脑梗死患者的对氧磷脂酶-1活性及其基因多态性研究

【前言】脑梗死患者的对氧磷脂酶-1活性及其基因多态性研究由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。对象与方法 一、对象：全部研究对象均用美国贝克曼生化仪测量其血糖、甘油三脂、肝功能、胆固醇、载脂蛋白A(apoA)、载脂蛋白B(apoB)、HDL-C。 1.脑梗死组127例, 其中男68 例,女 59 例,年龄36―88岁,平均64.1±1.02岁，为2002年4月-2004年2月住院治疗的动脉硬化性脑梗死...

钱加强 张志坚 张萍 林经安 李秋兰 吴宝花

【摘要】 目的 探讨动脉硬化性脑梗死患者血清对氧磷脂酶―1(PON―1)活性及其基因多态性与脑梗死的关系。方法 用分光光度法检测127例脑梗死患者和128例相匹配的对照组的对氧磷脂酶―1（PON―1）的活性，同时,检测这两组研究对象血浆氧化低密度脂蛋白（OX―LDL）、血管性假血友病因子（VWF）、血清一氧化氮（NO）、血浆颗粒膜蛋白（GMP-140）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、载脂蛋白A（apoA）、载脂蛋白B（apoB）的变化, 并把这些指标与PON―1的活性作相关分析。用PCR检测PON―1192RR与55LL基因型, 用Logistic回归分析脑梗死组及对照组的基因型与其他危险因素相关性。结果 脑梗死组和对照组的PON―1活性均在国人正常范围内，但脑梗死组血清PON-1活性降低明显(F=10.39,P＜0.01)。相关分析表明血PON―1活性与血NO呈正相关（r =0.205, P

关键词：对氧磷脂酶―1 基因多态 动脉硬化 脑梗死

[ Abstract ] Objectivedetermine whether the paraoxonase-1(PON-1) activity and polymorphism are associated with cerebral infarct. Methods PON-1enzyme activity in 127 cases with cerebralinfarct and 128 controls were measured with spectrometric method, meanwhile, plasma Ox-LDL, NO, VWF, GMP-140, HDL-C, apoA and apoB were investigated, and the correlation ships between PON-1enzyme activity and above indexes were analyzed. PON-1 192/55 genotypewere determined using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method . The PON-1 genotypes and enzyme activities between hypertension and no-hypertension groups were compared. Results Conclusions PON-1 192RR genotype is associated with the cerebral infarct; hypertension is the independent risk factor of cerebral infarct.

动脉硬化是危害人类健康的一种常见、多发疾病，它可导致心、脑、肾等多器官疾病。近年的研究发现氧化低密度脂蛋白（OX―LDL）是导致动脉硬化的重要因素，它在泡沫细胞形成过程中起重要作用。研究还证实与高密度脂蛋白紧密结合的对氧磷脂酶―1（PON―1）的活性，与动脉粥样硬化呈负相关，它主要是通过抑制LDL的氧化修饰，水解脂质过氧化物，以减少OX―LDL的积聚,从而阻止泡沫细胞的形成及动脉粥样硬化的发生[1]。近几年来有关PON―1活性及其基因多态性与冠心病、心肌梗塞及糖尿病的关系，国内外已有较多研究[2、3、4]，也已证实它们的相关性，但与脑梗死的关系研究却少，国内未见报道。同时，国外报道PON―1基因的多态性也与脑血管疾病的发生发展密切相关，如PON―1的192与55基因位点的多态性与血管硬化相关[5]，但在国人的情况如何尚未见报告。

对象与方法

一、对象：全部研究对象均用美国贝克曼生化仪测量其血糖、甘油三脂、肝功能、胆固醇、载脂蛋白A(apoA)、载脂蛋白B(apoB)、HDL-C。

1.脑梗死组127例, 其中男68 例,女 59 例,年龄36―88岁,平均64.1±1.02岁，为2002年4月-2004年2月住院治疗的动脉硬化性脑梗死患者,均排除动脉炎,脑栓塞,肿瘤,脑炎、糖尿病及肝病等疾患,发病在72小时以内,经头颅CT或MRI证实。组内患有高血压者69例，高血压标准为收缩压≥140mmHg或(和)舒张压≥90mmHg。有吸烟者36例。

