药物分子对羟丙基―β―环糊精复合包合物的影响

[摘要] 研究不同性质药物葛根素、冰片、梓醇两两包合时的相互影响，探索多组分、多性质的中药复方包合物的包合规律。以HP-β-CD作为包合材料，冷冻干燥法制备包合物。通过包合量测定、DSC和X射线衍射考察葛根素、冰片、梓醇两两包合时的包合情况。结果显示，难溶性药物葛根素和冰片同时包合，当葛根素过量时，葛根素的包合量与单独包合时无明显差异，冰片未被包合；当葛根素量不足而HP-β-CD过量时，冰片才被包合，且包合量低于冰片单独包合。水溶性药物梓醇与葛根素或冰片共同包合时，葛根素或冰片的包合量与单独包合时无明显差异，DSC和X射线衍射图谱均无梓醇的特征峰。难溶性药物葛根素和冰片同时包合时存在竞争，葛根素竞争性更强。水溶性药物梓醇能与HP-β-CD复合但不影响葛根素和冰片的包合。

[关键词] 葛根素；冰片；梓醇；HP-β-CD；包合

[收稿日期] 2014-03-12

[基金项目] 重庆市自然科学基金项目（csct2011jj10010）；西南大学基本科研业务费专项（XDJK2014C089）；西南大学博士基金项目（SWU111065）

[通信作者] 张继芬，博士，副教授，主要从事中药新制剂研发，Tel：（023）68251225，E-mail：

葛根素（puerarin）是从豆科植物野葛Pueraria lobata（Wrilld）Ohwi中提取的一种黄酮类化合物，临床上用于预防和治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死等多种心脑血管疾病[1-2]。梓醇是从地黄Rehmannia glutinosa Libosch中提取的一种环烯醚萜类化合物，具有抗癌、神经保护、抗炎等多种药理作用[3]。课题组研究证实，葛根素与梓醇配伍可改善神经功能症状和降低脑梗死体积；促进大鼠永久局灶性脑缺血后神经干细胞的增殖，增加缺血侧微血管密度，促进血管新生；对缺氧缺糖损伤的“脑神经血管单元”体外模型具有显著的保护作用[4-8]。这些都对缺血性脑血管病的治疗具有积极意义。

本研究拟在处方中加入冰片以提高脑组织中葛根素和梓醇的浓度，从而提高治疗效果。冰片是从龙脑香的树脂和挥发油中获得的结晶。历代医家都认为冰片有引药上行之功[9]。现代研究证实，冰片能促进其他药物如川芎嗪[10]、栀子苷[11]等透过血脑屏障。

复方中葛根素的水溶解性差；梓醇水溶性好，但稳定性差；冰片不仅水溶性差，而且易升华损失。要想成功运用于临床必须要解决存在的问题。已有研究分别制备了葛根素[12]和冰片[13]的包合物，成功增加葛根素在水中的溶解度以及减少冰片挥发。但尚无葛根素与冰片同时包合的研究报道。目前包合技术多用于难溶性药物和挥发性成分，水溶性药物与包合材料之间会产生何种作用，以及水溶性药物的存在会对难溶性药物的包合产生何种影响，均无研究报道。

本研究拟以葛根素、梓醇、冰片组成一个治疗脑缺血的中药复方，采用HP-β-CD包合技术同时解决药物的难溶、降解和升华等问题。重点考察了复方中的葛根素、冰片和梓醇两两包合时的相互影响，为该新药的开发奠定基础，同时为具有多组分、多性质的中药复方的包合物的制备提供参考。

1 材料

Agilent1200高效液相色谱仪（Agilent）；GC-2010气相色谱仪（岛津）；SHA-BA水温恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）；200PC热分析仪（德国Netzsch）；MSAL XD-3型X衍射仪（北京普析通用仪器有限责任公司）；Coolsafe 100-9 pro冷冻干燥机（丹麦LaboGene公司）；AB 135-S天平（梅特勒・托利多仪器有限公司）。

