乳腺癌中转化生长因子TGFβ1mRNA及蛋白表达及意义

【摘要】 目的 探讨转化生长因子TGFβ1 mRNA及其蛋白在乳腺癌中的表达及其意义。方法 采用RT-PCR和免疫组织化学法分别检测96例乳腺癌新鲜组织及对应60例石蜡组织中TGFβ1 mRNA及蛋白的表达。结果 乳腺癌中TGFβ1 mRNA及蛋白的高表达率分别为45．83%、43．33%，明显高于其在乳腺良性增生组织(26．67%，20%)及正常乳腺组织(9．09%，0)中的表达，差异有统计学意义(P

【关键词】TGFβ1；乳腺癌；RT-PCR；免疫组织化学

Expression and significance of the transforming growth factor β1 in breast cancer

ZHAO Guo-ren,ZHU Ling-dong，AN Gang.the Peoples Hospital of Lixia,Jinan,Jinan 250011，Chnia

【Abstract】 Objective To investigate the expression of transforming growth factor β1(TGFβ1)in breast cancer and its significance.MethodsTGFβ1 mRNA was detected in 96 fresh tumor tissues of breast cancer using semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR),and TGFβ1 protein was examined in 60 corresponding formalin-fixed paraffin-embedded tissues by immunohistochemistry.Results The overexpression rates of both TGFβ1 mRNA and protein in breast cancer tissues were 45．83%,43．33%,respectively,which were higher than that in innocence hyperplastic tissues of breast(26．67%,20%)and normal breast tissues(26．67%,20%)with significant difference(P

【Key words】Transforming growth factor β1; Breast cancer; Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR); Immunohistochemistry

转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)是人体多种组织细胞内的一种负生长调控因子。研究表明，TGFβ1的过度表达与一些肿瘤的进展及预后有关[1,2]。关于TGFβ1在乳腺癌表达状态及意义目前尚有争议[3-5]。本文应用RT-PCR和免疫组化法检测TGFβ1在乳腺癌中的表达，探讨TGFβ1在乳腺癌发生发展中的生物学意义及其预后价值。

1 材料与方法

1．1 临床资料 96例乳腺癌新鲜组织样本取自济南市历下区医院及山东大学第二医院2002~2005年手术患者，其中60例对应石蜡标本取自该两院病理科存档蜡块，患者均为女性，年龄30~87岁，中位年龄57岁。术前均未接受化疗和/或放疗。所有患者均经术后病理检查证实，按WHO最新标准对各患者进行病理学分级和分型[6]，其中浸润性导管癌71例，其他类型癌25例；临床分期按国际抗癌联盟(UICC)TMN分期[7]：I~Ⅱ期64例，Ⅲ+Ⅳ期32例；腋窝淋巴结转移56例，无转移40例(石蜡标本资料另记)。选取同期乳腺良性增生组织15例及正常乳腺组织11例。

1．2 主要试剂及仪器 Trizol试剂盒及SuperScriptTMⅡReverseTranscriptase试剂盒为美国Invitrogen公司产品。美国MJ PTC-220多通道PCR仪；美国LAMBDA BIO 20双光束紫外分光光度计；美国BIO-RAD GD Doc2000凝胶电泳图像分析系统。TGFβ1(1：200)蛋白为兔抗人多克隆抗体，美国Santa Cruz公司产品。即用型SP检测试剂盒购自北京中杉金桥公司(美国Zymed公司产品)。

1．3 PCR引物 TGFβ1及内参照β-actin引物由上海生工生物公司合成(表1)。

1．4 总RNA提取 采用Trizol试剂一步法提取组织总RNA，采用分光光度计检测OD260/OD280的比值以验证RNA的纯度，比值>1．8时，方可用于RT-PCR检测。

1．5 cDNA合成和PCR反应 取总RNA 1．5 μg，按逆转录试剂盒说明合成cDNA。PCR扩增条件：总体积50 μl，10×PCR buffer 5．0 μl，25 mmol MgC12 3．0 μl，10 mmol dNTP 1．0 μl，10 pmol/μl TGF-β1引物1．0 μl，10 pmol/L β-actin引物1．0 μl，5 U/μl Taq酶0．4 μl，cDNA模板2．5 μl，蒸馏水36．1 μl。PCR扩增循环参数为：94℃5 min变性，94℃ 20 s，68℃20 s，72℃1 min，循环35次，72℃延长反应5 min。取扩增产物5μl，2．3％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察结果。