2.对照组128例, 其中男62 例,女66 例,年龄31―84岁,平均62.7±0.91岁，患有高血压者48例，有吸烟者31例。均为体检或外伤住院者，经体检证实均排除糖尿病、肝病。

二、全部病例的血样均在使用抗氧化剂前空腹采取，除预留作为基因多态分析的血样外，余下的均立即分离血清，-20℃冰箱保存，统一检测。血中OX―LDL、均空腹采血，分离血浆。-20℃冰箱保存，统一检测。

三、检测指标及方法：

（一）血中OX―LDL：均采用ELISA 法，试剂盒由北京中联生物工程公司提供，操作均严格按说明书进行。

（三）血清PON―1活性：采用分光光度法测定[6]。血清用20mmol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.4)1:10稀释，取30μl加入3ml预温的反应液（1mmol/L的酚乙酸酯，0.9mmol/L,CaCl2，20mmol/L,Tris-HCL,pH8.0），立即摇匀，采用北京瑞利分析仪器公司的紫外分光光度仪,利用动力学测量,于25℃下以波长270nm测定3min内吸光度的变化率，酚乙酸酯的E270为1310mol/cm，PON-1酶活性单位定义为1U，相当于1ml血清在25℃，270nm条件下，1分钟水解1μmol酚乙酸酯底物。

（四） PON―1的192 与55基因位点的多态性检测方法:

1．外周血提取DNA方法

（1)外周血单个核细胞分离：采集2―3ml枸橼酸钠抗凝静脉血，加入生理盐水稀释后，按常规方法以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，置―20℃冰箱保存待用。

（2)DNA提取：分别加入5mg/ml蛋白酶K80μl，10%SDS 80ul和1ml核裂解液于含有单个核细胞管中，混匀；置56℃恒温器中，孵育2―4小时，加入5M NaCl310μl颠倒混匀，13000rpm离心10分钟，吸起上清液500μl于另外一个试管中，加入―20℃冰箱预冷的无水酒精1ml，颠倒混匀直至白色絮状出现，13000rpm离心10分钟，弃上清液，加入―20℃冰箱预冷的70%酒精1 ml，颠倒混匀，13000rpm离心10分钟，弃上清液，55℃烘干10―20分钟，加入50―200μl水溶液，置―20℃冰箱保存待用。

2．PON-1 PCR实验操作

pon-1的192/55基因检测的引物：根据文献[7]报道的引物序列委托上海生工公司合成，引物系列见表1。

（2） PCR反应条件：在25ul 反应体系中,含有2 .5ul 1×buf , 1.5mmolMgCl2,200μmol dNTPs ,1U Taq酶,4% DMSO,200pmol引物对,100ng DNA,置于PE9600热循环仪中,PCR反应参数为：94℃3分钟后,按94℃60秒,60℃60秒,72℃60秒,反复循环35次,最后72℃延伸7分钟,结束PCR反应。

（3）限制性内切酶酶切检测PON-1基因型：各取PON-1的192和55 PCR产物15ul,分别用相应的10-15U内切酶（New England的酶Alw I和Nla Ⅲ酶），按照操作说明书进行酶切反应，2ul buf，水补足20ul，37℃ 12-24小时，取PCR-内切酶酶切产物12ul，2%琼脂糖凝胶电泳，判断基因型（基因型判断见表1）。284bp的PON-1 192PCR产物酶切出现192和92bp判定为RR纯合型，出现284bp判定为QQ纯合型，284、192和92bp判定为RQ杂合型；170 bp 的PON-1 55 PCR产物酶切后仍然为170bp判定为LL纯合型,170bp酶切出现126和44bp判定为MM纯合型，同时出现170、126和44bp判定为LM杂合型。

