急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征基因治疗进展

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）及其严重阶段急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是严重威胁患者生命的常见危重症，其主要的病理生理改变是弥漫性肺毛细血管内皮-肺泡上皮屏障功能的破坏及炎症损害，临床表现为呼吸衰竭。尽管药物治疗和呼吸支持治疗有一定的进步，但ALI的病死率仍高达40%［1］，尚缺乏根本而有效的治疗手段。随着对疾病发病机制认识的深入，基因在ALI发病机制中的地位逐渐凸显出来，以病毒及非病毒系统为载体的基因治疗在调控肺内的炎症反应、肺水清除、改善内皮功能及减少肺纤维化、促进肺损伤的修复过程中发挥了显著的作用，为ALI/ARDS的治疗提供了新的途径。

1 基因在ALI/ARDS发病机制中的地位

ALI/ARDS的发生发展是环境因素和遗传因素综合作用的结果，发病机制复杂。常见导致ALI/ARDS发生的危险因素包括肺内源性因素如肺炎、误吸等，和肺外源性因素如全身性感染、创伤、烧伤、休克等［2］。然而，在接触危险因素的人群中，仅有部分患者发展成为ALI/ARDS，并最终死于ARDS，而且即便是同一危险因素对人体的打击程度相同，不同个体对ALI/ARDS的易感性及预后也不同，推测基因在人类对ALI/ARDS的易感性及预后中扮演了重要的角色［3］。目前发现与ALI/ARDS发生发展相关的基因位点约有17个，它们参与机体免疫炎症反应、氧化应激、凝血、血管功能损伤等过程，并最终影响ALI/ARDS的发生、严重程度及患者的预后［4］。

1.1 基因影响ALI/ARDS的易感性

目前发现有多个基因位点的基因多态性与ALI/ARDS易感性相关，主要包括血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因多态性、表面活性蛋白B（surfactant protein-B，SP-B）基因多态性等。ACE基因位于人类第17对染色体长臂3区5带（17q35），其基因型包括3种：插入型纯合子I/I、删除型纯合子D/D和杂合子I/D。D/D基因型患者的ACE表达高于I/I基因型患者，在ARDS患者中D等位基因出现的频率远高于对照人群［5-6］。SP-B是防止肺泡塌陷，维持正常肺功能的重要物质［7］。SP-B是由2号染色体短臂上的单基因编码，其基因组序列具有特征性，不同人群第4个内含子内CA单核苷酸串联重复序列数不同， ALI/ARDS患者重复序列出现的频率比健康对照组高［8］。此外白细胞介素（interleukin，IL）IL-6、IL-10基因多态性也与ALI/ARDS的发生相关［9-10］。提示存在这些基因位点多态性的患者更容易发生ALI/ARDS。

1.2 基因影响ALI/ARDS的严重程度

研究发现IL-8、IL-10及核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）基因多态性与ALI/ARDS的严重程度相关。IL-8基因多态性位点251位A等位基因合成IL-8比T等位基因明显增加，患者病情重，机械通气时间延长［11］。而IL-10基因型为1082GG的患者病情严重程度降低，器官功能障碍的程度亦降低［12］。NF-κB是重要的导致炎症反应的核转录因子，其多态性基因位点的插入缺失突变影响ALI/ARDS患者的严重程度，而与患者预后无关［13］。

1.3 基因影响ALI/ARDS患者的预后

目前与ALI/ARDS患者预后相关的基因包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和ACE2。SOD是一种抗氧化酶，SOD基因位于4号染色体上，其基因多态性来源于编码区编码精氨酸的序列被替换为甘氨酸序列，则细胞内SOD的产生将增加10倍，抗氧化作用加强，患者预后改善［14］。ACE D/D基因型患者不仅与ALI/ARDS易感性相关，也影响患者的预后，含有此类基因型的ALI/ARDS患者预后差［6］。

可见，ALI/ARDS的发生发展与基因异常表达密切相关，提示ALI/ARDS的治疗不应该仅停留在器官功能支持层面上，基因治疗可能是其重要的治疗策略之一。

2 ALI/ARDS基因治疗策略

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因或核苷酸序列通过一定方式导入靶细胞或组织以纠正基因的缺陷或者改变某一特定产物的表达，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。可分为胚胎细胞基因治疗和成体细胞基因治疗［15］。

2.1 ALI/ARDS基因治疗的优势

ALI/ARDS采用基因治疗具有一定的优势［16］：（1）ALI/ARDS是一个急性发作并且病程相对短暂的综合征，仅需短疗程基因治疗，无需反复给药诱发机体的免疫炎症反应；（2）气道上皮和远端肺泡上皮可以通过气道内给药，靶向作用好；（3）心脏泵出的血液需通过肺循环才能到达全身各处器官，因此通过静脉给药对肺微血管内皮细胞也具有较好的靶向作用；（4）基因治疗可针对ALI/ARDS的不同时期发挥治疗作用；（5）基因治疗可特异性地针对ALI/ARDS损伤和修复的某一机制如凝血、氧化应激、上皮间充质转化等发挥靶向治疗作用。

