中华枸杞叶片离体再生技术初探

摘要：为探索中华枸杞（Lycium chinense Mill. var. chinense）叶片离体再生技术，通过设置不同消毒时间梯度，研究了0.1%升汞溶液对中华枸杞叶片的消毒效果;以MS为基本培养基，添加6-BA、2，4-D、IAA等激素，研究了不同激素浓度配比对中华枸杞叶片离体再生的影响。结果表明，用0.1%升汞溶液消毒叶片8 min，污染率最低，是中华枸杞叶片的最佳消毒时间。基本培养基中添加1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L 2，4-D是诱导愈伤组织的最佳激素浓度配比;基本培养基中添加1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA是诱导愈伤组织分化的最佳激素浓度配比;基本培养基中添加0.2 mg/L IAA +0.6 mg/L NAA是诱导丛生芽生根的适宜激素浓度配比。利用组织培养技术可有效实现中华枸杞叶片离体再生和快速繁殖，为其工厂化育苗和优良品种的选育奠定基础。

关键词：中华枸杞（Lycium chinense Mill. var. chinense）;叶片;离体再生;组织培养

中图分类号：R282.71;Q813.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）12-2928-04

Preliminary Study on Vitro Regeneration from Leaves of Lycium chinense

Mill. Var. Chinense

HOU Dian-yun，XU Hua-wei，LI Xue-lin，MA Zhan-qiang，SHI Jiang，ZHANG Gai-na

（College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， Hennan，China）

Abstract： To explore the vitro regeneration from leaves of Lycium chinense Mill. var. chinense， a gradient of different disinfection time have been set up to study the effect of the 0.1% mercuric chloride solution to disinfect the leaves of L. chinense Mill. var. chinense. Depending on the MS base medium， the plant hormones 6-BA，2，4-D and IAA were added in the MS. Through the orthogonal experiment， the effects of different plant hormones concentration ratio on the vitro regeneration from leaves of L. chinense Mill. var. chinense have been studied. The pollution rate was the lowest when the leaves were dealt with 0.1% mercuric chloride solution in 8 min（the best sterilization time）. MS medium with 1.0 mg/L 6-BA and 0.2 mg/L 2，4-D was the best hormone concentration ratio to induce callus. MS medium with 1.0 mg/L 6-BA and 0.1 mg/L NAA was the best hormone concentration ratio to induce callus differentiation. Using tissue culture technology can not only effectively achieve the vitro regeneration and rapid propagation from leaves of L. chinense Mill. var. chinense， but also lay foundation for industrialized seedling production and the seed selection.

Key words： Lycium chinense Mill. var. chinense; leaves; vitro regeneration; tissue culture

枸杞（Lycium chinense）为茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）多分枝灌木，是名贵的药食同源植物，全世界约有80个品种，多数分布在美洲，其中南美洲种类最多，欧亚大陆约有10种。我国有7个品种和3个变种，多数分布在西北地区和华北地区[1，2]。枸杞营养成分丰富，富含糖类、有机酸、氨基酸等物质，具有抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤和降血糖、降血脂等重要功能，在传统和现代医学领域具有广阔的应用前景[3，4]。中华枸杞是枸杞原变种（Lycium chinense Mill. var. chinense）的俗名，由于其果大、子少、皮薄、肉厚等特点，许多地方均引种栽培中华枸杞[5]，具有较好的经济效益。

枸杞为典型的异花授粉植物，其基因型高度杂合，长期的天然杂交和种子繁殖，导致现有品种混乱，不利于保持品种的优良特性，而枸杞常用的硬枝和嫩枝扦插技术经常出现植株生长势弱和早衰的现象，而且生根困难。植物组织培养技术在解决枸杞的优良品种选育和工厂化育苗等方面的研究逐步深入[6-13]。枸杞不同品种之间由于基因型的不同和生理类型的差异导致组织培养中对激素种类、浓度、生长环境和营养状况的要求也不同[8]。本研究以中华枸杞为研究对象，探索中华枸杞叶片离体再生技术，为其优良、抗逆新品种的选育奠定基础，也为其遗传转化体系的构建提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验中华枸杞是由河南省灵宝市天丰苗木有限责任公司提供的中华枸杞的幼嫩枝条，在实验室沙基中扦插培养，保持水分和适当光照，选择扦插苗的幼嫩叶片备用。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒 取中华枸杞幼嫩叶片用去离子水冲洗干净，再用70%乙醇浸泡10 s，再用无菌的去离子水冲洗2次，放入0.1%升汞溶液中消毒，设置4、6、8、10和12 min 5个消毒时间梯度，最后用无菌去离子水冲洗3～5次，备用。

