应用酶催化动力学

市场上销售的祛斑美白类化妆品绝大多数都是通过抑制酪氨酸酶的活性而起作用的，因此，检测其对酪氨酸酶活性的抑制强度是评价其功效的模式之一。

吸光光度法具有快速、灵敏和准确等特点，已成为检测酶催化反应动力学的首选方法。由于化妆品的一些特性（成分复杂、多为乳化型、无公认的标准品等），应用吸光光度法检测美白化妆品的实验中曾遇到一些问题，就将几个主要问题的解决方法简介如下。

一、 乳化型样品的预处理

消费者使用的是由生产厂家将多种原材料复配后的最终产品即市售的化妆品（成品），而不是某种添加剂，所以，检测美白的功效应测定化妆品（成品）。

然而，大多数美白类化妆品都是乳化型的，此种剂型不能直接应用于光度法检测，必须预先做相应处理。

1．测相型

检测乳化型化妆品的相型，如果是O/H型可以与水溶性添加剂和非乳化型化妆品一样直接进行下一步操作。如果是H/O型，则采用转型操作法使其转成O/H型。

2． 溶解、稀释

称取定量（W）样品放入定量（V）去离子水或三蒸水（应无铜离子）中，充分搅拌使之完全溶解。

3． 沉淀

经沉淀等处理后可获得能用于光度法检测的澄清液，其透光度可达到100%（极少数接近100%）并保持添加剂的原有活性。

二、 实验对照的设置

1．阴性和（或）空白对照 遵照实验室工作常规设置以溶剂（去离子水，PB）和含有不同溶质（酪氨酸酶，多巴）的溶液为阴性对照，以鉴别误差和用于计算分析。

2． 阳性对照 本对照管内含有全部反应物（酶及酶催化底物）而无酶活性抑制物，所以，与其它管比较，其酶活力最强，反应速度最快、反应产物最多。

本对照至关重要，可作为判定下述内容的依据。

1） 判定检测体系（试剂、仪器、操作）是否准确。

2） 判定参考标准对照是否正确。

3） 判定被检样品有无干扰。

3． 参考标准对照

实验操作应有标准品对照，在尚无公认的祛斑美白类化妆品标准品之前我们选用已知的种类和浓度的添加剂曲酸（kojic Acid）作为参考标准对照。曲酸的美白作用机理清楚、量效相关性好，抑制强度适中等特性适宜做对照品。

检测时以2%的曲酸作为标准浓度，根据需要实测时再做不同浓度的稀释。

三、 判定指标的采集及应用

1． 实验条件（温度、PH值和离子强度等）固定情况下，酶催化反应过程中酶的活性具体表现为一条时间与反应产物（生成物）产量相关的动力曲线，即酶的活力越强，反应速度越快，（完成反应的时间越短），反应产物的量越多。我们可以在这条线上任一个点采集时间和产量的相关数据。如：在反应后达到一定的OD值（0.3、0.5和1.0）的时间；达到最终反应的时间；不同时间（5min、10 min、20 min ... ...）的OD值；反应终止时的OD值。

2． 将阳性对照不同浓度的参考标准对照与样品的上述结果进行比较即可判断出样品抑制酪氨酸酶活性的强弱程度。具体方法可选用：

1） 抑制率比较法

以阳性对照为对照，计算出参考标准对照和被测样品的抑制率。

根据参考标准对照的结果调配酶的用量，使2%曲酸（SIGMA501-30-4）的抑制率尽量接近50%，将实测结果定为100%，再将样品实测结果也乘以相同倍数得到调整后的抑制率为最终结果。

如能保持实验条件的稳定性，可以不做参考标准对照，直接读取样品的抑制率。

2） 图（表）比较法

将2%曲酸和被测样品作同倍稀释后，再将曲酸溶液作3次高倍稀释。将4份不同浓度的曲酸溶液进行检测，将前述所得判定指标绘成坐标图（时间为横坐标，OD值为纵坐标），再以相同条件检测样品，将所得结果也填在图上。由于其所处区域的不同，可一目了然地判定出对酪氨酸酶活性的抑制强度。也可将所得结果列表进行比较。

3）样品抑制酪氨酸酶活性强度的表述可用文字或数字表述。)

样抑制酪氨酸酶活性的强度分为：

强＞较强 ＞较弱 ＞弱；

好＞较好 ＞差；

90%以上＞80%以上＞70%以上＞60%以上＞59%以下；

80%以上＞60%以上＞59%以下

四、 干扰现象的鉴别

实验发现有的添加剂的抑制酪氨酸酶活性的程度在复配后可有所增减，这种现象称为"干扰"，增强时称为激动干扰，减弱的称为抑制干扰。检测时必须加以鉴别，我们采用同时检测添加剂，含不同浓度添加剂的化妆品和阳性对照，对比其结果即可判明有无干扰及其类型。

判定出干扰的有无及其类型有实用价值，首先有助准确判定被检样品对酪氨酸酶活性抑制的真实强度；其次，有助筛选出能产生激动干扰（如能增强功效的话）的配方和生产出相应的产品，这是生产者和使用者共同希望的。