纤维连接蛋白对皮肤鳞癌的影响

纤维连接蛋白(fibronectin,FN)是人骨髓长期培养体系LTBM细胞中分离出来的一种大分子多功能的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)糖蛋白，可以连接多种细胞、生长因子及其他ECM成分，可以吸引趋化巨噬细胞，发挥非特异性调理素作用，利于巨噬细胞(Mφ)、淋巴细胞(Lc)与癌细胞在局部发挥细胞毒效应。FN与细胞内肌动蛋白微丝空间关系存在一种“跨膜协同联系”(coordinated transmembrane association)，在转化细胞中发挥了与细胞运动功能有关的作用[1,2]。本文研究50例皮肤鳞癌(SSC)中癌细胞生物学行为及间质Mφ、Lc反应与癌中FN改变的关系。

1材料与方法

1.1材料50例SSC选于本院及周围市、县级医院1983年～1993年10年间保存完好的蜡块，男41例，女9例，平均年龄59.6岁，取10例乳腺癌切缘正常皮肤作为对照组。

1.2方法蜡块标本原经10％福尔马林固定24h，常规石蜡包埋，连续切片4μm厚，免疫组化LSAB(labelled streptravidin biotin)，使用抗体为FN(Sigma公司)1∶400，PCNA(Pc10)(Dako公司)1∶30，CD68(Dako公司)1∶50，LSAB试剂盒(Sigma公司)1∶400，DAB显色，FN染色以同一张切片中血管基底膜显色作为阳性对照，PCNA和CD68则用增殖性扁桃体炎切片作阳性对照。PBS代替第一抗体作阴性对照。

1.3判断标准按WHO分类将SSC分为Ⅰ～Ⅳ级，将癌组织生长方式分：A型，呈巢性膨胀性生长，此型具有器官样结构，间质与癌巢分界清楚；B型，细梁或细索状或单个细胞浸润于间质中[3]。PCNA阳性表达于癌细胞核内，褐色。CD68表达于癌间质中Mφ核内，有时也可见于胞浆中。观察5～10个高倍视野中，平均每个视野PCNA阳性细胞占癌实质和CD68阳性占癌间质50％为(＋＋＋)[4]。

1.4统计学处理用X2检验。

2结果

正常皮肤中FN存在于真皮和表皮连接处，皮肤附属器及细胞周围基底膜处，呈线状分布，在皮下胶原纤维束间分布呈短线状或颗粒状，皮下结缔组织中有少量CD68阳性Mφ和Lc，表皮基底层中见有PCNA阳性反应细胞。50例SSC患者，SSC生长方式：A型21例，B型29例；SSC分级：Ⅰ级18例，Ⅱ级23例，Ⅲ～Ⅳ级9例；SSC中PCNA阳性细胞：(＋)12例，(＋＋)23例，(＋＋＋)15例；间质Mφ浸润：(＋)11例，(＋＋)23例，(＋＋＋)16例；间质Lc浸润：(＋)15例，(＋＋)18例，(＋＋＋)17例。

SSC中FN、PCNA、CD68阳性细胞的分布：FN分布有3种形式：(1)细胞FN主要分布于癌细胞胞浆或胞膜上。分化好的SSC中FN常围绕单个癌细胞或出现于癌细胞胞浆中。(2)基膜FN：FN沿上皮基底膜分布呈连续线状或不连续间断，碎片状。(3)间质FN：FN广泛存在于癌血管间质中，主要表达在血管内皮细胞、纤维母细胞及在周围呈网格状分布。SSC中常表现为细胞FN、基膜FN同时消失，特别在分化差的癌细胞浸润前缘(B型)有较丰富而密集的间质FN，并与减少的基膜FN连续。所有癌组织中均可见到PCNA阳性细胞，但在癌巢边缘或分化较差的区域PCNA阳性细胞明显增多。所有癌巢间质中均可见到CD68阳性的Mφ，该细胞常沿着癌巢边缘排列，其后可见到大量Lc，癌巢内Mφ较少。在Mφ与癌细胞接触处，癌细胞疏松液化，伴有Lc浸润。癌巢周围血管中亦可见到CD68阳性的Mφ。

