循环肿瘤细胞在乳腺癌中的临床意义

1循环肿瘤细胞的定义

循环肿瘤细胞是存在于外周血中的肿瘤细胞，大部分研究者对循环肿瘤细胞的研究源于对播散肿瘤细胞的研究，而播散肿瘤细胞都存在于骨髓中。有研究已经表明，骨髓中检测到播散肿瘤细胞的患者与未检测到播散肿瘤细胞的患者相比，前者在诊断时往往肿块较大，恶性程度较高，淋巴结转移率、远处转移率及癌症相关病死率均高[2]。此外，经过全身治疗后，检测播散肿瘤细胞，发现它的出现可以增加复发转移的风险、减少无病生存期及降低乳腺癌的总生存期[3]。虽然对播散肿瘤细胞已经有深入的研究，但有一些研究表明，在原发性和转移性乳腺癌中，播撒肿瘤细胞和循环肿瘤细胞存在着一定的联系[4，5]。因为多数患者尤其是病重患者骨髓采样比较困难，重点应放在推进循环肿瘤细胞的研究中。一般认为转移发生在癌症进展的晚期；然而，通过检测循环肿瘤细胞/播撒肿瘤细胞发现，转移在癌症的早期就已经发生，循环肿瘤细胞/播撒肿瘤细胞已经在早期乳腺癌患者中被检测到。

2检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞的临床意义

2.1CTC在转移性乳腺癌中的临床意义

乳腺癌是一种全身性疾病，在发病早期即可出现肿瘤细胞的全身扩散[6]，早期发现与治疗是治愈乳腺癌的关键。已有文献表明，乳腺癌患者外周血CTC可作为一个独立的预后因素，并且与复发转移有关。Cristofanilli等[7]利用CellSearch系统对177例转移性乳腺癌患者进行了前瞻性研究，发现治疗前存在CTC患者的无病进展期和总生存期均缩短。并通过分层分析，得出每7.5mL外周血中存在5个CTC作为可出现不良预后的最低值。Ignatiadis等[8]检测444例Ⅰ~Ⅲ期乳腺癌患者外周血CTC并进行了随访，中位时间为53.5个月，结果显示与CTC阴性患者相比，CTC阳性患者的局部复发率和远处转移率显著升高而无病生存期（disease-freesurvivalDFS）和OS显著缩短；应用COX多因素分析显示CTC和ER状态是DFS和OS的独立预测指标。紧接着一些研究得出了相似的结论[9]。进一步研究显示，在治疗中的任意时刻，只要CTC的数量增高，无病进展期和总生存期均缩短[10]。CTC的预后价值要优于肿瘤负荷、疾病表型和当前的成像方法[11]。

2.2CTC在早期乳腺癌中的意义

目前已经有一些关于CTC和早期乳腺癌的研究，应用最新的分子生物学技术检测CTC在外周血中的变化情况，可将CTC的阳性率从9.4%提高到48.6%[12-16]。Ignatiadis等[12]应用RT-PCR技术检测175例早期乳腺癌患者外周血中CK19、mammaglobinA和HER2变化情况，发现辅助治疗前外周血中CK19和mammaglobinA阳性患者的无病生存时间减少。Sandri等[13]应用CellSearchSystem技术检测56例乳腺癌患者术前外周血中CTC的阳性率，发现16/56（29%）例患者CTC阳性。Krishnamurthy等[14]发现在92例Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌患者中，有31%（25/81）的患者外周血中检测到一个或多个循环肿瘤细胞。其中有26%（7/27）的患者显示ER阳性；32%（14/44）的患者PR阳性；25%（1/4）的患者HER2阳性，31%（24/77）的患者HER-2阴性。29%（10/35）的患者淋巴结阳性，33%（15/46）的患者淋巴结阴性。此项研究显示，在Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌患者中CTC的存在情况与淋巴结的状态、肿瘤分级、肿瘤大小、受体情况有关。Wulfing等[15]应用密度梯度离心法和免疫磁珠分选法观察Ⅰ~Ⅲ期HER2阳性的乳腺癌患者外周血中的CTC，发现有48.6%（17/35）的患者外周血中检测到HER2阳性的循环肿瘤细胞，有12例患者显示HER2阴性。而HER2阳性患者的无病生存期和总生存期均明显下降。最近一项大型研究应用RT-PCR技术检测216例患者外周血HER2mRNA的表达，同样也得到了上述的结果[16]。