四、统计学方法：获得数据采用SPSS.11统计软件相应行方差分析、t检验、直线相关分析、Logistic回归分析、卡方检验等统计学处理。

结果

本文结果表明脑梗死组与对照组在年龄、性别、吸烟等方面的差异无统计学意义，这表明两组在年龄、性别、吸烟等方面有较好的匹配。脑梗死组的甘油三脂、胆固醇、apoA、高血压与对照组比较差异有显著性意义。HDL-C、apoB在两组之间差异无显著性意义。方差分析表明，脑梗死组与对照组的PON―1活性均在国人正常范围内[8]，但经统计学分析后显示脑梗死组与对照组相比，血清PON-1活性降低，差异有显著性意义，而OX-LDL升高，差异亦有显著性意义。（见表2）。

同时，把血OX―LDL与PON-1活性作spearman相关分析表明，血PON―1活性与血OX―LDL呈负相关（r =-0.339, P

表3、4为脑梗死组与对照组PON-1的192与55基因多态性的基因型分布及等位基因的频率情况，经卡方检验表明PON-1192基因的多态性在脑梗塞组与对照组有明显不同,其中RR基因型在脑梗塞组的表达明显高于对照组（P=0.01, χ2=5.74），而PON-1 55基因的多态性在两组差异无显著性意义（P=0.29,χ2=1.1）。经验证脑梗塞组与对照组基因型分布均符合Hardy-weinberg平衡定律（P＞0.05）。

表5为 PON-1 不同基因型之间的PON-1活性比较，结果显示PON-1 192的 RR 基因型的PON-1活性低于其它PON-1基因型的PON-1活性, 差异有显著性意义（P=0.001, F=12.25）。

另将研究对象分为高血压与非高血压组,对它们的血PON-1活性及PON-1 192RR基因型是否与高血压有关进行了检验, 经t检验显示高血压组与非高血压组之间PON-1活性差异无显著性意义(92.87±1.4/94.37±1.2, t=2.1, P=0.15)；经x2检验高血压组与非高血压组之间PON-1 192RR基因型差异也无显著性意义(7.5％/8.1％ , x2=0.235 , P=0.628)。

以脑梗死组与对照组为应变量，以PON-1 192和55基因多态性、各其他危险因素为自变量, 作Logistic回归分析，结果表明(见表6)，PON-1 192RR基因型是脑梗死的危险因素(OR=1.8, 95%CI0.16-5.08)，高血压也是脑梗死的危险因素(OR=2.04, 95%CI1.24-3.36)。PON-1 55LL基因型不是脑梗死的危险因素（OR=1.17, 95%CI0.26-1.29）。

讨论

对氧磷酯酶-1(Paraoxonase-1,PON-1)，又称副氧酶, 是一种由354个氨基酸组成，分子量为43-45KD的蛋白质，在血浆中它几乎专一地与HDL结合。最近的研究显示PON-1能以HDL为载体, 水解OX-LDL并降低其毒性，从而抑制动脉粥样硬化的过程。体外试验也证明了这一点[9]。对氧磷酯酶-1可以水解脂质过氧化物，减少低密度脂蛋白的氧化，因此，进一步的研究发现其活性及基因多态性与动脉粥样硬化、心肌梗塞、糖尿病等密切相关。

