高效吡啶降解菌的筛选及其降解条件研究

摘要：从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离筛选出了1株能以吡啶为唯一碳源、氮源的菌株，通过形态观察、生理生化试验和16S rDNA序列同源性分析对菌株进行了初步鉴定，确定该菌株为假单胞菌，命名为PY6。选用四因素三水平L9（34）正交实验表设计了实验，研究了吡啶初始浓度、温度、摇床转速以及pH值4个因素对菌株PY6降解能力的影响，结果表明：当吡啶初始浓度为40 mg/L、温度为25℃、摇床转速为160r/min、pH值为7.5时吡啶去除率最高，达91.64%，说明此菌株为1株高效吡啶降解菌。

关键词：吡啶；生物降解；气相色谱；正交试验

中图分类号：X12文献标识码：A文章编号：16749944（2013）02013404

1引言

氮杂环化合物广泛存在于焦化、医药、染料、食品加工和农药等工业废水中，在焦化废水中占40%左右，而且大都是有毒且难降解的有机物，不易受代谢过程的破坏，对生态系统和人类健康会产生潜在的长期危害＼[1～4＼]。吡啶是目前氮杂环化合物中开发与应用范围最广的化合物之一，是重要的工业原料，对神经有致毒作用，水溶性和扩散性好。由于其毒性大，具有致畸、致癌和难生物降解等特点，致使传统生物处理方法对其降解效果不佳＼[5＼]，因此筛选高效稳定的专属降解菌成为国内外研究的热点＼[6～9＼]。

本研究从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离得到了一株吡啶降解菌，对其进行性能测试和菌株鉴定，并选用四因素三水平L9（34）正交试验对其进行培养条件优化，得到最佳培养条件，为含吡啶废水的生物强化处理提供了新菌株材料及其基本特性参数。

2材料与方法

2.1菌源

从处理吗啉废水SBR反应器（进水COD浓度2466mg/L，TN为435mg/L， COD和TN去除率分别稳定于90.12%和76.41%左右）里驯化成熟的活性污泥中筛选出的能以吡啶为唯一碳源、氮源的4株优势菌种。

2.2培养基

（2）液体测试培养基：KH2PO4， 2g；MgSO4·7H2O，0.04g；FeCl3.6H2O， 0.004g；10mL相应浓度的吡啶储备液定容至1000mL，调pH值至7.0，121℃高温灭菌20min，待放凉加入10mL浓度为2000mg/L（3000mg/L）的吡啶储备液，此时培养基浓度为20mg/L（30mg/L）。

（3）吡啶储备液：移取2.00g（3.00g）相对密度为0.98（20℃）的吡啶至1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容。此时吡啶储备液的浓度为2000mg/L（3000mg/L）。

2.3吡啶降解菌株的富集驯化

取250mL锥形瓶，在无菌操作条件下将实验室已分离出的4株以吡啶为唯一碳源、氮源的优势菌种以10%的接种量接种于150mL吡啶浓度为20mg/L的液体测试培养基中，于30℃ 、180r/min下好氧振荡培养120h，每隔24h测定菌株OD600，确定菌株生长曲线。本周期驯化结束后，将测试培养基中的菌株按10%的接种量接种到富集培养基中培养24h进行富集，再进行新一周期的驯化，持续数周期。然后将底物浓度提高到30mg/L，筛选出适应性较强的菌株继续驯化，通过筛菌过程中对菌株生长曲线的观察以及对吡啶分解利用情况的监测，挑选耐受能力和降解能力最高的菌株作为下一步实验的优势降解菌。

2.4菌株鉴定

2.4.1形态及生理生化鉴定

菌株形态观察和生理生化特征实验包括接触酶实验、液化明胶实验、淀粉水解、葡萄糖发酵实验、吲哚试验、乙醇氧化实验、脲酶实验、甲基红实验、V-P实验、温度、pH值实验，操作步骤参照文献＼[10＼]。