2.3CTC与治疗的关系

CTC检测的目的之一是将CTC的水平和疾病进展、治疗反应联系起来。研究发现，在早期乳腺癌患者中，CTC的下降取决于初期治疗和肿瘤对治疗的反应[17]。Apostolaki等[18]检测214例Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌患者外周血中CTC，发现HER2mRNA阳性者占21%，辅助化疗能够消除CTC（16/53，30.2%），治疗后外周血中仍存在CTC患者的无病生存期缩短。Pachmann等[19]一项关于辅助治疗的研究发现，CTC受全身化疗的影响，在化疗前后CTC数量增加10倍或是更多可增加患者复发转移的概率。

3循环肿瘤细胞的检测方法

3.1富集方法

主要包括ISET法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选三种方法。ISET（isolationbysizeofepithelialtumorcells）又称膜滤过分离肿瘤细胞技术，是用滤过膜将肿瘤细胞从外周血中分离出来的一种方法。可使得较小的循环肿瘤细胞从滤过膜中丢失，而较大的白细胞被保留下来，造成此方法的特异性及敏感性均较低。目前，此种技术已经很少应用。密度梯度离心法，又称区带离心法，即依据不同类型细胞的沉降系数不同进行分离，可以同时使样品中几个或全部组分分离（一般使用Ficoll、Lymphoprep或其他相似密度的分离液），具有良好的分辨率。在此基础上建立起来的OncoQuick方法，是用一种专用的50mL的试管，内置多孔屏障，密度梯度分离液位于其下。肿瘤细胞掺杂实验显示，OncoQuick筛选出单个核细胞的能力要优于Ficoll。免疫磁珠分选法（immunomagneticseparation，IMS）的原理是将磁珠作为抗体的载体并与抗体结合后，抗体再与抗原结合，形成抗原-抗体-磁珠复合物，将其放在磁场中，在磁力的作用下而发生力学移动，将磁珠复合物与其他物质分离，达到分离特异性成分的目的。利用这种方法能对循环肿瘤细胞进行检测和计数，但其易出现假阳性。

3.2检测技术

主要包括细胞计数的检测方法和以核酸为基础的检测技术。细胞计数的方法主要包括CellSearch系统、酶联免疫斑点技术、CTC芯片法（CTC-chip）、FAST光纤阵列扫描技术、免疫细胞化学法、激光扫描方法（LSC）、流式细胞技术等。CellSearch系统目前已广泛应用于各期乳腺癌患者的临床研究中[11]，研究表明，该系统具有极高的批内和批间分析精确度、仪器间吻合度、敏感性、特异性和可重复性，细胞回收率平均可达>80%[20]。以核酸为基础的检测技术主要包括以检测脱氧核糖核酸（DNA）为手段的巢式PCR、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、FISH检测等技术。其中巢式RT-PCR的敏感性及特异性较高，且中间产物不易被降解。而RT-PCR中RNA易被降解，其又存在假阳性及假阴性。在此基础上便出现了实时定量PCR，它可以对扩增产物进行准确的定量，同时操作步骤较RT-PCR简便。FISH检测的优点在于使用传统分子生物学方法检测肿瘤组织的DNA，FISH在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在的位置。近年来，FISH方法在CTC领域中也得到了广泛的应用[21]。此外，联合检测技术已经成为一种趋势，可以弥补单一检测方法的不足，使结果更具有准确性。在乳腺癌中，标志物的检测也日趋成熟，近年来被用来检测乳腺癌外周血CTC的标志物主要有：CK-19、HER-2、SBEM、MTDH、mHam等。

4小结与展望

CTC作为早期和转移性乳腺癌患者独立预后的因素，并作为检测治疗疗效的指标，可指导临床医生预测早期乳腺癌患者复发风险，并可使乳腺癌患者从辅助化疗中获益；同时应用CTC的分子和基因表型特征，可指导临床医生选择有效的化疗方案。外周血循环肿瘤细胞的检测作为一种具有高度可行性和可重复性的非侵入性新型诊断工具，在对实体肿瘤微转移的早期诊断、疗效及预后评估中的作用是显而易见的。随着检测技术的不断改进，敏感性和特异性的不断提高，循环肿瘤细胞检测必将在临床肿瘤诊治中得到推广应用。

作者：杨健 郝辉 单位：沧州市人民医院