高效液相色谱荧光法测定胡椒中的阿维菌素

摘要：建立以高效液相色谱荧光（HPLC-FLD）法测定胡椒（Piper nigrum L.）中阿维菌素含量的方法。样品用乙腈提取，经氨基柱净化，衍生后，以HPLC-FLD法分析。结果表明，该法在添加回收浓度为0.005，0.010和0.050 mg/kg 3个不同添加水平的回收率为95%～103%，其检出限为0.005 mg/kg。

关键词：高效液相色谱荧光法；阿维菌素；残留；胡椒（Piper nigrum L.）

中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）02-0425-03

阿维菌素（Abamectin，AVM）是由链霉菌发酵产生的大环内酯类抗生素，属昆虫神经毒剂，主要干扰神经生理活动，刺激释放γ-氨基丁酸，而γ-氨基丁酸对节肢动物的神经传导有抑制作用，害虫与药剂接触后即出现麻痹中毒而死，无内吸性[1]。由于具有杀虫性强以及杀虫谱广等特点，被广泛用于蔬菜、果树、棉花和花卉等作物上[2]。

Malanikova等曾使用TLC法检测阿维菌素，在硅胶薄层板上涂上荧光指示剂，用于样品检测。但TLC与高效液相色谱（HPLC）法相比较，灵敏度低，一般只作定性分析，很少用于残留检测[3]。根据阿维菌素类药物的共轭二烯结构在240～250 nm处有强烈的紫外吸收，常采用液相色谱-紫外检测分析方法[4，5]。但另一方面，阿维菌素类药物在体内最小有效浓度低于紫外检测器对其最低检测限（1～2 ng/mL）[6]。与紫外检测器相比，荧光检测器（Fluorescence detector，FLD）的灵敏度约高100倍，对痕量分析特别适用。而且只有具有对称共轭和非强离子化的化合物才能发射荧光，因此HPLC-FLD法的基质干扰较少。

由于AVM本身没有对称共轭结构，不能直接用荧光检测器检测，而只有经衍生后生成具有对称共轭的苯环结构才能发射荧光，其在血浆中的AVMs检测限可达0.02 ng/mL[7]。由于胡椒（Piper nigrum L.）基质复杂，含有大量的挥发油、胡椒碱、粗脂肪、粗蛋白，对液相色谱柱及检测结果产生影响，因此，本试验将围绕建立胡椒中阿维菌素的检测方法展开。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

2695高效液相色谱仪，配2475荧光检测器（Waters，美国），N-EVAP氮吹仪（Organomation，美国），旋转蒸发仪（Heidolph，德国）等。

1.2 主要试剂和材料

甲醇（色谱纯），乙腈，二氯甲烷，正己烷，氯化钠（140 ℃烘烤4 h）均为分析纯；阿维菌素标准品（94.7%）等。

NH2-氨基固相萃取柱（Agilent，美国）。

标准储备液的配制：准确称取阿维菌素标准品0.1 g于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成1.0 mg/mL的标准储备液。将上述标准储备液置于4 ℃冰箱保存。

衍生制剂A：在一具塞试管中加入3.6 mL N， N-二甲基甲酰胺和0.4 mL 1-甲基咪唑，混匀后立即置于冰浴中冷却1 min，缓缓加入0.6 mL三氟乙酸酐，摇匀，现配现用。

衍生制剂B：在一具塞刻度试管中加入3 mL甲醇和0.2 mL浓氨水，摇匀。

1.3 方法

1.3.1 样品提取 称取10 g胡椒样品，先后加入5 mL和40 mL乙腈，在匀浆机中高速匀浆2 min后用滤纸过滤，滤液收集到装有5～7 g氯化钠的100 mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈振荡1 min，在室温下静止10 min，使乙腈相和水相分层[8]。

1.3.2 净化 取20 mL上清液，转入150 mL分液漏斗后，加入20 mL乙腈饱和的正己烷，充分混匀，分层，取下层于150 mL旋转蒸发瓶中，37 ℃水浴旋转蒸至近干。固相萃取淋洗液为甲醇-二氯甲烷（95/5， V/V，下同），先用4 mL预淋，当溶剂液面到达吸附层表面时，立即加入样品溶液，用10 mL具塞刻度试管收集洗脱液，再用2 mL甲醇-二氯甲烷洗烧杯后过柱，并重复1次。将试管置于40 ℃水浴氮吹。

1.3.3 衍生 向试管中加入0.2 mL衍生试剂A，超声1 min后，于30 ℃水浴1 h，并不时摇动。取出后再加入0.1 mL衍生试剂B，摇匀。并于30 ℃水浴0.5 h，冷却至室温。加入2.5 mL甲醇，振荡，用0.22 μm滤膜过滤，待测。

1.3.4 色谱分析 流动相为甲醇-水溶液（9/1，V/V），Kinetex C18（50 mm ×4.6 mm， 2.6 μm）色谱柱，柱温35 ℃，荧光激发波长为365 nm，发射波长为475 nm，进样量5 μL，流量0.6 mL/min。

1.3.5 添加回收试验 在空白样品中添加阿维菌素标样（标样纯度为94.7%），按前述分析方法测定回收率。

2 结果与分析

在上述仪器条件下，阿维菌素的保留时间为6.538 min，标准溶液色谱图见图2，采用外标法定量，R2=0.997 1，最低检测限为0.005 0 mg/kg。其中，图1-图4为衍生前氮吹全干情况下。

在添加浓度为0.005、0.010、0.050 mg/kg范围内，胡椒样品的添加回收率见表1。由表1可知，添加回收率平均值为95%～103%，变异系数为5.1%～9.3%，满足农药残留登记的要求[9]。

在衍生后氮吹近干时，其色谱图见图5。由图5可知，测定加标浓度为0.050 mg/kg的样品时，测得仅为0.001 mg/kg，回收率不足20%，未达到农药残留分析的要求。

3 结论

本试验建立了胡椒中阿维菌素测定方法，通过乙腈提取，再用乙腈饱和的正己烷进行液液萃取去除胡椒中的油脂，以NH2小柱净化，二氯甲烷-甲醇洗脱，再通过避光衍生，即可进行色谱分析。需要注意的是，在衍生之前的氮吹过程中，一定要保证待测样品完全吹干，可保证回收率为95%～103%，达到农药残留分析的要求。

参考文献：

[1] 吴文君.农药学原理[M].北京：中国农业出版社，2000.18.

[2] 王险峰.进口农药应用手册[M].北京：中国农业出版社，2000. 64-66.

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[9] NY/T 788-2004. 农药残留试验准则[S].