针灸血清与蛋白质组学研究

【关键词】针灸血清；蛋白质组学；血清蛋白质组学

【中国分类号】R245【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0009-01

针灸血清的概念来源于20世纪80年代的“血清药理学”和90年代的“中药血清”研究。针灸血清的概念于1996年公开提出。1998年杨永清研究员的针灸血清研究获得国家自然科学基金资助。目前已成为针灸研究的一个新亮点［1］。

1. 针灸血清

“针灸血清”研究，是指将针灸处理后的人或动物体中采集到的血清，作为效应物质加到另外一个反应系统中，与在体或离体器官、组织、细胞或分子等靶目标接触，通过它们的形态学或功能的改变，直接观察针灸处理后产生的效应［2］，是近年来针灸领域中提出的一种新的研究思路和方法，目前已广泛应用在哮喘、肿瘤、心肌缺血、脊髓损伤等疾病的研究中，实现了针灸离体实验方法学的改进，为针灸研究开辟了一条新的道路。

2.蛋白质组学

蛋白质组学的研究目前已经成为当今生命科学的热点之一。蛋白质作为生命活动的主要承担者，在机体生理功能中发挥着重要作用，一直以来也是研究的重点。其概念最早是由澳大利亚（1994）Wilkins和Willias提出。蛋白质组学是在特定细胞或组织水平上对蛋白质的表达进行研究，具体说它是对不同空间和时间上发挥功能性特定蛋白质群组进行研究，即在蛋白质水平上探索其作用模式、功能机理、调节调控，以及蛋白质群组内相互作用，运用这项技术可以在正常与病理情况下检测蛋白质的差异表达。运用蛋白质组学技术在临床方面可以研究特定蛋白与疾病的关系，从而找到疾病标记蛋白，为疾病诊断、病理分析、药物筛选、新药开发等，提供理论依据［3］。

3.血清蛋白质组学

血清中含有90-91%的水，6.5-8.5%的蛋白质和2%作用的低分子量蛋白质。血清中广泛存在的蛋白质种类大约有10000种，大多数蛋白的含量非常低，即低丰度蛋白。而低丰度蛋白的识别非常重要，潜在的新的疾病生物标志分子往往呈现低丰度。并且许多低丰度蛋白常常行使着“信使”的作用。由于血清蛋白组成极为复杂，因此血清蛋白质组学的关键在于能否将所研究的血清样本进行有效地分离。血清蛋白质组学是指研究选定的目标人群血清中所表达的全部蛋白质，在建立正常蛋白质表达图谱的基础上，寻找差异蛋白质点,鉴定疾病相关蛋白质，进而研究其功能和结构，为研究重大疾病病理生理学机制、早期诊断的特异性标志物、药物作用靶点等开辟新的途径。

4.血清蛋白质组学技术

（1）双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electro-phoresis,2D-PAGE）：双向电泳是一种方便、灵敏的蛋白质分离方法。双向电泳的第一向是等电聚焦，根据蛋白质等电点不同将其分离。双向电泳的第二向是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacry-lamide gel electrohoresis,SDS-PAGE）［4］：根据蛋白质分子质量不同进一步分离等点相同的蛋白质。双向电泳技术因其分辨率高、可重复性好、结果直观、实验成本较低等特点，已成为蛋白质组研究中最常用的分离技术。另外固定化PH梯度技术可以把目的蛋白固定在极狭窄的凝胶区域加以分离，提高2D-PAGE的重复性与上样量。虽然2D-PAGE分辨率很高，但不能被用于分析低含量蛋白质，灵敏度低，这又与生物体内蛋白质种类数目繁多相比，远不能满足需要，因而容易阻碍早期状态疾病特异性标志物的发现。

（2）质谱技术(mass-spectrometry,MS) MS技术的应用是蛋白质组学研究中的重大进展，它具有高通量、准确、灵敏和操作自动化等优点，已取代传统的Edman降解测序和氨基酸组成分析，成为蛋白质鉴定的核心技术。MS技术根据电离源的不同分为2种：1种是基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization -time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)，其原理是利用氮源脉冲激光使基质吸收激光的能量使固相的多肽样品离子化，离子化的肽段进入质量分析器，因质量/电荷比(m/z)差异发生电离，通过测量肽段离子的相关参数，可获得肽质量指纹(peptidemass finger-print PMF)、肽序列标签(peptide sequence tag, PST)或部分氨基酸序列,然后用相应的软件寻找蛋白质组数据库，实现对蛋白质的定性鉴定或定量分析。Baumann等［5］通过一系列试验试图使血清蛋白质组学MALDI-TOF-MS技术标准化，并认为单纯解冻的血清标本重复性最好,通过标准化的血清标本预处理、储存程序和磁珠分馏法，可有效提高MALDI-TOF-MS技术的重复性。第2种是电喷雾电离串联质谱(electrospray ionization tendem mass spectrometry,ESI-MS/MS)，ESI技术是在强电场存在的前提下，在喷射过程中利用电场使液相的多肽样品离子化，产生单价或多价的气态离子，离子化的肽段进入质量分析器而测定其相关参数。ESI的优点在于其可方便地与其它蛋白质分离技术联合应用,如液相色谱+电喷雾+串联质谱(LC-ESI-MS/MS)。串联质谱的可靠性要明显优于MALDI-TOF-MS，现在新建的质谱鉴定实验室多为串联质谱。