1．6 结果判断 电泳结果在紫外光下采像，并应用凝胶电泳图像分析系统分析，用目的基因/内参β-actin两电泳条带的单位面积内的灰度比值/A值(即半定量)来反映目的基因的相对表达水平。计算公式为：目的基因相对表达水平=(目的基因灰度值-背景灰度值)/(内参β-actin度值-背景灰度值)。表达水平相对A值≥1．83为高表达。

1．7 免疫组织化学法 采用SP法进行染色，实验步骤按试剂盒说明。4 μm切片，经柠檬酸缓冲液微波修复15 min，DAB显色、苏木精复染，中性树胶封固，TGFβ1抗体工作浓度1∶200，PBS 代替一抗作阴性对照，DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封片。染片背景清晰，肿瘤细胞胞浆和/或胞核出现棕黄色为阳性，随机选取10个高倍视野(×400)，计数1000个癌细胞计算阳性细胞率，阳性细胞率0~5％为阴性(-)，5％~25％为弱阳性(+)，25％~50％为阳性(++)，50％以上为强阳性(+++)。“+”视为低表达，“++”及“+++”视为高表达。

1．8 统计学分析 应用SPSS10．0 统计软件包，进行χ2 检验，P

2 结果

2．1 TGFβ1 mRNA表达情况 96例乳腺癌中40例(45．83%)呈高表达，明显高于乳腺良性增生组织(4/15，26．67%)和正常乳腺组织(1/11，9．09%)，前者与后二者差异有统计学意义(P

2．2 TGFβ1蛋白表达情况 60例乳腺癌石蜡组织中有40例呈阳性表达(66．67%)，明显高于乳腺良性增生组织(5/15，33．33%)和正常乳腺组织(2/11，18．18%)差异具有统计学意义(P

2．3 TGFβ1 mRNA及蛋白表达与乳腺癌临床指标的关系 由表2可见，TGFβ1 mRNA与蛋白表达与肿瘤大小、临床分期、ER、PR 表达均无关，而在乳腺癌腋淋巴转移组TGFβ1 mRNA及其蛋白高表达率分别为64．29％(36/56)、57．14％(20/35)，均明显高于无腋淋巴结转移组的20．00％(8/40)、24．00％(6/25)，两组表达的差异有统计学意义(P

3 讨论

TGFβ是人体多种组织细胞内的一类多功能的多肽类生长因子，广泛参与各种病理生理过程,对细胞的增殖与分化、细胞外基质的产生、创伤的愈合、胚胎发育、血管生成、细胞凋亡及机体免疫系统均有着重要作用[8]。TGFβ1是TGFβ家族的成员，是人体内主要的存在形式。TGFβ1在许多细胞中具有广泛复杂的作用,对于正常上皮细胞发挥普遍的生长抑制效应，控制细胞生长促进细胞凋亡； 而对于肿瘤细胞则起双向调节作用，在肿瘤形成早期能抑制肿瘤形成,而在肿瘤的发生、发展过程中则有促进作用[9]。在多种肿瘤中表达增高，TGFβ1表达上升和对作为生长抑制因子的TGFβ1失去反应性与组织恶性转化及进展相关。

本研究发现：TGFβ1 mRNA及蛋白在乳腺癌过表达，高表达率明显高于乳腺良性增生组织和正常乳腺组织，差异有统计学意义(P

本实验还显示，TGFβ1 mRNA及蛋白表达与肿瘤大小、临床分期、ER、PR 表达均无关，而与乳腺癌腋淋巴结转移密切相关。这可能晚期乳腺癌细胞可能分泌更多的TGFβ1，抑制正常上皮细胞增殖,刺激成纤维细胞生成和细胞外基质合成,血管形成，抑制免疫反应[11]，从而利于自身转移；也可能乳腺癌细胞通过其TGF β1受体的表达缺失或功能丧失而逃逸了TGFβ1的抑制增殖作用，而具有恶性浸润转移能力。

本研究结果初步表明，TGFβ1在乳腺癌中过表达在乳腺癌发病发展过程中起重要促进作用，同时也提示TGFβ1基因可能是乳腺癌的重要促淋巴转移因子，有望成为治疗的靶标及有价值的预后判断指标。

参考文献

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