葛根素（纯度>98%，四川玉鑫药业有限公司，批号090602）；冰片（和平药房购买，经鉴定符合《中国药典》要求）；梓醇（纯度>98%，石家庄流波白鸟生物科技有限公司，批号110808-200508）；HP-β-CD（湖北海泊元化工有限公司，批号20111012）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 葛根素含量测定 采用RP-HPLC检测葛根素的含量。参考文献[14]，色谱条件如下：Eclipse C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相水-乙腈（89∶11）；流速1 mL・min-1；柱温25 ℃；检测波长250 nm，进样量10 μL。色谱图见图1。葛根素的保留时间为6.54 min，HP-β-CD在此无干扰，色谱条件可行。

精密称取葛根素10.38 mg，甲醇定容至50 mL，得贮备液。精密吸取0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5 mL贮备液，甲醇定容至10 mL，得质量浓度分别为1.038，2.076，5.19，10.38，20.76，51.9，103.8 mg・L-1的标准溶液。按2.1.1项下色谱条件进样检测。以峰面积（Y）对葛根素浓度（X）进行线性回归，得标准曲线Y=31.514X+36.546，r=0.999 5。葛根素在1.038～103.8 mg・L-1呈良好的线性关系。其余方法学研究结果均符合规定。

2.1.2 冰片含量测定 参照2010年版《中国药典》，采用GC测定冰片含量。色谱条件如下：PEG-20M柱；FID检测器；进样口温度250 ℃；柱温120 ℃；检测器温度250 ℃；分流比10∶1；柱流速1.53 mL・min-1。色谱图见图2。异龙脑的保留时间为15.07 min，龙脑的保留时间为17.25 min，HP-β-CD在此无干扰，色谱条件可行。

精密称取冰片201.04 mg，用无水乙醇定容至50 mL作为贮备液。精密吸取1，2，3，5，7.5 mL贮备液，无水乙醇定容至10 mL，制成质量浓度分别为0.402 08，0.804 16，1.206 24，2.010 4，3.015 6 g・L-1的溶液。按2.1.2项下色谱条件进样检测。以峰面积（Y）对冰片的浓度（X）进行线性回归，得标准曲线Y=1.1×106X-1.7×105，r=0.998 7。冰片在0.402 08～3.015 6 g・L-1呈良好的线性关系。其余方法学研究结果均符合规定。

2.1.3 梓醇的含量测定 采用RP-HPLC法检测梓醇的含量。参考文献[14]，色谱条件如下：PLATISIL C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相水-乙腈（98∶2）；流速1 mL・min-1；柱温25 ℃；检测波长206 nm。色谱图见图3。梓醇的保留时间为6.32 min，HP-β-CD在此无干扰，色谱条件可行。

精密称取梓醇9.63 mg，纯化水定容至50 mL，得贮备液。精密吸取0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5 mL贮备液，纯化水定容至10 mL，制成质量浓度为0.936，1.926，4.815，9.630，19.26，48.15，96.30 mg・L-1的标准溶液。按2.1.3项下色谱条件进样检测。以峰面积（Y）对梓醇质量浓度（X）进行线性回归，得标准曲线Y=4.670 0X+0.678 9，r=0.999 8。梓醇在0.936～96.30 mg・L-1呈良好的线性关系。其余方法学研究结果符合规定。

2.2 葛根素单独包合

配制0.01，0.02，0.05，0.075，0.1，0.15，0.2 mol・L-1的HP-β-CD溶液，各精密吸取5 mL于西林瓶中，加入过量的葛根素粉末，25 ℃恒温振荡24 h，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，参照2.1.1项液相色谱条件进样分析（必要时可稀释），葛根素量分别为0.014 3，0.023 7，0.038 0，0.062 8，0.083 6，0.128 0，0.183 0 mol・L-1。

以葛根素浓度（Y）对HP-β-CD浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y=0.876 9X+0.000 4，r=0.995 6。说明1 mol HP-β-CD最多可以包合0.877 3 mol葛根素。

