微生物的培养方法范文
时间：2023-12-29 17:08:52
微生物的培养方法篇1
[关键词]养肝解毒丸；微生物限度检查；方法学验证
微生物试验的结果易受试验条件的影响，特别是制剂中含有较强的抑菌成分时，只采用常规方法进行微生物限度检查，其结果不能真实反映其污染的微生物状况Ⅲ。口服制剂中微生物污染状况的控制是药品质量控制的重要指标。中药口服制剂尤其易受到微生物的污染，因此中国药典2015年版四部通则中规定微生物限度是中药丸剂的必检项目。
近年来，关于中成药微生物限度检查的方法学验证试验的报道表明，通过方法学验证试验可以消除药物的抑菌作用，使检验结果更具有效性。养肝解毒丸是由山药、龙胆草、败酱草、夏枯草、灵芝、牡丹皮、山茱萸等十二味中药组方组成的复方制剂。其主要功能是滋肾，解毒。现根据《中国药典》2015年版四部微生物限度检查法规定，必须对其检查方法进行验证，笔者通过对养肝解毒丸进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及相关控制菌的测定建立了适合的微生物限度检查方法并对方法进行验证，确保了检测方法的可行性。
1试验材料
1.1仪器
GNP-9270BS-Ⅲ型隔水式恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司；101A-1型数显电热鼓风干燥箱，深圳市亿博兰电子有限公司；MLS-3780型高压蒸汽灭菌器，日本三洋。
1.2试药
养肝解毒丸（泰安市中医医院，批号：151201，151202，151203）。
1.3培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104593）；胰酪大豆胨液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104633）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104369）；沙氏葡萄糖液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3103279）；肠道菌增菌液体培养基培养基；（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104601）；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104591）；麦康凯液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104449）；麦康凯琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104517）；RV沙门菌增菌液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104566）；木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3104616）。
1.4稀释剂、冲洗剂
氯化钠一蛋白胨缓冲液（北京陆桥技术有限责任公司，批号：140424）、0.9%无菌氯化钠溶液。
1.5菌种
实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
以下菌株均购自山东省食品药品检验研究院（符合药典标准规定）。
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003第4代]；铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104第4代]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501第4代]；大肠埃希菌[CMCC（B）44102第4代]；乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50 094第4代]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001第4代]；黑曲霉[CMCC（F）98 003第4代]。
2验证方法与结果
2.1菌液的制备方法
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和沙门菌的新鲜培养物至10mL胰酪大豆胨液体培养基中，将上述各培养基均置于隔水式恒温培养箱（30～35℃）中培养18～24h。分别取各培养物1mL，加0.9%无菌氯化钠溶液9mL，10倍递增稀释制成每毫升含菌数为小于100cfu的菌悬液。
取白色念珠菌的新鲜培养物至10mL沙氏葡萄糖液体培养基中，置生化培养箱（20～25℃）培养2～3d，取培养物1mL，加0.9%无菌氯化钠溶液9mL，10倍递增稀释制成每毫升含菌数小于100cfu的菌悬液。
取黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，置生化培养箱（20～25℃）培养5～7d，使大量的孢子形成。用5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，过滤孢子悬液至无菌试管内，取该孢子液1mL，加含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9mL，10倍递增稀释制成每毫升含孢子数为小于100cfu的孢子液。
2.2供试液的制备方法
每批样品从两个最小包装里取供试品10g，加pH 7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100mL，混匀，作为1：10供试液。
2.3培养基适用性检查
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的菌液各不大于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养18～24h，计数；取白色念珠菌、黑曲霉的菌液各不大于100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，棍匀，凝固，置20～25℃培养5～7d，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。见表1。
2.4验证方法：薄膜过滤法
试验组：取上述1：10的供试液10mL过滤，用pH 7.0的氯化钠一蛋白胨缓冲液300mL分3次冲洗滤膜，在最后一次冲洗液中加入上述稀释的5种菌的菌悬液1mL（小于100cfu），过滤，取出滤膜，贴于相应的培养基中，胰酪大豆胨琼脂培养基置30～35℃培养3～5d，沙氏葡萄糖琼脂培养基置20～25℃培养5～7d，测定试验菌数。
供试品对照组：取上述1：10的供试液10mL过滤，用pH 7.0的氯化钠一蛋白胨缓冲液300mL分3次冲洗滤膜，取出滤膜，贴于相应的培养基中，胰酪大豆胨琼脂培养基置30～35℃培养3～5d，沙氏葡萄糖琼脂培养基置20～25℃培养5～7d，测定试验菌数。
菌液对照组：将pH 7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液100mL置于过滤器中，加入不大于100cfu的试验菌液，过滤后取出滤膜贴于相应的培养基中，胰酪大豆胨琼脂培养基置30～35℃培养3～5d，沙氏葡萄糖琼脂培养基置20～25℃培养5～7d，测定试验菌数。
验证结果：依照下列公式，计算五种菌的回收率，结果见表2～4。
试验组菌比值=（试验组平均菌落数一供试品对照组的平均菌落数）/菌液对照组的平均菌落数。
由表2～4可见，采用薄膜过滤法对养肝解毒丸进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数比值的测定，五种菌的比值均在0.5～2的范围内，符合《中国药典》2015年版四部微生物限度检查验证要求，故薄膜过滤法可用于养肝解毒丸的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查。
2.5控制菌（耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌和沙门菌）检查方法的验证
耐胆盐革兰阴性菌：取1：10的供试液100mL，混匀，在20～25℃培养2h。取供试液3份，每份10mL，加入100mL肠道菌增菌液体培养基，其中一份加入1mL大肠埃希菌作为阳性对照，一份加入1mL金黄色葡萄球菌液作为阴性菌对照，一份不加菌作为供试品检查，均培养24～48h后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，依法培养，观察菌落形态。
大肠埃希菌：取1：10的供试液3份，每份10mL，加入100mL麦康凯液体培养基，其中一份加入1mL大肠埃希菌作为阳性对照，一份加入1mL金黄色葡萄球菌液作为阴性菌对照，一份不加菌作为供试品检查，均培养24～48h后，划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，依法培养，观察菌落形态。
沙门菌：取10g供试品接种至100mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h。取上述培养物3份，每份0.1mL，加入10mL RV沙门菌增菌液体培养基，其中一份加入1mL乙型副伤寒沙门菌作为阳性对照，一份加人1mL金黄色葡萄球菌液作为阴性菌对照，一份不加菌作为供试品检查，均培养24～48h后，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，依法培养，观察菌落形态。
验证结果：见表5。
由表5可见，采用常规法，控制菌能正常检出，阴性对照未检出，符合《中国药典》2015年版四部微生物限度检查控制菌检查验证要求，所以常规法可用于养肝解毒丸的控制菌检查。