SSC生物学行为及间质Mφ、Lc反应与FN改变的关系：21例呈A型生长的SSC，66.7％(14/21)有细胞FN和不连续的基膜FN，29例B型生长中仅有31.03％(9/29)有细胞FN和基膜FN，两型比较差异显著(χ2=5.32,P0.05)。间质Mφ、Lc浸润(＋)时，细胞FN和基膜FN分别为27.27％(3/11)和26.67％(4/15)，(＋＋)时分别为43.48％(10/23)和44.44％(8/18)，(＋＋＋)时分别为62.50％(10/16)和64.70％(11/17)。间质FN的表达与SSC的生长方式、分级、增殖和间质Mφ、Lc浸润的各组间均未发现显著差异(P>0.05)。50例SSC中有3例发生局部淋巴结的转移，其原发灶中细胞FN、基膜FN均消失，表现为间质FN。

3讨论

FN作为一种多功能的蛋白，在细胞与细胞、细胞与基质间起桥连作用，维持细胞正常的形态与功能[1,2]，SSC中细胞FN和基膜FN的缺失导致癌细胞粘附性的下降，癌细胞可以逃脱周围的束缚，并通过破坏基膜发生SSC的浸润与转移，正如本文结果所显示的细胞FN、基膜FN减少与缺失的程度与癌生长、浸润、分化、增殖相平行。当癌细胞呈细索、梁状(B型)生长和弥漫性单个细胞浸润，或分级为Ⅱ～Ⅳ级时，细胞FN、基膜FN明显减少。PCNA反应是细胞增殖的可靠指标，常表达于细胞周期G1后期到S期[5]。本文结果还显示当癌细胞增殖活跃，PCNA以强阳性表达时，细胞FN和基膜FN减少到消失，3例发生转移的癌中均表现细胞FN、基膜FN的消失。提示SSC恶性的程度与细胞FN、基膜FN减少呈正比。部分癌细胞胞浆中存在FN，说明FN可由癌细胞所产生。由于细胞FN常伴有基膜FN，并在癌分化差时同时消失，提示基膜FN可能来源于其贴邻的癌细胞。SSC中细胞FN、基膜FN减少的主要原因是癌细胞本身合成FN的能力下降，或是因为癌细胞仅能合成变异的FN，这种变异的FN糖基化和磷酸化程度高，复合寡糖链分支多，不能停留在细胞表面，同时由于FN的降解增加，癌细胞具有增强胶原酶、内切糖苷酶、组织蛋白酶的作用，这些酶往往构成多个级联系统，降解细胞间质糖蛋白，并促使FN向间质释放[6]。间质FN主要由间质细胞所产生，间质FN的存在与癌浸润后的停留生长有关，在癌巢周围反应性增生的结缔组织中常有丰富的间质FN，呈网格状分布，特别在癌浸润前缘丰富密集。FN沉积于小血管的全层，可能对癌细胞粘附与迁移起重要作用，间质FN分子上既有与癌细胞结合的位点，又有与间质纤维蛋白、胶原蛋白成分结合的位点，发生浸润转移的癌细胞只有在一定量的间质FN介导的桥连粘附才可能停留生长，虽然癌细胞与间质FN的粘附是其运动与转移的前提，但在本文结果未发现间质FN与SSC的显著关系。

机体对肿瘤的免疫反应虽然与全身免疫机能状态密切相关，但机体与肿瘤细胞的相互作用终究要在肿瘤所在的部位进行，因此研究肿瘤局部组织的免疫反应及免疫细胞的分布较为重要。SSC中细胞FN、基膜FN的减少，由邻近炎细胞释放蛋白溶酶消化基膜物质的可能性必须被考虑到。SSC间质浸润的细胞主要是Mφ和Lc，FN可选择性地吸引单核Mφ、促进成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞的迁移，具有非特异性的调理素作用，促进Mφ对肿瘤细胞的吞噬功能。在SSC中Mφ浸润处常伴有密集的Lc，Mφ释放单核因子利于Lc直接发挥抗肿瘤的细胞毒效应。Lc又释放淋巴因子(干扰素γ)进一步激活Mφ发挥间接的抗肿瘤的作用。正如本文所观察到的癌间质细胞Mφ总是出现在癌活跃增殖的癌巢边缘，常通过细胞FN、基膜FN与癌细胞紧贴，其后为大量的Lc，在间质血管中也可见到有一定量的Mφ，提示Mφ可能来源于血液中的单核细胞[7]。机体免疫细胞进入癌间质的顺序是先有一定数量的Mφ后才有大量的Lc。反之，当SSC癌细胞FN和基膜FN减少时，对Mφ、Lc的吸引与趋化作用降低，使局部Mφ、Lc浸润量明显减少。因此，癌中细胞FN和基膜FN能促进Mφ、Lc出现，一定程度上能抑制癌细胞的增殖或杀伤溶解癌细胞[8]，进一步说明细胞FN和基膜FN与Mφ、Lc都是机体抗肿瘤的成分。