2.3 冰片单独包合

分别制备0.01，0.02，0.05，0.075，0.1，0.15，0.2 mol・L-1的HP-β-CD溶液，各精密量取5 mL于西林瓶中，加入过量的冰片粉末，25 ℃恒温振荡24 h，用0.22 μm微孔滤膜过滤，参照2.1.2项气相色谱条件进样分析，HP-β-CD包合的冰片量分别为0.002 4，0.004 4，0.011 5，0.014 6，0.017 6，0.024 7，0.034 4 mol・L-1。

以冰片的浓度（Y）对HP-β-CD的浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y=0.161 3X+0.001 7，r=0.995 8。说明1 mol HP-β-CD最多可以包合0.163 mol冰片。

2.4 难溶性药物葛根素和冰片共同包合

2.4.1 包合量的测定 精密吸取浓度分别为0.02，0.1，0.2 mol・L-1的HP-β-CD溶液5 mL于西林瓶中，按HP-β-CD-葛根素-冰片摩尔比为1∶1∶1，1∶1∶2，1∶2∶1，2∶1∶1加入葛根素和冰片，25 ℃恒温振荡24 h，0.22 μm微孔滤膜过滤，测定葛根素和冰片的包合浓度（必要时可稀释）。葛根素在不同包合物中的包合量见表1。环糊精-葛根素-冰片1∶1∶1，1∶2∶1，1∶2∶1时冰片浓度低于检测限，2∶1∶1时0.02，0.1，0.2 mol・L-1的HP-β-CD包合物中冰片浓度分别为0.000 716，0.009 3，0.021 5 mol・L-1。葛根素与冰片同时包合时会产生竞争性。无论葛根素与冰片的比例如何，葛根素总是被优先包合；只有当葛根素全部被包合后还有多余的HP-β-CD，冰片才被包合。

2.4.2 差示扫描量热法（DSC） 采用冷冻干燥法制备固体形态的包合物。分别取HP-β-CD，药物，药物的单独包合物，同比例的药物与HP-β-CD的机械混合物，摩尔比为1∶1∶1和2∶1∶1的共同包合物进行DSC分析。工作条件：升温范围50～250 ℃；升温速率10 ℃・min-1；参比物为空铝坩埚；气氛为氮气（质量分数99.99%）。葛根素组和冰片组的DSC图见图4，5。

葛根素在208 ℃处出现一个明显的吸热峰，冰片在203 ℃处出现一个明显的吸热峰；单独包合物中葛根素或冰片的吸热峰均消失，而等比例的机械混合物中，葛根素或冰片分别在208，180 ℃处有较弱的吸热峰，说明葛根素或冰片包合在HP-β-CD中。1∶1∶1的共同包合物中，葛根素无吸热峰，说明包合成功；冰片无吸热峰，与GC中检测不到冰片的结果一致。2∶1∶1的共同包合物中，葛根素和冰片均能检测到，但均无吸热峰，说明两者同时包合在HP-β-CD的空腔中。

2.4.3 X射线衍射法（XRD） 分别取HP-β-CD，药物，药物的单独包合物，同比例的药物与HP-β-CD的机械混合物，摩尔比为1∶1∶1和2∶1∶1的共同包合物粉末进行X射线衍射。工作条件：Cu靶/石墨单色器，管压36 kV，管流30 mA，步长为0.02°，扫描速度2°・min-1，采样时间为1 s，2θ角扫描范围2°～45°。葛根素组和冰片组的X射线衍射图谱分别见图6，7。

葛根素在17°，23°处有特征衍射峰，冰片在20°，22°处有特征衍射峰；单独包合物中葛根素或冰片的衍射峰均消失，而等比例的机械混合物中，葛根素或冰片分别在17°，23°和20°，22°有较弱的衍射峰，说明葛根素或冰片包合在了HP-β-CD中。1∶1∶1的共同包合物中，葛根素无衍射峰，说明包合成功；冰片无衍射峰，与检测不到冰片的结果一致。2∶1∶1的共同包合物中，葛根素和冰片均能检测到，但均无衍射峰，说明两者同时包合在HP-β-CD的空腔中。