1.2.2 愈伤组织的诱导 以MS为基本培养基，添加蔗糖3%，琼脂1%，pH 5.5～6.0，6-BA（6-苄基氨基嘌呤） 和2，4-D（2，4二氯苯氧乙酸），采用不同浓度组合进行试验（表1）。将叶片切成1.0 cm×1.0 cm小块，每瓶接种5块，每个处理接种10瓶，设3个重复，25 ℃恒温暗培养，2周后统计生成的愈伤组织数和出愈率。

1.2.3 愈伤组织的分化 以MS为基本培养基，添加蔗糖3%，琼脂1%，pH 5.5～6.0，6-BA和NAA（萘乙酸），采用不同激素配比进行试验（表2），每瓶接种6块愈伤组织，每个处理接种10瓶，设3个重复，25 ℃恒温培养，光照时间10 h/d，光照度1 500 lx，4周后统计愈伤组织的分化情况。

1.2.4 不定芽生根的诱导 以MS为基本培养基，添加蔗糖3%，琼脂1%，pH 5.5～6.0，NAA和IAA（吲哚乙酸），采用不同激素配比进行试验（表3），每个浓度处理接种10瓶，每个瓶内接芽6株。每个处理3个重复3，4周后统计生根率，记录生长状况。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对中华枸杞叶片外植体的影响

获得无菌外植体是组织培养能否成功的关键因素，采用0.1%升汞溶液对中华枸杞叶片进行消毒处理，设置5个消毒时间梯度。结果（表4）表明，0.1%升汞溶液消毒8 min效果最好，污染率和死亡率都最低，分别为12%和14%;消毒时间为4 min和6 min时，污染率较高，分别达到54%和48%;消毒时间超过8 min，虽然污染率较低，但死亡率却较高，消毒时间为12 min时，叶片的死亡率高达56%。

2.2 不同激素浓度配比对中华枸杞叶片愈伤组织诱导的影响

外植体接种在诱导愈伤组织培养基上生长结果见表5。由表5可知，处理9的出愈率最低，仅为42%，处理5接种的外植体诱导出愈伤组织较多，出愈率高达92%，明显高于其他处理的愈伤组织诱导率，为较适宜的激素组合。

2.3 不同激素浓度配比对愈伤组织分化的影响

不同激素浓度配比对中华枸杞愈伤组织分化的影响不同（表6）。由表6可知，处理5的愈伤组织分化率最高（92%），而且分化较快;处理1的分化率最低，仅为35%，而且随着培养时间的延长，大量愈伤组织褐化死亡;处理9的分化率也较低，为50%，因此激素浓度过高或者过低，都会不利于中华枸杞叶片愈伤组织的分化。处理5的激素浓度配比是诱导愈伤组织分化的最佳激素浓度配比。

2.4 不同激素浓度配比对不定芽生根的影响

中华枸杞为多年生木本灌木，其组培苗的生根相对困难。本研究中把丛生芽转接到含有IAA和NAA的生根培养基中，设置不同的激素浓度配比。结果表明，不同的激素浓度配比诱导丛生芽生根的能力不同，其中处理5（0.2 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA）的激素浓度配比生根率最高，为50%（表7）。

3 小结与讨论

枸杞属植物组织培养技术虽然已有报道[10-13]，本试验首次研究了中华枸杞的叶片离体再生技术，对于中华枸杞的快速繁殖和工厂化生产意义深远。

1）外植体污染是组织培养技术中的一个关键问题，能否控制污染直接关系到试验的成败。本研究通过设置不同消毒时间，利用0.1%升汞溶液对中华枸杞叶片进行消毒，当处理1和处理2消毒时间较短时，由于升汞溶液的重金属离子没有足够的时间与细菌蛋白结合并使细菌蛋白变性，因此结果显示叶片的污染率较高，而随着消毒时间的延长，当消毒时间达到10 min和12 min时，由于消毒时间过长，重金属离子在使细菌蛋白变性同时也侵入到叶片细胞内部并累积，最终对叶片细胞产生了毒害作用，尽管叶片的污染率不高，但由于重金属的毒害而造成的叶片死亡率却显著上升。本研究中选用的为中华枸杞扦插苗的幼嫩叶片，其较佳消毒时间为8 min，不同生长发育阶段的叶片对升汞溶液的耐受程度也不尽相同，都需要设置时间梯度进行研究。

