设施菜地论文：施肥对菜地影响的探究

本文作者：王亚男1曾希柏1俄胜哲2白玲玉1李莲芳1苏世鸣1沈灵凤1作者单位：1中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所2甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所

结果与分析

1氨氧化细菌的T-RFLP分析

将土壤样品的amoA功能基因用MspI内切酶酶切后，得到4个主要片段长度，分别是60bp、156bp、235bp和256bp。对主要片段进行分析后得到图1。可以看出，不同施肥对0~20cm和20~40cm土层中156bp和256bp两个片段百分比变化的影响较小。156bp在各个样品中平均约占5%，最大不超过9%；256bp在各个样品中平均约占10%，最大不超过17%。但是，不同处理间TRFs的主要片段60bp和235bp则有较明显差异，其中235bp片段所占比例较高，最大达到62%。同一土层中，235bp片段一般以CK和NPK处理较高。不同土层比较，0~20cm土层中60bp片段以M处理最高，235bp则以NPK处理最高；20~40cm土层中60bp片段以MNPK处理最高，235bp则以CK处理最高。对相关结果进行统计分析（表3）可以看出，施肥对60bp、235bp和256bp片段的百分比都有显著影响，而土壤层次则主要影响60bp和235bp两个片段。不同施肥处理间片段百分比的变化幅度明显要大于土层间的变幅。说明在设施栽培条件下，土壤中氨氧化细菌的状况受施肥的影响更大。

2土壤氨氧化细菌的系统发育树

在本研究中，挑选氨氧化细菌片断较丰富的样品（MNPK第二个重复的0~20cm土层样品）进行克隆文库构建。选取52个阳性克隆子进行测序分析，将克隆测序的结果与典型氨氧化细菌进行比对，构建系统发育树（图2）。图2所示的测序结果显示，本试验所处条件下土壤中氨氧化细菌的所有序列均属于β-变形菌门，主要包括Nitrosospiracluster3a、Nitrosospiracluster3b和Nitrosomanascluster7三个属。其中属于Nitrosospiracluster3a的片段包括60bp、235bp和256bp，属于Nitrosospiracluster3b的片段包括60bp和156bp，还有一部分60bp的片段属于Nitrosomanascluster7。235bp和256bp为Nitrosospiracluster3a氨氧化细菌特有，156bp为Nitrosospiracluster3b氨氧化细菌特有，而60bp片段则分布在3个cluster中。Ni－trosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b这两个属的氨氧化细菌的序列由于都属于Nitrosospiracluster3，其相似度高，很难通过酶切分型将其完全区别。为进一步将属于Nitrosospira和Nitrosomanas这两个属的氨氧化细菌分开，选用BsaJI酶对测得的序列作进一步分析。发现属于Nitrosomanascluster7的氨氧化细菌用BsaJI酶酶切后，酶切片段长度为319bp，而属于Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b的氨氧化细菌酶切后得到的主要片段长度为60bp、67bp、118bp、155bp和484bp，利用MspI和BsaJI这两种内切酶对测序结果进行统计分析，可以将氨氧化细菌Nitrosospira和Nitrosomanas两个属的片段加以区别。

3氨氧化细菌群落结构与土壤理化性质相关性

氨氧化细菌群落结构与土壤理化性质的相关性列于图3。可以看出，氨氧化细菌的群落结构与土壤有机质（r=0.461，F=23.915，P=0.002）、全磷（r=0.304，F=1243，P=0.002）、pH值（r=0.241，F=8.883，P=0.004）和硝态氮（r=0.177，F=6.020，P=0.018）含量等均呈显著相关，而与土壤全钾含量无相关性。由于土壤有机质和pH值等理化指标的变化在很大程度上与施肥及管理等因素密切相关，可以认为土壤中氨氧化细菌的群落在很大程度上受耕作和施肥的影响。

4施肥对氨氧化细菌丰度的影响

本研究中，对不同施肥处理下土壤中氨氧化细菌amoA基因拷贝数的变化情况进行了相应分析，其结果如图4。不同施肥处理、不同土层的氨氧化细菌amoA基因拷贝数均有明显差异。其中，CK和M处理土壤中氨氧化细菌amoA基因拷贝数均较低，而1/2MNPK和NPK处理土壤中amoA基因拷贝数则一般均较高。MNPK处理下土壤中氨氧化细菌的基因拷贝丰度并没有因为施肥量较高而达到最大，在0~20cm土层中反而低于1/2MNPK和NPK处理，在20~40cm土层中亦低于1/2MNPK处理。在0~20cm和20~40cm两个土层中，氨氧化细菌的丰度均以1/2MNPK处理最高，amoA基因拷贝数分别达到每克土9.95×107拷贝数和每克土6.65×107拷贝数，比CK处理增加105.0%和315.3%。根据氨氧化细菌amoA功能基因拷贝数的统计分析结果，施肥对氨氧化细菌丰度具有显著影响（P=0.028<0.05），而不同土层间比较，氨氧化细菌丰度无明显差异（P>0.05）。