2.5 水溶性药物梓醇和难溶性药物葛根素或冰片共同包合

2.5.1 包合量的测定 精密吸取浓度分别为0.02，0.1，0.2 mol・L-1的HP-β-CD溶液5 mL于西林瓶中，各按HP-β-CD-葛根素-梓醇为1∶1∶1的摩尔比和HP-β-CD-冰片-梓醇为1∶1∶1的摩尔比加入葛根素、冰片和梓醇，25 ℃恒温振荡24 h，0.22 μm微孔滤膜过滤，测定葛根素、冰片和梓醇的浓度。葛根素和梓醇的包合浓度以及冰片和梓醇的包合浓度分别见表2，3。葛根素、梓醇共同包合时，葛根素的包合量与葛根素单独包合时无明显差异。冰片、梓醇共同包合时，冰片的包合量与冰片单独包合时无明显差异。当葛根素和梓醇同时包合或冰片与梓醇共同包合时，梓醇的浓度基本无变化。

2.5.2 差示扫描量热法（DSC） 分别取HP-β-CD，梓醇，梓醇的单独包合物，同比例的药物与HP-β-CD的机械混合物，摩尔比为1∶1∶1和2∶1∶1的共同包合物粉末进行DSC分析。工作条件同2.4.2项。梓醇组的DSC图谱见图8。

梓醇在210 ℃有特征吸热峰；单独包合物中梓醇吸热峰消失，而等比例的机械混合物中，梓醇在210 ℃有较弱的吸热峰，说明梓醇包合在HP-β-CD中。HP-β-CD-葛根素-梓醇共同包合物中，梓醇和葛根素均无吸热峰，说明包合成功；HP-β-CD-冰片-梓醇共同包合物中，梓醇和冰片均能检测到，但均无吸热峰，说明也包合成功。

2.5.3 X射线衍射法（XRD） 分别取HP-β-CD，梓醇，梓醇的单独包合物，同比例的梓醇与HP-β-CD的机械混合物、HP-β-CD-葛根素-梓醇摩尔比为1∶1∶1和HP-β-CD-冰片-梓醇摩尔比为1∶1∶1的共同包合物进行X衍射。工作条件同2.4.3项。梓醇组的X射线衍射图谱见图9。

梓醇在19°和23°有特征衍射峰；单独包合物中梓醇的衍射峰均消失，而等比例的机械混合物中，梓醇在19°和23°有较弱的衍射峰，说明梓醇包合在HP-β-CD中。HP-β-CD-葛根素-梓醇共同包合物中，梓醇和葛根素均无衍射峰，说明包合成功；HP-β-CD-冰片-梓醇共同包合物中，梓醇和冰片均能检测到，但均无衍射峰，也说明包合成功。

2.6 葛根素、冰片、梓醇共同包合

2.6.1 包合量的测定 精密吸取0.02，0.1，0.2 mol・L-1的HP-β-CD溶液5 mL于西林瓶中，各按HP-β-CD-葛根素-冰片-梓醇摩尔比为2∶1∶1∶1的摩尔比加入葛根素、冰片和梓醇，25 ℃恒温振荡24 h，0.22 μm微孔滤膜过滤，测定葛根素、冰片和梓醇的浓度。葛根素、冰片和梓醇的包合浓度见表4。当HP-β-CD-葛根素-冰片-梓醇2∶1∶1∶1共同包合时，葛根素和冰片的含量都与未加入梓醇（HP-β-CD-葛根素-冰片2∶1∶1）时的包合量相当。表4与表2，3比较可知，梓醇的浓度均无明显变化，可得知梓醇对葛根素和冰片的包合没有影响。

2.6.2 差示扫描量热法（DSC） 分别取HP-β-CD-葛根素-冰片-梓醇2∶1∶1∶1的共同包合物粉末进行DSC分析。工作条件同2.4.2项。葛根素、冰片和梓醇共同包合的DSC图谱见图10。

葛根素、冰片和梓醇分别在208，203，210 ℃有特征吸热峰；包合物中各组分的吸热峰均消失，明显区别于机械混合物。由此证实药物与HP-β-CD形成了复合包合物。