2）激素是植物组织培养器官分化的关键因素[14]，形成器官的类型是由培养基中不同激素的相对浓度控制，而不是由这些物质的绝对浓度决定的[15]。细胞分裂素对植物的生长和发育有多方面的调节作用，如果细胞分裂素含量过高，则会抑制愈伤组织的形成[16]。本试验研究了不同激素浓度配比对中华枸杞叶片愈伤组织的形成、分化及丛生芽生根的影响。结果表明，基本培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D是诱导愈伤组织的最佳激素浓度配比，而基本培养基中添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA是诱导愈伤组织分化的最佳激素浓度配比。本研究中基本培养基中添加0.2 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA可以有效诱导丛生芽生根，但生根率仅为50%，而且获得的不定根长势也不好，可能是培养过程中光照不足，或生长素的浓度偏低，后续试验需要进一步完善不定芽的生根技术，并进行组培苗的驯化、移栽研究。

建立稳定的植物组织培养或细胞培养系统是进行遗传转化操作的基础，枸杞为双子叶植物，其高杂合性、多倍性和无性生殖等特点使其成为生物反应器的首选，而且以枸杞为材料易于遗传操作，可以长期栽培生长，遗传性状稳定[17]。因此，针对不同基因型的枸杞构建其成熟的遗传转化系统，为枸杞品种改良开辟一条新的途径，也为枸杞转基因和生物反应器的研究奠定了基础。

参考文献：

[1] 宁 娜， 韩建军. 地骨皮的化学成分与药理作用[J].现代药物与临床，2010，25（3）：172-176.

[2] 李彦龙，樊云芳，戴国礼，等.枸杞种质遗传多样性的AFLP分析[J].中草药，2011，42（4）：770-773.

[3] 郑国琦，胡正海. 宁夏枸杞的生物学和化学成分的研究进展[J].中草药，2008，39（5）：796-800.

[4] 杜 毅， 高 华，班长俊，等.枸杞的化学与药理研究新进展[J]. 内蒙古中医药，2000（4）：40-41.

[5] 张学峰，赵德辉，官方明. 韩国大果枸杞的引种试栽表现[J].特种经济动植物，2009（2）：37-38.

[6] RATUSHNYAK Y I，PIVEN N M，RUDA V A.Protoplast culture and plant regeneration in Lycium barbarum L.[J]. Plant Cell， Tissure and Organ Culture，1989，17（2-3）：183-190.

[7] RATUSHNGAK Y I，RUDA V A，PIVEN N.Regeneration of Lycium barbarum L. plants from leaf tissue，callus culture and callus protoplasts[J]. Plant Cell Reports，1990，9（2）：84-87.

[8] 史 伟，陈志国.枸杞组织培养的研究进展[J].草业与畜牧， 2006（10）：5-8.

[9] DUANL J，ZHOU J，CAO Y L.Prelominary study on the another culture in Lycium barbarum L.[J].Agricultural Science & Technology，2008，15（5）：130-141.

[10] 郭 辉，沈宁东.宁夏枸杞不同外植体离体培养芽形成的研究[J].北方园艺，2008（9）：168-170.

[11] 包振华， 郭军战， 周 玮，等.枸杞组织培养再生体系优化[J].西北林学院学报，2010，25（5）：73-76.

[12] 唐晓杰， 孙 萍，马德宝.枸杞组织培养快速繁殖技术[J].北华大学学报（自然科学版），2011，12（2）：204-207.

[13] 乔永旭，张永平，张红心，等.宁夏枸杞再生体系的建立[J]. 江苏农业科学，2011（1）：72-74.

[14] JONES G E. Chromosomen numbers and phylogenetic relationships in the araceae [D].Virginia：University of Virginia，1957.

[15] SKOOG F，MILLER C O.Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultivated in vitro [J].Symp Soc Exp Biol，1957（11）：118-130.

[16] CHEN L，ZHU X，GU L，et al.Efficient callus induction and plant regeneration from anther of Chinese narcissus（Narcissus tazetta L.Var.chinensis Rome）[J].Plant Cell Rep，2005，24（7）：401-407.

[17] 杜国利， 宋长征，张更林，等.转基因植物表达HIV疫苗的研究进展[J].生物技术通讯，2005，17（3）：343-346.