通过以上验证实验证明，养肝解毒丸的微生物限度检查方法，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查可采用薄膜过滤法，采用常规法控制菌也能正常检出，由此确定验证方法成立，本实验室建立的该项目的检查方法符合规定。
3讨论
按照2015年版《中国药典》四部的要求，在进行药品微生物限度检查时，只有在该检验条件下的样品浓度不足以抑制污染微生物的生长时，才能使供试品中的微生物得到真实反映，从而保证检验结果的科学性和准确性。有很多文献就具有抑菌成分的中成药的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检验方法进行了探索和研究。中药制剂是含有多种成分的复合制剂，其中任何成分具有抑菌作用均可影响微生物限度检查的准确性，因此必须对药品的微生物限度检查方法进行严格的验证，才能保证检查方法的完整性和可靠性。
3.1实验室的检验环境对试验方法的影响
2015年版《中国药典》对微生物限度检查的环境提出了明确的要求：应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行，B级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器（HEPA）。应严格按照相关国家标准进行定期的环境监测，并制定清洁、消毒和卫生的标准操作规范，防止检验过程中环境造成检品的假阳性。
3.2预处理
在进行薄膜过滤时须先将供试液采用适宜的方法进行预处理，然后再移至带有冲洗液的滤罐中充分混匀后再进行减压抽滤，否则由于供试液杂质太多造成滤罐堵塞引起滤罐爆裂，可能造成人员伤害。在过滤完后必须进行二次冲洗，以保证抑菌成分的彻底清除。可将取出的滤膜正面向上贴于培养基上，经多次试验证明，这样培养出的菌落大并且清晰，特别是在菌落数较多时，菌落会向周围的培养基扩散，不至于菌落都堆积在一起，不利于菌落计数。
3.3菌落计数误差对验证方法的影响
当细菌生长小而密集时，极易发生计数误差。故菌落计数时应仔细观察，必要时借助放大镜或低倍显微镜，以排除药渣和小气泡干扰计数；如难区别，可适当延长培养时间。
3.4药品微生物检验用的试验菌
试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加菌种变异的风险。制备后的菌液若在室温下放置，应在2h内使用；若保存在2～8℃，可在24h内使用。
微生物的培养方法篇2
关键词 : 微生物检验;研究进展;发展趋势;
在诸多领域的工作中都涉及微生物检验环节，如食品、药品等的检验，对保障相关产品的质量具有重要作用。微生物检验也是实验室检测的重要手段，根据检测需要和实际情况采取相应的微生物检验手段能更好地提升微生物检验效果与水平，这就需要相关人员不断深入研究微生物检验技术，把握好微生物检验的发展趋势，使其在相关工作中得到更好的应用。
1、 微生物检验技术概述
微生物检验主要是对部分产品（一般是口服的食品、药品）中的微生物污染开展定性或者定量检验的技术。该技术涉及诸多领域与行业，如食品、饮用水、外用或口服的药品、需灭菌的产品和化妆品等，此类产品卫生标准有明确的规定，通过微生物检验技术对其微生物污染实现严格控制，避免各类有害病原微生物侵入人体而对广大消费者的健康造成危害。在微生物的常规检验中，主要的测定内容有需氧菌的总数、霉菌的总数、肠道的致病菌、化脓性的致病菌、食物的中毒菌、破伤风的厌氧菌、活螨虫和螨虫卵以及大肠菌群等。在微生物检验中，一定要严格执行检验的程序，在样品检验前一定要对操作的环境提前采取灭菌处理，操作期间谨防出现二次污染[1]。
在微生物检验中，基本操作有接种、分离纯化、培养、鉴定和保存等。在接种方面，常用的方法有划线接种、三点接种、穿刺接种、浇混接种、涂布接种、液体接种、注射接种、活体接种等。对培养基完成高压灭菌后，通过已灭菌处理的工具在无菌条件下进行含菌材料向培养基上接种。在分离纯化方面，若一个菌落内的所有细胞都来自一个亲代细胞，此菌落就被称作纯培养。在鉴定菌种时，用到的微生物要求是纯培养物，而纯培养物的获取就是分离纯化的过程，方法也有很多，如倾注平板、涂布平板、平板划线、富集培养、厌氧处理、单细胞分离等。在培养方面，以培养时对氧气的需求情况为标准，可以分为好氧培养、厌氧培养；以培养基的物理状态为标准，可以分为固体培养、液体培养。在鉴定方面，主要涉及形态学的观察、生理生化的试验、化学成分的分析、基因型的分析、系统发育的分析等内容。在保存方面，基本原理是挑选优良的纯培养物，使其处于休眠状态，然后人为创造有利于其休眠的环境，使其在长期保存后依然具备菌种原有的优良特性[2]。比较常用的方法有定期移植方法、液体石蜡方法、真空冷冻干燥法、低温冻结方法等。
2、 基因检测在微生物鉴定中的应用进展