（3）表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱(surface enchanced laser desorption and ionization-time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)：SELDI是一种以亲和力为基础的质谱法，蛋白质被选择性地吸附到经化学变性的固体表面上，杂质可通过清洗去除。采用能量吸收基质，蛋白质通过激光解吸质谱分析进行识别。SELDI-TOF-MS有许多优点，可以为分子量在200~500kD的蛋白质提供很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟就可以完成，对低丰度蛋白,即使浓度仅atto-mole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到。SELDI可直接使用粗样本，即未经处理的原始样本进行检测；可以大规模、高通量、超微量、全自动筛选蛋白质；另外，它不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可进行相关疾病的研究。目前SELDI-TOF-MS已经广泛应用于血清蛋白质组学的研究。随着科学技术的发展，应用单一技术平台分离血清样品已经不能满足科研的需要。目前通常采用的方法是联合使用几种不同的技术平台以达到对样品的有效分离。如高丰度蛋白去除+全蛋白酶解+二维液相色谱(阳离子/阴离子交换色谱+反相色谱)分离+质谱鉴定(离子阱或Q-TOF串联质谱)；高丰度蛋白去除+色谱分离+2-DE+联合质谱鉴定等。

（4）蛋白质芯片 蛋白质芯片又称蛋白质微阵列，是继基因芯片之后作为基因芯片的补充而发展起来的蛋白质分析技术。它以蛋白质或多肽为材料，可以在同一时相分析整个蛋白质组。根据芯片表面的不同化学成分，可将蛋白质芯片分为化学表面芯片（亲水、疏水、阳离子、阴离子和金属离子整合芯片）和生物表面芯片（抗原抗体、受体配体和DNA蛋白质芯片等）。化学表面芯片用于检测未知蛋白，并获取指纹图谱；生物表面芯片可显示与之结合的抗原或配体的不同分子量亚型。目前常将蛋白在芯片、SELDI相结合来研究差异表达蛋白质，即不同的蛋白质样品和同一种蛋白质芯片相作用，洗掉未结合的蛋白质，然后用SELDI进行分析鉴定。它可用于对血清及组织样品中的各种蛋白质直接进行检测，特别适于以往蛋白质分析的盲区，即对低分子量、低丰度和疏水的蛋白质进行研究。因此，在蛋白质组学的研究中与目前常规方法相比具有较显著的优势。

5.展 望

近年来针灸血清的研究成为一大亮点，研究者认为针灸血清中含有某些活性物质，从而发挥治疗和预防疾病的作用。目前对针灸血清成份的研究，虽取得了一定成果，但尚未完全揭示其本质，今后应进一步结合蛋白质组学技术，进行针灸血清的研究。在针灸血清种类研究方面，目前主要集中在针刺血清，电针血清，艾灸血清和天灸血清，其它报道较少，今后可以结合更多的特色针灸方法，对其血清进行相关研究［6］。如对自血穴位注射等具有特色疗法的针灸血清进行深入、系统研究，对于揭示针灸血清的作用机理，可能具有突破性意义。对于针灸血清的作用机理，当前学者多结合具体病种，从细胞水平或信号转导途径等进行研究，针灸血清可能通过多靶点，多途径发挥作用，今后研究角度应进一步深入。

参考文献

［1］杨永清，陈汉平，王宇，等。针灸效应物质基础研究。针刺研究，2007，32（12）：399-401

［2］王宇，杨永清，陈汉平，等。“针灸血清” 研究进展。上海针灸杂志，2007，26（1）：12-15

［3］PAGE M J,GRIFFITHS T A M,BLEACKLEY M R,et al. Proteomics applications relevant to transfusion medicion. Trans Med Rev,2006,20:63-74

［4］Wu W,Tang X,Hu W,et al.Identification and validation of metastasis-associated proteins in head and neck cancer cell lines lines by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry.Clin Exp Metastasis,2002,19(4):319-326

［5］Baumann S, CeglarekU, FiedlerGM, et a.l Stardardized approach to proteome profiling of human serum based on magnetic bead separation and matrix-assisted laser desorption/ionization time - of- flight mass spectrometry［J］. Clin Chem, 2005, 51(6): 973-980

［6］周次利，张淑静，张丹，等。针灸血清研究现状与思考。中华中医药学刊，2011,29（3）：484-486

作者简介： 彭拥军（1977-），男，山东宁阳人，主治医师，医学博士；研究方向：针灸治疗皮肤病及脑血管疾病的研究。