讨论

本文采用PCR-TR－FLP与定量PCR技术相结合的方法，研究了设施菜地不同施肥下氨氧化细菌的种类及丰度变化。氨氧化细菌功能基因amoA经过MspI酶酶切后主要得到了4个片段，且每个样品中都包含这4个片段，只是它们所占百分比不同。将T-RFLP结果与克隆测序结果结合分析后发现，研究土壤中氨氧化细菌包括Nitrosospira和Nitrosomanas两个属，Nitrosospira属的氨氧化细菌为优势种群，占90%左右，Nitrosomanas属的氨氧化细菌仅占10%左右。该结果与Kowalchuk等[19]报道的土壤中硝化细菌以Nitrosospira属为主，而非Nitroso－manas属的结论一致，也与很多研究[20]认为的Ni－trosospira细菌在氨氧化过程中发挥主要作用一致。但与Fan等[21]和Li等[22]报道不尽一致的是，本研究中除以Nitrosospira属氨氧化细菌为主外，还含有少部分Nitrosomanas属的氨氧化细菌，说明受设施环境及施肥的影响，氨氧化细菌的种类可能会变得更丰富。本研究设施土壤中大部分氨氧化细菌属于Nitrosospiracluster3，各处理中均以Nitrosospiracluster3a和Ni－trosospiracluster3b为优势种群，只是所占比例有差别。一般认为，不同氮素浓度会引起氨氧化细菌种属的改变，这是由于不同类型氨氧化细菌对基质[23]和铵浓度的敏感度不同所致[24]。Kowalchuk的研究中施用氮肥刺激了Nitrosospiracluster3的生长，导致其成为土壤中的优势菌属[25]，Belse等[26]亦认为在铵浓度较高的条件下，Nitrosospiracluster3能够更好地生长。但是，Avrahami等[17]指出Nitrosospiracluster3不一定需要在较高铵浓度下才能成为优势菌属，Chu等[8]发现在不施肥处理下Nitrosospiracluster3也是优势菌属。本研究亦证实，Nitrosospiracluster3不仅在施用高氮条件下是优势菌属，即使在氮肥施用适中、甚至不施氮肥的对照处理中，Nitrosospiracluster3也是优势菌属。Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b对铵浓度的要求表现出不同的趋向性[17]。Chu等[8]研究表明，长期施用氮肥后，土壤中Nitrosospiracluster3a氨氧化细菌的丰度明显增加。本研究中，由于60bp片段同时属于Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b两个属，即使用BsaJI酶切仍不能将两个属的完全分开，所以不能准确区分出Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b这两个属百分比的变化。有机质可以为自养型氨氧化细菌的生长提供丰富的养分，因此有机质含量丰富的土壤中，如表层和施用有机肥的土壤中，氨氧化细菌的多样性和丰度也较高。施肥会引起土壤pH值的变化，尤其是长期施用化肥会导致土壤酸化。很多研究表明，土壤pH值是影响硝化作用的重要因素[13]，低pH值可限制硝化细菌的生长，不利于硝化过程的进行，从而影响土壤氮素循环。pH值也是影响氨氧化细菌和古菌群落多样性、数量和活性的主要因素[27]。本研究通过T-RFs片段分析同样得出有机质和pH值与氨氧化细菌群落结构具有十分显著的相关性。氨氧化细菌不仅对土壤中氮素转化具有十分重要的作用，而且也是土壤中更容易受到外界条件变化影响的一类微生物。传统的计数培养法很难精确估算出环境条件对氨氧化细菌这类难以在人工条件下培养的微生物丰度的影响。采用荧光定量PCR技术不仅可以解决以上问题，而且可以准确反映微生物的细微变化。运用荧光定量PCR技术研究氨氧化细菌数量的变化已经有很多报道，如Okano等[11]利用real-timePCR研究了不同铵浓度对氨氧化细菌数量的影响，发现其数量随铵浓度的增加而增加，最高达到每克土6.6×107个细胞。Hermansso等[10]的研究也指出，施氮处理的土壤中氨氧化细菌数量达到每克干土6.2×107拷贝数，比不施肥处理的土壤高出3倍多。在本研究中，氨氧化细菌丰度的最大值并不是出现在施肥量最高的MNPK处理，而是出现在1/2MNPK处理0~20cm土层，amoA基因数达到每克干土9.95×107拷贝数。该结果与前人的结果并不完全一致[11]，说明对于设施菜地而言，由于环境条件与大田差异明显，施肥的影响也可能因此而有所差别。同一施肥处理下，一般0~20cm土层中氨氧化细菌的丰度高于20~40cm土层，这是因为表层土壤中氧气相对充足且土壤肥力较高，更适宜好氧型氨氧化细菌的生长。

结论

本文采用T-RFLP和定量PCR结合的技术，系统研究设施菜地不同施肥处理后氨氧化细菌的群落结构和丰度的变化。结果表明：（1）设施菜地土壤中氨氧化细菌的优势菌为Ni－trosospiracluster3属，但也包括有少量的Nitroso－manascluster7属氨氧化细菌，意味着在设施栽培与施肥条件下土壤中氨氧化细菌的种类可能比大田更丰富。（2）施肥对土壤中Nitrosospiracluster3a和Ni－trosospiracluster3b的丰度和相对百分比具有显著影响。相关分析结果表明，有机质含量和pH值均是导致氨氧化细菌群落结构差异的主要原因。荧光定量PCR技术分析发现，施肥是导致氨氧化细菌丰度差异的主要原因。本研究结果为进一步开展氨氧化细菌参与的设施菜地氮素循环与转化研究，制定设施菜地合理施肥量等，均具有重要的参考意义。