2.4.216SrDNA基因片段分离与序列分析

以TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取的细菌基因组DNA作为PCR反应模板，16Sr DNA序列分析采用通用引物＼[11＼]：正向引物为27f （5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）；反向引物为1492r （5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR反应体系为模板DNA加2.5μL，上下引物各2.5μL，PCR MasterMix2.5μL，加超纯水至50μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min，然后94℃变性30s，52℃退火80s，72℃延伸90s，30个循环。最后一轮循环结束后， 于72℃下最后延伸8min，使反应产物扩增充分。委托三博远志生物科技有限公司对PCR扩增产物进行测序，测序结果在Gen Bank数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行相似度分析，并以Neighbor-Joining法构建系统发育树＼[12，13＼]。

2.5正交实验优化菌株吡啶降解性能的方法

在微生物降解过程中，其反应速率限制因素可能包括碳源、DO、pH值、C/N和温度等。李长征等＼[14＼]认为影响吡啶降解效果的主要环境因素包括温度、摇床转速、菌种投加量等。孙庆华等＼[15＼]利用Shinella Zoogloeoides BC026菌进行吡啶降解实验中指出，初始浓度是影响吡啶降解速率的重要因素。综合考虑前人的研究成果本文选用四因素三水平L9（34）正交表设计实验，L9（34）因素水平表及正交实验结果分别见表1和表3，菌株在各条件下培养96h后测吡啶去除率。

表1L9（34）因素水平

因素1213水平水平11213水平21213水平3温度/℃ （因素A）121325121330121335PH值（因素B）12136.512137.512138.5初始浓度/（mg/L）（因素C）121320121330121340振荡速度/（r/min）（因素D）121312012131601213200

2013年2月绿色科技第2期

董贞君，等：高效吡啶降解菌的筛选及其降解条件研究环境与安全

2.6分析方法

菌体生长吸光度（OD600）：采用吸光度法，用721可见分光光度计在光密度为600nm处测吸光度值；

CODcr：采用美国HACH快速测定仪；

pH值：采用9157BN型Thermo Orion pH计。

吡啶浓度以固相微萃取—顶空气相色谱法测定，仪器型号为VARIAN CP-3800气相色谱仪，色谱柱为WARIAN CP-Wax 58（FFAP）CB极性（酸性）色谱柱。分流比10∶1，升温程序∶初始温度40 ℃，保持2min（升温速率 40℃/ min）至140 ℃，保持5min。检测器采取氢火焰 （FID）检测器，检测器温度280 ℃，气化温度200℃， 各气流速：载气N2为2 mL/ min，H2为40 mL/ min，空气为350 mL/min。

水样预处理及固相微萃取方法：从液体测试培养基中取15mL水样于离心管中，12000r/min高速离心10min，将上清液倾出，用0.22μm的水系滤膜过滤，取清液5mL，置于15mL顶空瓶中，加入1.5g氯化钠，立即用聚四氟乙烯垫和帽密封顶空瓶，轻轻摇匀，待氯化钠溶解后放入水浴温度为58℃水浴中，插入固相微萃取头，插入深度为2.5cm，萃取40min后取出针头进样进行色谱分析，解析5min，每两次萃取过程之间将萃取头在250℃下烘烤12min以去除残留。

3结果与分析

3.1菌株的驯化与筛选

4株吡啶降解菌经过不同吡啶浓度的液体培养基驯化后，筛选出1株降解能力最强且能以吡啶为唯一碳源、氮源和能源的菌株，命名为PY6，将PY6按10%的接种量接种到初始浓度为30mg/L的液体测试培养基中，30℃ 、180 r/min的条件下好氧振荡培养，经过96h后对吡啶的降解率达到84.12%，可作为下一步实验的优势降解菌。

3.2PY6的初步鉴定结果

3.2.1菌株的形态及生理生化特征

菌株PY6在平板培养基上培养2d后观察，菌株特征为淡黄色、湿润、不透明、隆起、表面光滑、边缘整齐。初步鉴定结果为革兰氏阴性，杆状菌（革兰氏染色后菌株PY6的显微照片见图1）。

