和非适应症、凉茶是否具有副作用等问题也越来越引起关注。

现代研究表明，机体组织或细胞在环境温度升高等温热刺激下能够发生热休克反应，产生热应激蛋白――热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。其中，HSP70是一组重要的细胞保护蛋白，作为“分子伴侣”，参与新合成蛋白质的折叠、装配和运输，防止蛋白质变性和聚集，帮助损伤蛋白质的再折叠或降解等[2－3]。研究表明，机体经热应激处理后HSP70大量表达，其表达水平与热应激强度和持续时间有关[4－5]。本研究选取广东凉茶的著名品牌王老吉凉茶、夏桑菊凉茶、邓老凉茶，通过观察其对热应激处理大鼠体温改变及热应激诱导蛋白HSP70表达的影响，探讨广东凉茶进行热保护作用的机理，对于干预和提高机体对高温耐受的能力具有十分重要的价值。

本研究结果显示热休克模型组与正常对照组相比，HSP70表达增高，有显著性差异(P

参考文献

[1] 冼剑民,姚杭.浅析广东的凉茶文化及其流变［J］.饮食文化研究，2005,16(4):100-107.

[2] Gething MJ．Protein folding in the cell[J]．Nature，1992，355：33．

[3] Hightower LE.Heat shockstress proteins，chaperones，and proteotoxicity [J]．Cell，1991，66：191-197.

[4] 何建宏，李玉民，巩爱霞. 经高温处理后大鼠肝中热休克蛋白7O的表达［J］.中国普通外科杂志.2004,13(6):432.

[5] 郭玫，张顺利，张文学.热休克反应中小鼠心脏HSP70表达的免疫组织化学研究［J］.动物学杂志，2001,36(2):15-18.