2.2 ALI/ARDS基因治疗的分类

ALI/ARDS基因治疗按基因操作方式分为两类：一类为基因修正和基因置换，即在原位将缺陷基因的异常序列进行精确的修复。通过同源重组技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强和基因失活，即不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达［17-18］。此外，通过药物等方式调节细胞或组织器官的外遗传机制如DNA的甲基化、非编码RNA、及组蛋白翻译后修饰（甲基化、乙酰化、磷酸化）亦可达到增高或降低某一特定基因表达的目的［19］。尽管ALI/ARDS的发生可能与患者存在某种易感基因相关，但目前ALI/ARDS的基因治疗主要依赖第二类方法来改变肺组织局部相关产物的表达，从而促进肺损伤的修复。

2.3 ALI/ARDS基因治疗的载体选择

理想的载体不仅能够高效地向靶细胞转染较大外源性基因片段，防止其被核酶降解，还需调节外源基因在细胞内的表达，并且不产生插入突变，不引起免疫炎症反应等不良反应。目前常用载体分为病毒载体和非病毒载体两大类［18］。

2.3.1 病毒载体

腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等是目前常用的病毒载体。腺病毒具有嗜上皮性，在ALI 的治疗过程中可能会导致一过性的肺泡上皮损伤，诱发免疫炎症反应［20］。逆转录病毒仅能转染分裂期细胞，对静止期细胞转染效率低，其应用受到一定限制［17］。腺相关病毒是一种有DNA缺陷的非致病性细小病毒，具有安全性好、宿主范围广等优点，目前已成为基因治疗研究的热点［21］。

2.3.2 非病毒载体

质粒、脂质体、寡聚核苷酸等非病毒载体在ALI/ARDS中也有较多的应用。它们成本低、安全，但其转染效率较病毒载体低［16］。近年来ALI的细胞治疗尤其是干细胞治疗发展迅速，目前已进入临床实验阶段，以细胞为基因载体的治疗形式亦得到较好的发展，不仅转染效率高，而且减轻免疫炎症反应，与细胞治疗具有协同作用，因而具有广泛的前景［22］。

3 基因治疗在ALI/ARDS治疗中的应用

ALI/ARDS的基因治疗主要通过携带肺保护基因至损伤肺组织，在局部高表达或沉默相关基因，抑制肺部炎症反应，促进肺水清除，改善内皮细胞功能，减轻肺纤维化，阻断ALI/ARDS发生发展的病理生理进程，促进肺损伤修复而达到治疗的目的。

3.1 基因治疗促进肺水肿液清除

通过基因转染促进肺水肿液的清除，从而纠正低氧是ALI/ARDS的重要治疗措施。肺水肿的发生不仅与肺毛细血管内皮-肺泡上皮屏障的破坏相关，还与肺泡上皮细胞肺水清除功能下降有关［23］。研究表明，在肺泡上皮细胞上存在多种离子通道，包括Na+通道（ENaC）、Na+-K+-ATP酶、K+通道等，随着Na+的转运可促进水的清除。不仅如此，角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）也可促进肺水的清除［24］。研究发现通过各种基因转染方法可使ENaC、Na+-K+-ATP酶及KGF等基因高表达，从而增强肺水转运而减轻肺水肿。

病毒载体介导的基因转染可显著促进肺水肿的吸收。目前已证实，在正常大鼠及呼吸机相关的ALI大鼠及高氧诱导的ALI大鼠的治疗中发现，由重组腺病毒介导的基因转染Na+-K+-ATP酶的α2亚基和β1亚基，可明显促进肺水清除［25-26］。Qiao等［23］通过慢病毒向分离的原代肺泡上皮细胞转染Na+-K+-ATP酶的β1亚基，亦可以增加Na+-K+-ATP酶的活性，促进肺水清除。

非病毒载体亦可承载促进肺水清除相关的基因。Stern等［27］的研究发现由脂质体介导的Na+-K+-ATP酶的α亚基和β亚基基因转染可减轻硫脲诱导的小鼠肺水肿的程度，而输注脂质体导致的肺部炎症反应轻微。脂质体还可转载KGF基因减轻油酸诱导ALI小鼠的肺损伤［28］，但较腺病毒转染效率低，效果差［29］。此外，电穿孔法可以直接把的DNA转入小鼠肺组织，不仅可以减轻内毒素诱导小鼠肺水肿，还可减少中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，减轻肺组织的损伤程度［30］。可见，非病毒载体系统可介导基因转染促进肺水清除。

3.2 基因治疗抑制肺部炎症反应

失控的炎症反应是ALI/ARDS发生发展的重要机制之一，调节肺部及全身的炎症反应是ALI/ARDS基因治疗的重要方向。

基因治疗调节ALI/ARDS过度的炎症反应主要是通过携带具有抗炎作用的细胞因子的基因至肺损伤组织局部高表达，从而发挥抗炎的作用。尽管病毒载体可诱导宿主发生免疫炎症反应，但应用腺病毒向ALI小鼠转染IL-10［31］、干扰素蛋白10（IP-10）［32］、IL-12［33］、转化生长因子β1（TGF-β1）［34］等细胞因子基因后，被证实具有较好的抗炎效果，免疫炎症明显减轻，肺损伤也有所修复，并且小鼠病死率也有所下降。

