慢性乙型肝炎患者外周血骨桥蛋白水平及其临床意义

【摘要】 目的 检测慢性乙肝患者的外周血骨桥蛋白（OPN）水平，研究OPN与慢性乙肝的关系其临床意义。方法 采用酶联免疫吸附试验方法检测8例健康对照者和47例慢性乙型肝炎患者的外周血骨桥蛋白水平，观察其在各组中的表达水平并探讨其在慢性乙肝疾病发展中的意义。结果 所有慢性肝炎组外周血OPN水平均高于正常组，OPN水平随肝脏炎症程度加重而增高，与反映肝脏炎症的生化指标呈正相关，与乙肝病毒的复制无关。结论 测定骨桥蛋白水平变化可评估乙肝患者肝功能状况及疾病的严重程度，对判断乙肝患者预后有一定价值。

【关键词】 骨桥蛋白；慢性乙肝；酶联免疫吸附试验

慢性乙肝是我国常见的慢性传染病之一，同时也是一个全球性的公共卫生问题，全世界共约3.5亿人感染乙肝病毒，且每年不断有新发感染者，而感染HBV后一旦慢性化后，病情迁延不愈，经过若干年后最终发展至肝硬化甚至肝癌，严重危害全人类的健康。然而，慢性乙型肝炎的致病环节仍未完全阐明，但病毒持续复制和机体免疫清除反应是发病的主要因素。

骨桥蛋白（Osteopontin OPN）是一种带负电的非胶原性骨基质糖蛋白，由多种组织细胞合成与分泌，广泛的分布于多种组织和细胞中，功能上具有细胞因子的特点，在多种疾病的发生、发展中起着重要作用。研究发现骨桥蛋白是免疫细胞募集及启动Th1细胞免疫的关键细胞因子，参与许多炎症反应的病理过程，与多个系统疾病发病有关。本实验通过检测不同程度肝功损害的人外周血骨桥蛋白水平，探讨其在慢性乙肝中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 55例患者取自广东医学院附属医院2009年4月-2010年1月间住院患者，其中单纯慢性乙型肝炎且无肝硬化者35例（轻度16例，中度9例，重度10例），男性32例，女性3例，年龄范围在17-70（平均年龄43.66±15.10）岁间，慢性重型乙型肝炎12例，男性10例，女性2例，年龄范围在24-63（平均年龄47.83±14.27）岁间，正常对照组8例，男性5例，女性3例，年龄范围在24-57（平均年龄36.63±10.50）岁间。慢性乙肝的诊断符合2005年中华医学会肝病分会、感染病分会修订的《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准，6个月内未接受过抗病毒治疗，排除血清学检测证实其他肝炎病毒感染或重叠感染者，排除非病毒感染如嗜酒、使用肝毒性药物等引起的慢性肝炎或隐源性肝炎。

1.2 实验方法

1.2.1 血样 用清洁试管收集血液，抽血30分钟后离心，1000×g15分钟，收集血清，分装后-20℃冷冻保存。

1.2.2 检测外周血OPN 采用酶联免疫吸附实验法（ELISA）技术检测。OPN试剂购自武汉博士德生物工程有限公司，使用美国宝特BIO-TEK ELX800型酶标仪检测，各项操作均严格按照说明进行。

1.2.3 检测各项生化指标 采用常规方法检测血清转氨酶、胆红素、白蛋白、A/G比值、胆碱酯酶、凝血酶原时间等，PCR法检测HBV-DNA载量。

1.3 统计学分析 计量资料均采用平均数±标准差表示，样本均数间用t检验或方差分析，相关性分析用Pearson相关，检验水准α=0.05，实验结果采用SPSS13.0统计软件进行分析。

2 结 果

2.1 各组血清骨桥蛋白水平比较 各组肝炎均高于正常组，与正常组比较存在显著差异。组与组间的两两比较均有统计学差异，见表1。

2.2 将肝炎患者按轻度、中度、重度、重型分组，分别与正常组的骨桥蛋白进行水平，除轻度组与正常组无统计学差异外，其余组均高于正常组且存在统计学意义。组与组比较均存在统计学差异，见表2。

2.3 肝炎患者外周血骨桥蛋白水平与肝功能各个指标之间的关系 骨桥蛋白与谷丙转氨酶没有相关性，与谷草转氨酶、总胆红素、凝血酶原时间呈正相关，与胆碱酯酶、白蛋白、A/G比值呈负相关，见表3。

2.4 慢性乙肝外周血OPN水平与乙型肝炎病毒（HBV-DNA）、HBeAg之间的关系 结果提示HBV-DNA、HBeAg复制变化分组之间不存在统计学差异，见表4。HBV-DNA复制水平分组之间也不存在统计学差异，见表5。

