透析青翘提取物的抑菌活性

摘要：目的研究青翘提取物的抑菌活性。方法以金色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念球菌为代表菌种，用K-B纸片扩散法对青翘提取物的抑菌活性进行研究。结果青翘不同提取物对供试菌均有一定的抑菌活性，其中醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物具有较强的抑菌活性。提取物对金色葡萄球菌的抑菌活性与提取物浓度呈正比，对大肠杆菌和白色念球菌的抑菌活性与提取物浓度不呈简单的正比关系。结论青翘不同提取物对金色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念球菌均有抑制作用。

关键词：青翘；提取物；抑菌活性

连翘为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实。连翘药材商品分为“青翘”和“老翘”。果实初熟尚带绿色时采收蒸熟，晒干，习称“青翘”；果实熟透颜色发黄时采收，晒干，习称“老翘”［1］。

连翘是中国临床常用传统中药之一，又名黄花条、连壳、青翘、落翘、黄奇丹等。已有的研究报道表明，连翘种子挥发油对3种真菌有明显的抑制作用，陕西产青翘、老翘和连翘叶均对大肠杆菌和金色葡萄球菌也有较好的抑制作用［2～6］，上述研究报道都没有对连翘的提取物进行系统的抑菌活性研究。本研究首次以山西道地药材青翘作为研究对象，比较其不同极性提取物的抑菌活性，旨在为临床应用连翘提供理论依据。

1材料与仪器

1.1药材青翘2008??06购自山西省安泽县连翘GAP生产基地，植物标本由山西省药检所郭文菊研究员鉴定，植物标本现存于山西中医学院实验中心。

1.2试剂与菌株金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、大肠杆菌Escherchiacoli、白色念珠菌Candidaalbicans，均由山西省药品检验所提供。营养琼脂培养基，购自杭州天和微生物试剂有限公司；牛肉膏购自北京市海淀区微生物培养基制品厂，蛋白胨购自北京奥特博星生物技术有限责任公司，庆大霉素细菌药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司，所用试剂均为分析纯。

1.3仪器与设备LR4001型旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；CA-111型冷却水循环系统（上海爱郎仪器有限公司）；SHB-88型水循环真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DHP-9162型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DSX-280B型手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；BBS-DSC型洁净工作台(上海巴艾贝斯科技有限公司)；BS224S-L型电子分析天平（德国Sartorius公司）。

2方法

2.1青翘提取物的制备取青翘1kg，粉碎，用95%乙醇加热至70℃回流提取4次，3h/次，减压浓缩回收溶剂至无醇味，得总提取物320g。总提取物经水悬浮后，用石油醚、氯仿、醋酸乙酯和正丁醇依次萃取，得到的石油醚、氯仿、醋酸乙酯和正丁醇萃取相及萃取后水相提取。取适量各部位浸膏及总浸膏，干燥成粉末，备用。

2.2抑菌活性分析

2.2.1药敏纸片的制备［4］

将普通定性滤纸用打孔机打成若干圆形纸片，直径为6mm，置于干燥洁净的试管内，放入压力蒸气灭菌器中经121℃，20min高压灭菌，干燥。分别取干燥后的不同待试样品0.5，1.0，2.0mg，用合适的溶剂溶解，将滤纸片放入溶液中，反复吸取、晾干，直至将溶液吸干，备用。

2.2.2培养基的制备固体培养基：用天平准确称取36g营养琼脂，加入蒸馏水1000ml，加热并不断搅拌，使琼脂完全溶解。然后放入压力蒸气灭菌器中经121℃，20min高压灭菌，取出趁热倒入经过高压灭菌的培养皿中，厚度约3～5mm,冷却凝固后备用。

液体培养基［7］：用天平准确称取牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，加入蒸馏水100ml，加热并不断搅拌，用1%NaOH溶液调节pH7.2～7.4，然后放入压力蒸气灭菌器中经121℃，20min高压灭菌，分装于试管中，备用。

2.2.3菌悬液的制备用接种环分别取各菌种一环，接种于液体培养基中，放入37℃培养箱中培养24h，用灭菌生理盐水分别稀释至1×10-5CFU/ml浓度，备用。

2.2.4药物抑菌作用测定采用K-B纸片扩散法［8］，用无菌移液管吸取稀释好的菌悬液0.1ml，置于培养基中央，用涂布棒涂布均匀。用无菌镊子夹取含药滤纸片贴在培养基表面，以含药量为10μg的庆大霉素细菌药敏试纸为阳性对照。放入37℃培养箱中培养24h后，观察抑菌圈，并用十字交叉法测量抑菌圈直径,结果以毫米(mm)表示,见表1～3。每种不同含药量的样品对3种菌均做3组平行对照，结果取平均值。