为克服病毒载体诱发并加重宿主的免疫炎症反应，以非病毒载体为转染介质也有长足的发展，传统的以脂质体为载体的基因转染尽管可以一定程度上减轻肺损伤，但由于其转染效率低，抗炎效果不佳。近年来以细胞为载体的基因转染在ALI的治疗中具有重要的作用， McCarter等［35］以及Xu等［36］的研究证实通过向成纤维细胞和间充质干细胞内转染血管生成素1基因，并移植入内毒素诱导的ALI小鼠体内，可明显减轻小鼠肺部的炎症反应及肺损伤程度，而由细胞本身诱导的小鼠肺炎症反应非常轻微。因此，以细胞为载体的基因治疗是ALI/ARDS的治疗未来的发展方向。

3.3 基因治疗改善肺微血管内皮功能

内皮功能受损是ALI/ARDS的重要特点之一，在ALI/ARDS发生过程中具有重要的作用。内皮功能受损主要表现为其分泌功能和屏障功能受损，导致肺部炎症反应和肺水肿发生。因此，调节内皮功能是ALI/ARDS的重要治疗靶点之一。

基因治疗对内皮功能也具有一定的调节作用。它主要是通过转染内皮相关基因至机体内，使其在局部高表达，从而达到治疗的目的。Chicoine 等［37］的研究发现，将载有诱导性一氧化氮合酶（induced nitric-oxide synthase，iNOS）的腺病毒通过气管内注射移植入大鼠肺内，大鼠肺动脉内皮收缩功能减弱，并呈现时间依赖性，大鼠肺动脉高压明显改善。McCarter等［35］把血管生成素-1基因转染入成纤维细胞使其高表达并移植入LPS诱导的ALI大鼠体内，大鼠肺血管内皮分泌iNOS、血红素氧化酶增加，而内皮素-1表达降低，细胞间细胞黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1的表达恢复正常，肺内皮通透性降低，炎症反应减弱，肺损伤减轻。因此，基因治疗可以调节肺血管内皮细胞功能，促进肺损伤修复。

3.4 基因治疗减轻肺纤维化

肺纤维化是ALI/ARDS发生发展的终末阶段，病程难以逆转，致死率高。目前主要的治疗是激素抗炎治疗，但疗效不佳，缺乏有效的治疗方法。近年来基因治疗为其提供了新的途径。研究发现，在博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型中，通过转染TGF-β1的RNA干扰片段，使小鼠TGF-β1基因沉默后小鼠肺纤维化程度明显减轻，肺功能增强［38］。在放射性肺损伤小鼠模型中，通过肌内注射载有可溶性肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）受体1的质粒后发现TNF-α的活性降低，肺纤维化减轻，免疫炎症反应轻微。不仅如此，以细胞为载体的基因治疗在肺纤维化中也得到了应用［39］。Aguilar等［40］在体外通过基因工程技术将KGF基因转染至间充质干细胞，并移植入博来霉素诱导的ALI小鼠体内，小鼠肺组织损伤减轻，后期肺组织内胶原沉积明显减少。此外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸的应用，亦可通过外遗传机制调控基因表达，发挥抗纤维化作用［41］。可见，基因治疗可以明显减轻肺纤维化。

4 ALI/ARDS基因治疗面临的挑战

尽管ALI/ARDS基因治疗已取得一定进展，但仍然还面临着许多挑战［16］。 （1）合适的治疗基因靶点的选择：目前影响ALI/ARDS的发生发展的因素很多，但选择合适的基因治疗靶点仍不确定；（2）载体的选择与改进：载体是介导基因治疗的重要工具，但在发挥治疗作用的同时也会对机体产生一定的不良反应，如诱导免疫炎症反应和宿主基因的插入突变和失活，因此对载体进行改进有利于提高基因治疗的安全性，也是基因治疗的前提所在；（3）目的基因的表达调控：对导入宿主细胞的目的基因的表达进行调控，有利于调控基因在不同的疾病状态下充分发挥治疗作用，是未来的研究方向；（4）基因治疗的靶向性：尽管ALI/ARDS的基因治疗具有一定的靶向性，但如何使目的基因在宿主基因某一特定部位进行插入整合仍是目前研究的难题。

总之，基因治疗在 ALI/ARDS治疗中的地位越来越受到重视，基因治疗可以通过抑制过度的炎症反应，促进肺水清除，改善内皮功能，减轻肺纤维化，从而减轻ALI /ARDS的严重程度并改善预后，但在治疗的靶向性、安全性等问题上仍然面临许多挑战，是今后重点的研究方向之一。

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（收稿日期：2012-11-06）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.03.001

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（81000828）；国家自然科学基金面上项目（81070049）；国家自然科学基金面上项目（81170057）

作者单位：210009 南京，东南大学附属中大医院重症医学科

通信作者：邱海波，Email： .cn

中华急诊医学杂志2013年3月第22卷第3期Chin J Emerg Med，March 2013，Vol.22，No.3

P229-P233