3 讨 论

目前认为HBV感染人体后出现的一系列改变与人体的免疫状态有关，主要是由细胞介导的免疫损伤引起的。乙型肝炎病毒感染及慢性化过程中有多种免疫细胞通过直接杀伤和分泌细胞因子抑制病毒，间接导致肝细胞的损害，产生炎症反应。目前Th1/Th2细胞因子分泌失调和树突状细胞（DC）数量及功能低下是乙肝慢性化机制中报道比较多的。HBV感染后Th0细胞可在不同的信号刺激下分化成为Thl或Th2细胞。Thl细胞是促炎性T细胞，HBV感染后分泌细胞因子能增强NK细胞、巨噬细胞以及特异性的CTL等免疫细胞的活性，使免疫攻击加强，清除病毒同时造成肝细胞损伤。HBsAg特异性的Th1细胞的缺陷导致HBV感染后中和性抗体的缺陷，使病毒不能被有效地清除，从而使HBV持续存在。Th2细胞则主要促进体液免疫，HBV感染后辅助B细胞分化为浆细胞，产生抗体，中和胞外病原体。研究表明HBcAg免疫后IL-10表达增强，而产生IFN-γ的CD4+T细胞数量很少。体内细胞因子IL-10的分泌增加可以拮抗Thl型细胞因子IL-2的分泌，导致机体对病毒的细胞免疫功能减弱，造成病毒的持续感染。刘骏[1]报道HBV感染患者体内Th1细胞的生物学功能及其细胞因子的产生均低下。慢性乙型肝炎病人外周血和肝脏中的单个核细胞（PBMC）产生IL-10的细胞比产生IFN-γ细胞明显增多。这些均提示慢性乙肝以Th2应答为主。DC将抗原提呈给未受抗原刺激的Th0细胞，同时分泌细胞因子IL-12等，调节Th0分化成Th1或Th2细胞。慢性乙型肝炎患者体内DC功能明显低下，不能将抗原的信号提呈给机体的免疫系统，造成患者体内缺乏有效的CTL应答，导致产生清除HBV效应失败，从而使患者HBV持续感染。慢性乙型肝炎的急性发作推测是Th1/Th2平衡的打破，Th1占优势，清除病毒的同时损伤肝细胞。邱庆明[2]研究证实慢性乙型肝炎急性发作时Th1细胞比例升高，与肝炎活动程度呈正相关。唐克诚[3]对慢性重型乙型肝炎患者不同时期的Th1/Th2细胞因子检测，发现不同病情阶段Th1与Th2反应细胞因子的表达水平不同，早期以IL-10分泌增多为主，晚期则以IFN-γ和IL-12水平大幅度提高为主。在肝炎活动期分别补充IL-l0及IL-12，肝脏炎症及病毒清除向不同的方向发展，IL-12明显增强慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞对HBeAg的应答和产生IFN-γ。体外实验也证实，骨桥蛋白能促进及调节其它免疫细胞的细胞因子表达。在体外培养的小鼠巨噬细胞中加入OPN，48h后可检测到高浓度的IL-12，而检测不到IL-10；与OPN+/+小鼠相比，OPN-/-小鼠注入乙烯聚合吡咯烷酮（PVP）所诱导的IL-12表达低95%，IFN-γ低90%。这是因为，骨桥蛋白又称为早期T淋巴细胞活化因子Ⅰ，具有促趋化作用，能引起巨噬细胞、T细胞和树突状细胞的迁移，在对抗感染的非特异性免疫及自身免疫中起一定作用。Higuchi Y[4]称OPN能促进CD4+T细胞的分化增殖，对CD8+T细胞能影响其迁移。Renkl等[5]证明OPN可以促进人的DCs激活、迁移，并诱导DCs的人白细胞DR抗原、粘附分子表达，并且增强其共刺激能力。在混合淋巴反应中，OPN促进DCs分泌IL-12、TNF-α，并且诱导DCs向利于原始T细胞Th1极化的方向成熟。

早期是在四氯化碳引起的急性肝炎模型中发现骨桥蛋白表达增高。Sahai A等[6]对非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的骨桥蛋白测定，发现该小鼠骨桥蛋白水平和mRNA水平均增高。这些均提示在炎症性肝病中骨桥蛋白表达增高，且与炎症的严重程度有关。既往骨桥蛋白与肝炎的关系的研究主要来自中毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎等。对于慢性乙型肝炎与骨桥蛋白的关系的单独研究则比较少。本实验检测了47例肝炎患者患者外周血骨桥蛋白水平，结果示总体慢性乙型肝炎组和慢性重型乙型肝炎组与正常组比较均高于正常组，且存在统计学意义。进一步分为慢性轻度、中度、重度、重型乙型肝炎，结果示除轻度肝炎组骨桥蛋白水平稍低于正常组水平且没有统计学差异外，其余组与正常组比较均高于正常组且存在统计学差异，而且组与组间比较同样存在统计学意义，骨桥蛋白水平随着肝炎严重程度增加呈增高趋势，尤其慢性重型乙型肝炎组增高显著。与文献报道一致。Matsui A[7]证实暴发型肝炎患者的骨桥蛋白水平明显高于急、慢性肝炎及健康人，II期肝性脑病及病程10天内出现典型肝坏死者，骨桥蛋白水平升高更明显。Arai M等[8]对暴发性肝衰竭和自限性肝炎患者血浆骨桥蛋白水平测定，发现前者明显高于后者，均支持本研究结果。本实验并对反映肝炎活动的多个指标与骨桥蛋白水平的关系进行了进一步研究，证实骨桥蛋白与谷草转氨酶、胆红素、白蛋白、凝血酶原时间、胆碱酯酶等部分反映肝脏功能的指标关系密切，肝脏炎症分度越重，骨桥蛋白随上述指标损害加重有增高趋势，与谷丙转氨酶、乙肝病毒载量无关。潘留兰[9]等对乙型肝炎肝硬化患者外周血骨桥蛋白水平测定并分析提示慢性乙肝病毒感染性慢性肝脏疾病发生发展与细胞因子骨桥蛋白水平变化相关，支持该实验结果。综合上述资料认为骨桥蛋白与肝炎的关系主要通过各种免疫细胞和细胞因子来起作用，尤其在重型肝炎中水平明显增高，同时有报道[10]应用骨桥蛋白的小干扰RNA（siRNA）可以减少刀豆蛋白A（Con-A）处理的小鼠肝坏死，那么在临床中也许可以通过监测骨桥蛋白水平的变化来判断慢性乙肝向重型肝炎发展的倾向。

参考文献

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