3结果

用青翘不同提取物，以细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和霉菌白色念珠菌作为指示菌进行抑菌实验。结果见表1～3。表1青翘不同提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈活性，表2青翘不同提取物对大肠杆菌的抑菌圈活性，表3青翘不同提取物对白色念珠菌的抑菌圈活性（略）。

从表1看出，除氯仿提取物外，其余各提取物均对金黄色葡萄球菌均有抑制作用，其活性比较：正丁醇提取物??醋酸乙酯提取物??石油醚提取物≈95%乙醇提取物??水提取物。并且，随着纸片含药量的增加，抗菌作用增强。

从表2可知，青翘不同提取物对大肠杆菌均有一定抑制作用。总体来看，氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物对大肠杆菌抗菌活性较强，其次为石油醚提取物。并且，石油醚提取物与95%乙醇提取物在含药量为0.5mg时抗菌活性最强，氯仿提取物在含药量为1.0mg时抗菌活性最强，而其它提取物含药量为2.0mg时抗菌活性最强。这与文献报道的连翘乙醇提取物的浓度与抑菌作用强弱之间并不呈简单的正比关系［6］相一致，提示我们多种成分同时存在时可能仅存在“最适抑菌浓度”。

从表3可知，青翘不同提取物对白色念珠菌均有一定抑制作用。总体来看，醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对白色念珠菌的抑制作用较强，其次为95%乙醇提取物。所有提取物的抗菌作用受含药量改变的影响不大，并且，纸片含药量为0.5mg时，显示出略强的抗菌活性。与青翘提取物对大肠杆菌的抑菌作用一样，说明了浓度与抑菌作用强弱之间并不呈简单的正比关系。

4讨论

本研究表明，青翘不同提取物对3种菌株均表现了不同程度的抑菌作用，抑菌作用的顺序为金黄色葡萄球菌??大肠杆菌??白色念珠菌。金黄色葡萄球菌是目前引起上呼吸道感染的常见菌，这与中医药认为连翘具有清热解毒功效，以及连翘治疗呼吸道感染的临床应用基本吻合，临床上一些感染性疾病的最终治愈还是依赖清热药的抗病原体作用，因此抗菌是这类药物的主要药理作用［6］。对于金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，抑菌活性成分集中于正丁醇和醋酸乙酯提取物中；而对于大肠杆菌，抑菌活性成分集中于醋酸乙酯和氯仿提取物中。这说明青翘中极性较大的成分具有较强的抑菌活性，是其发挥清热解毒功效的物质基础。青翘提取物对大肠杆菌的抑菌作用研究表明，95%乙醇、石油醚与氯仿提取物浓度与抗菌作用强弱之间不呈正比关系，查阅相关资料［5］，推测其原因可能是青翘提取物中的某些极性小的成分提供了菌体生长所需的“营养物质”，或是这些极性小的成分刺激了菌体的生长。由于中药成分的复杂性和各种成分性质的差异性，使药物作用过程和机理更加复杂。因此，以往参照抗生素求最小抑菌浓度(MIC)的方法很难准确地反映青翘的抑菌活性，应该寻求它的“最适抑菌浓度”。

研究结果可以指导青翘中抑菌活性成分的分离纯化，为更好地发挥青翘抗菌作用奠定基础。

参考文献：

［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005:117.

［2］牛新华，邱世翠，邸大琳，等.连翘体外抑菌作用的研究［J］.时珍国医国药，2002,13(6):342.

［3］杨天鸣，张志海,张虹.连翘水提物抗菌作用的实验研究［J］.兰州医学院学报，2003,29(1):40.

［4］段飞，张双民，杨健雄，等.连翘叶提取物抑菌作用的研究［J］.西北药学杂志，2005，20(2):66.

［5］刘世旺，徐艳霞，郑永良.连翘乙醇提取物对细菌生长曲线的影响［J］.安徽农业科学，2007,35(24):7383.

［6］张恩户，赵子剑，张英，等.连翘及其制剂抗菌效价的生物测定法［J］.中国中医基础医学杂志，2005,11(10):782.

［7］徐威.微生物学实验［M］.北京：中国医药科技出版社，2004:40.

［8］时维静，路振香，李立顺.白头翁不同提取物及复方体外抑菌作用的实验研究［J］.中国中医药科技，2006,13(3):166.