分析蛋白电泳测量运用计算机扫描法

1材料与方法

1.1标本来源

取自陆军总医院检验科常规检查健康人血清30份。

1.2仪器与试剂

电泳仪1套;计算机(带有Windows操作系统和安装Adopephotoshop及Excel等软件)1台,扫描仪1台(光学分辨率在1000dpi,吸光度2.8以上)醋酸纤维薄膜等。巴比妥缓冲液(pH8.6离子强度为0.06mol/L);配置好后用1mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值至8.6。染色液:0.1%氨基黑10B,漂洗液:取蒸馏水800mL、甲醇50mL及冰醋酸150mL混合而成。透明液:石蜡油透明液。

1.3操作

参照《全国临床检验操作规程》蛋白电泳操作方法[1],对点样和透明扫描几个步骤加以改进。

1.3.1自行制备点样器

(1)常规分析(剪切后用NaOH浸泡洗脱比色法):先用砂轮将盖玻片打磨平滑,再用两块载玻片夹住盖玻片,露出1cm,用透明胶纸绑紧就成了一个很好的加样器了。(2)扫描法:把盖玻片截掉一半,用同样的方法绑紧。或者剪取3cm×1cm的滤纸条,加样效果也不错。

1.3.2透明

将脱色吹干后的薄膜浸入透明液中,约10min薄膜完全透明,然后将膜条置于洁净、干燥的玻璃板或透明胶片上[2-3]。

1.3.3扫描

用高分辨率扫描仪透射扫描薄膜[4],分别对血清中清蛋白(ALB)及α1、α2、β、γ球蛋白5种成分进行扫描分析。扫描条件为500dpi,保存为RBG模式tiff文件。

1.3.4应用

Adopephotoshop软件,将每个图像分10×100个区间,并用ImageTool图像分析软件分析信息参数分别记录各区间的C、N、Y、K、∑、R、L、a、b等图像色谱参数数据,将上述参数导入Excel电子表格中,运用Excel的引入函数,插入图表,识别低段等功能,可以画出蛋白质组分分布曲线,百分含量。

1.4方法学评价

采用配对数据t检验,以陆军总医院Sebia全自动蛋白电泳分析仪为参照,分别比较扫描法和常规法与Sebia蛋白电泳仪检测结果之间的差异,以P

2结果

扫描法和常规法与Sebia蛋白电泳仪检测结果之间的差异分别见表1、2。实验结果表明,扫描分析测定法与Sebia蛋白电泳仪检测结果不存在差异,以Sebia全自动蛋白电泳仪检测结果为参照,扫描分析测定法在方法学上,可以接受,各项t值均小于常规法,而且在操作上省去了剪切、洗脱、比色等烦琐工夫,避免因此而带来的误差。

3讨论

3.1本实验方法在电泳的前期操作与改良的常规方法一样[5],后期的检测法是根据电泳图谱的色深(吸光度值)直接反映了该区带蛋白质的含量,透明胶片的色深与数字化图谱的RBG信息参数呈反相关,与油墨量∑和L(灰度)呈正比(用油墨量∑为参数的分析结果与Sebia结果最为符合)。由于蛋白分析是测其相对含量,通过分析其色谱参数可计算出蛋白各组分的相对含量百分比。采用了计算机Adopephotoshop应用软件和ImageTool图像分析软件(试用版)以及Excel电子表格统计软件分析系统,但现在几种软件中的综合使用会带来工作量的增加,分析时间较长,离实际应用还有一段距离,这要求检验人员必须与软件专业人员一起自行研究编写一种应用。软件该软件能直接将图像色谱信息参数记录下来,并用相应的计算分析软件(可以是Excel,也可以是其他数据分析软件)分析图像色谱参数,从而计算出蛋白质各组分的百分含量,真正做到图像处理、分析、计算一体,其经济效益和社会效益是非常有前景的。

3.2蛋白电泳的分离效果直接影响到分析结果的准确性和稳定性,因此往后研究工作的重点在提高电泳的分离质量[6]。总结起来,主要有如下几方面:(1)是电泳支持物的选择上,可以比较琼脂糖凝胶与醋纤维膜的分离效果和稳定性。(2)是加样的方法上可以借鉴全自动蛋白电泳仪的加样装置,选择质地均匀、吸水性能好、蛋白质电渗作用小的滤纸,当然还要考虑硬度和厚度等因素,可制成一排多个标本的加样器。(3)是可购买较高配置的电泳仪,使电泳电流、电压稳定,增大可调电压范围。