本组资料显示脑梗死组与对照组PON―1活性虽然在国人正常范围内，也与Mackness测定的正常欧洲人X=119IU/L接近[10],但经统计分析后显示脑梗死组PON-1的活性较对照组明显降低,这反映脑梗死组的PON-1活性在正常分布区内的低值也有意义。因此这提示临床上判断个例PON―1活性是否减低不能以它的值是否低于正常分布范围来判定，这在今后的临床研究中应加以注意,况且有研究表明PON―1活性在人群中的分布差异很大[11]。脑梗死组PON-1的活性较对照组低是否与脑梗塞有关？目前许多研究认为氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）是致动脉硬化的重要因素，它在泡沫细胞形成过程中起重要作用。本文分析显示脑梗死患者OX―LDL较对照组升高，这与文献报告相符[12],说明OX―LDL在脑梗塞发病中起一定作用，OX―LDL具有类似炎症介质的作用，介导大量单核细胞到血管内皮间隙，为继后的泡沫细胞形成打下了基础。同时，OX―LDL通过各种受体的介导进入细胞内，从而导致溶酶体膜完整性破坏，溶酶体酶流入胞浆，引起细胞限制性自溶及凋亡，从而在泡沫细胞形成及继后的动脉粥样硬化损伤中起重要作用。为了进一步了解PON―1与血OX―LDL的关系，本文把这两个指标作相关性分析显示PON―1与血OX―LDL呈负相关，这符合脑梗死患者血PON-1活性的下降使其对LDL的氧化抑制减低，OX―LDL分解减少，导致血清OX-LDL含量增加的推断。有研究表明PON-1在动脉粥样硬化形成的多个环节中起到抗动脉粥样硬化剂的作用。抗氧化剂和PON-1联合作用可以通过下列机制导致OX-LDL水平的显著减低：（1）抑制OX-LDL形成；（2）水解OX-LDL中氧化酯质。PON-1还通过水解动脉壁细胞（包括巨噬细胞）脂质过氧化物以减弱它们致动脉粥样硬化的作用。

本组资料还显示PON-1活性与血HDL-C变化不相关，而且脑梗死组与对照组的血HDL-C差异无显著性意义，这与文献报告相符[13]。但另有文献报告PON-1活性高低与HDL-C含量相关[10]，为什么会存在这种差异呢？Mariano等进一步把血HDL-C浓度高低与PON-1活性作分析,表明低HDL-C者其PON-1活性与HDL-C有关,而正常HDL-C者其PON-1活性与HDL-C无关。因此临床上把血HDL-C作为衡量PON-1活性高低可能不恰当。

本研究显示PON-1 55位基因多态性与脑梗死无统计学意义的关联，与近期Barbara V等报告相一致[20]，也有不同的报告[22]，Imai 等认为日本老年血管性痴呆与PON-1 55位基因多态性有关[23]。在奥地利预防中风研究中，PON-1 55位基因多态性与脑白质变性有关[5]，然而，这些病人临床上并无脑缺血发作。为什么PON-1 55位基因多态性与脑梗塞的关系会存在这些分歧，估计存在一定的影响因素，如不同的地区、种族间的差异。从另一角度来看，有研究显示PON-1活性46%由PON-1 192基因型,16%由PON-1 55基因型,13%由PON-1浓度决定[24],因此PON-1 192基因型可能在PON-1活性方面起主要作用。本文结果表明梗塞组中携带PON-1 192RR基因型者，其PON-1活性较对照组明显降低，这支持PON-1活性可能主要由PON-1 192基因型决定的观点。因此可以推测在我国该地区的脑梗塞病人中，PON-1 192RR等位基因可降低PON-1活性,增多LDL的氧化修饰, 促进动脉硬化的形成，从而提高了脑梗死发生的危险。

参考文献

1.Mackness B, Hunt R,Durrington PN et al.Increased immunolocalization of paraoxonase, clusterin, and apolipoprotein A-I in the human artery wall with the progression of atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1997 Jul;17(7):1233-1238.

2.Mackness MI , Mackness B, Durrington PN. Paraoxonase and coronary heart disease. Atheroscler Suppl 2002; 3（4）:49-55.

3.Abott CA, Mackness MI ,et al.Serum paraoxonase activity ,concentration and phenotype distribution in diabetes mellitus and its relationship to serum lipids and lipoproteins. Arterioscler Throm Vasc Biol.1995;15:1812-1818.

4.Letellier C, Durou MR, Louanolle AM, Serum paraoxonase activity and paraoxonase gene polymorphism in type 2 diabetic patients with or without vascular complications. Diabets Metab2002;28（4Pt1）:297-304.