菌株生理生化试验结果见表2，从结果可以看出该菌株具有接触酶、明胶酶、淀粉酶，在糖代谢过程可将葡萄糖分解为酸性物，分解蛋白胨中的色氨酸，可生成吲哚，可氧化乙醇。

表2PY6的生理生化特征

特征1213结果1213特征1213结果革兰氏染色1213-1213接触酶实验1213+生长温度/℃121310-401213甲基红1213+生长PH值12135-101213V-P实验1213+乙醇氧化1213+1213明胶液化1213+淀粉水解1213+1213吲哚实验1213+脲酶实验1213+1213葡萄糖发酵1213F注F：发酵型；+：阳性； -：阴性

3.2.2菌株的分子生物学鉴定结果

对提取的菌株模板DNA进行PCR扩增，电泳图结果如图2所示，从图中可以看出约1500bp处出现荧光条带，且无明显拖尾现象，阴性对照无条带，说明反应体系没有被污染。因此，PCR扩增产物能够满足后续测序的要求，利用Blast软件在Gen Bank数据库中进行序列相似性搜索。结合菌株的形态观察、生理生化以及16S rDNA分子生物学鉴定，初步判断菌株PY6为假单胞菌。

图1菌株WXZ-2革兰氏染色后

显微镜形态观察（×1000） M：DNAMarker1：PY6

图216S rDNA扩增产物电泳图3.3菌株培养条件的优化

由表3对正交实验结果进行分析，发现9组正交实验中有5组实验吡啶去除率均达到了70%以上，可见该菌株的环境适应性良好，同时以吡啶去除率为指标，计算不同因素下各个水平的去除率，以及反映各因素对指标影响大小的极差R。由表3极差分析可以判断出各因素影响的主次顺序为：振荡速度>初始浓度>温度>pH值，振荡速度是影响去除率的主要因素，转速太低使溶解氧浓度偏低，转速太高菌株会因离心力集中成团，减少与吡啶反应的机率；由K（均值）可以看出，对应理论最优条件为：温度=25℃，pH值=6.5，吡啶初始浓度=40 mg/L，摇床转速=160r/min；而表观最优条件为实验组2：温度=25℃，pH值=7.5，吡啶初始浓度=40mg/L，摇床转速=160r/min。

由于表观最优条件不同于理论最优条件，以表观最优条件作为培养条件，对其进行验证实验，结果理论最优条件下吡啶去除率为90.59%，这与表观最优条件结果基本一致，而两个最优条件只有pH值不同，说明pH值对该菌株影响不大，这也与极差分析的结论pH值的影响最弱一致。pH值是废水处理中不易控制的因素，但是所有因素中pH值的影响最小，证明PY6具有潜在的工程推广应用价值。

3.4降解性能跟踪实验

为了准确描述该菌株对吡啶的降解性能，在吡啶去除率最优的条件即表观最优条件下，对OD600和吡啶浓度进行跟踪测定，结果如图3所示。

图3优选条件下PY6菌各参数随时间变化曲线由图3可见，随着菌密度增长，吡啶浓度逐渐降低。前24h菌株生长不明显，所以吡啶浓度的降低主要是由于菌株的吸附作用。随后的24h，由于PY6菌暂时处于适应期，菌株密度增长较慢，吡啶浓度的衰减速率也缓慢。在48h后菌株开始适应环境，进入对数生长期，吡啶降解速度加快，在96h，菌密度最大，吡啶去除率达91.2%，随后菌密度下降。有报道＼[15＼]认为，由于吡啶的碳氮比为4.3∶1，此时微生物的死亡可能与缺乏碳有关。

4结语

（1）从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离出1株能以吡啶为唯一的碳源、氮源的高效降解菌，该菌株为革兰氏阴性菌，经16S rDNA序列同源性分析以及部分生理生化反应初步鉴定PY6为假单胞菌。

（2）通过四因素三水平L9（34）正交实验结果发现该菌的环境适应性良好。吡啶初始浓度40 mg/L、25℃、摇床转速160r/min、pH值为7.5时吡啶去除率达91.64%，因而PY6为1株高效吡啶降解菌。

（3）在吡啶去除率最优的条件下，通过跟踪测定结果发现，PY6菌生长状况良好，吡啶的快速去除过程与菌体的生长过程基本一致，在48h后菌株开始适应环境，进入对数生长期，在96h菌密度最大，吡啶去除率达90%以上。

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