2.6.3 X射线衍射法（XRD） 分别取HP-β-CD-葛根素-冰片-梓醇2∶1∶1∶1的共同包合物粉末进行X射线衍射分析。工作条件同2.4.3项。葛根素、冰片和梓醇共同包合的X射线衍射图谱见图11。

葛根素、冰片和梓醇分别在17°和23°，20°和22°，19°和23°处有特征衍射峰；包合物中各组分的衍射峰均消失，而等比例的机械混合物中，葛根素、冰片、梓醇都有较弱的衍射峰，也证实药物与HP-β-CD形成了复合包合物。

3 讨论

葛根素与冰片均为难溶性药物，研究结果证实，两者共同包合时存在着竞争性。这种竞争作用与葛根素与冰片的比例无关，无论葛根素与冰片的比例为2∶1，1∶1还是1∶2，葛根素在竞争中均取得绝对优势，优先占据所有HP-β-CD的空穴，只有当葛根素全部包合后还有多余的HP-β-CD时，冰片才能被包合进去。这与葛根素的包合稳定常数（1.78×104 L・mol-1）远远高于冰片（1.13×102+ L・mol-1）的实验结果一致。葛根素与冰片具有不同的分子结构和大小，不同的极性和润湿性，使葛根素进入HP-β-CD的空穴内并形成稳定包合物的能力明显强于冰片，因此葛根素具有更强的竞争性。

亲水性药物梓醇与疏水性药物葛根素或冰片共同包合时，包合物中梓醇能被全量检测到，但DSC 和X射线衍射图谱中包合物中梓醇的特征峰都消失，说明梓醇与HP-β-CD之间有相互作用。同时葛根素或冰片的包合量与其单独包合时没有明显变化，说明梓醇对它们不存在竞争作用。分析原因可能如下：HP-β-CD具环状中空圆筒形结构，6位上的-CH2基与葡萄糖苷结合的氧原子则排列在空穴的内部而呈疏水性，空穴的开口处或空隙的外部排列有大量羟基而呈亲水性。梓醇是环烯醚萜类化合物，其结构中也含有多个羟基，可与HP-β-CD空穴开口处的羟基形成分子间氢键，使梓醇和HP-β-CD复合在一起，因此DSC和X射线衍射在包合物中检测不到梓醇的特征峰。但由于梓醇未进入HP-β-CD的疏水性空腔内部，所以不影响疏水性药物葛根素、冰片的包合。本研究可为抗脑缺血新药的开发奠定基础，同时为具有多组分、多性质的中药复方的包合物的制备提供参考。

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Impact of drug molecules on HP-β-CD compound inclusion

TANG Dan-dan， LI Na， WANG Li-wen， ZHANG Ji-fen， XU Xiao-yu

（1.College of Pharmaceutical Sciences， Southwest University， Chongqing 400716， China；

2. Chongqing Engineering Research Center for Pharmacological Evaluation， Chongqing 400716， China）

[Abstract] To study the interaction of drugs of different properties， namely puerarin， borneol and catalpol in the process of inclusion， in order to explore the inclusion regularity of multi-component and multi-property traditional Chinese medicine compound inclusions. With HP-β-CD as the inclusion material， the freeze-drying method was used to prepare the inclusion. The inclusion between puerarin， borneol and catalpol was tested by measuring the inclusion concentration， DSC and X-ray diffraction. According to the findings， when insoluble drugs puerarin and borneol were included simultaneously， and puerarin was overdosed， puerarin included was almost equal to puerarin included， and borneol was not included. When puerarin was under-dosed， and HP-β-CD was overdosed， borneol was included， and the simultaneous inclusion was lower than the separate inclusion of borneol. When water-soluble drug catalpol was jointly included with puerarin or borneol， the simultaneous inclusion was almost the same with their separate inclusion， without characteristic peak of catalpol in DSC and X-ray diffraction patterns. There is a competition in the simultaneous inclusion between water-soluble drugs puerarin and borneol and a stronger competition in puerarin. The water-soluble drug catalpol could be included with HP-β-CD with no impact on the inclusion of puerarin or borneol.

[Key words] puerarin； borneol； catalpol； HP-β-CD； inclusion

doi：10.4268/cjcmm20141519