在微生物鉴定中，基因检测是一种新技术，目前已经研究出下一代测序（Next Generation Sequencing,NGS），此方法主要是对大量DNA的小片段进行检测，通过特定算法对个体检测的数据与参考基因的序列实施对比，发现可能存在的变异情况。以医学临床中的微生物检验为例，NGS可以用于感染性疾病病原体的鉴定。对病原微生物的传统鉴定方法主要包括涂片镜检处理、分离培养、质谱和生化反应等，但此类方法呈现出周期长、灵敏度低和过程复杂等缺点，对分枝杆菌的菌种鉴定用时需30～40 d，对苛养菌、病毒等的培养条件也极为苛刻，大大增加了培养的难度。分子诊断基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）有效解决了上述病原体的鉴定问题，但不能解决未知的微生物检验难题，因为未知的微生物核酸序列也未知，无法设计引物，这也成为该技术最大的难题[3]。在NGS检测中，不需要对病原体实施分离培养处理，也不依赖已知的核酸序列，能直接实现标本的测序、鉴别，有效节省了检测时间、提升了诊断效率，在对未知物种和难培养病原体的鉴定中具有显着的优势。在对病原体的鉴定中，NGS的应用主要包括两种方法，分别是r RNA基因测序、全基因组测序（Whole Genome Sequencing,WGS）。其中，r RNA基因测序法在临床上主要用于细菌和真菌等鉴定，也是菌群分析环节的基础；WGS和r RNA基因测序方法相比，WGS能获取更加全面的信息，适合在病毒的鉴定中使用。大部分的病毒是不可培养的，且存在高度变异的情况，NGS和基因芯片、Sanger测序法等相比，NGS具有更高的效率，也不需要设计特定探针，适用于复杂的临床标本病毒鉴定。
3 、微生物鉴定技术的研究进展
微生物鉴定的定义是以现有的分类系统对未知微生物的特征实施测定，以对其实施细菌、霉菌和酵母菌等大类区分，或对属、种和菌株水平进行确定的过程。在鉴定污染微生物时，一般结合鉴定的水平合理选择鉴定的方法。在微生物的鉴定中，传统方法（经典的生化反应、革兰氏染色的显微镜鉴别等）一般适用于大多数非无菌类药品的生产以及部分无菌生产环境中的风险评估。但在药品的微生物污染相关事件中，通过传统的方法并不能满足快速分型、准确鉴定和溯源分析等需求，所以，研究分子生物学时产生的基因型鉴定法逐渐得到应用[4]。
采用传统技术鉴定表型主要包括菌落形态的观察、染色、生化鉴定、显微镜检查等环节，呈现出成本低和便于操作等优点。但微生物表型存在一定的可变性，不同的生长环境会对其表观形态产生影响，如不同培养基内的微生物可能有不同的颜色。同时，传统表型鉴定技术对人员经验和培养条件较为依赖，在一些生长缓慢、培养难度大、需特殊营养的微生物鉴定中具有很大的局限性。随着社会的发展，现代化的微生物鉴定技术逐渐在药品污染的微生物鉴定、溯源分析以及污染调查等方面得到广泛运用，此类技术实现了对传统表型鉴定的拓展与丰富，如生化鉴定系统（如VITEK和API的系统）、FTIR（傅里叶红外光谱）、MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）、以碳源分析为基础的全自动化微生物鉴定系统、脂肪酸鉴定系统等，有效提升了微生物的鉴定效率和药品质量的控制水平。
随着鉴定技术的发展，基因型鉴定技术被研发出来，这是一种以微生物的基因序列为基础，对其分子实施生物学鉴定的技术，不依赖微生物的培养，是一种现代化的鉴定技术类型。基因型鉴定技术和表型鉴定技术存在很大不同，其数据库较为完善，能以微生物的遗传物质为基础，通过差异分析对微生物进行鉴定，呈现出高效率、高准确度和高通量等特点。在自然环境中，约有10%的物种能以分离培养的方法获取，以微生物的培养为基础的传统表型鉴定具有很大的应用局限性，而采用基因型鉴定，以16S r RNA的高通量式测序法获取的微生物群落信息就十分全面。当然，基因型鉴定也有一定的缺陷，使用16S r RNA法时，不能对某些亲缘较近、不明显的特征序列类微生物进行准确鉴定；采用高通量的测序分析混合样本时，不能有效排除已死亡的微生物干扰因素等[5]。
4、 微生物检验技术的发展趋势
在微生物检验技术的发展过程中，逐渐产生了很多技术类型，各有优缺点。为了有效地弥补各检验方式的缺陷，可以对多种方式实现联合运用。在选择检验方式时，需要综合考虑相应条件，特别是检验中对灵敏度的要求。因此，提升灵敏度、消除假阳性是检验技术研究过程中的重要关注内容。在计算机技术迅速发展的背景下，微生物检验技术朝着高度自动化以及简便快速的方向发展。目前，分子生物学相关技术在自动化的仪器联合中，已经被运用于病原菌的诊断和鉴定、耐药基因的检测等方面。要想实现高质、高效和价格低廉等有效统一，就要改变临床中病原菌的检验现状以及传统观念，在各学科的交叉发展中，新型检验技术也会越来越多。
近年来，新型技术得到了迅速发展，如电化学和比浊法等技术，可以对药品内的活微生物实现直接测定；固相细胞的计数法以及流式细胞的计数法等，能分析微生物细胞内的特定成分。上述技术能提高药品检测的准确性，也能保证检测人员的安全，因此，应用前景十分广阔。基于技术的迅速发展，要想实现药品中微生物检验的进步，还要完善检验标准，提升相关检验人员的综合素质和专业水平。因为药品检验期间需要人工操作，操作人员的技术水平会对检测结果产生直接影响。为了提升操作人员的技术水平，要对检测人员开展定期培训。目前，在药品微生物的检验中，软硬件设备都得到了显着改善，且药品的微生物检验技术也朝着标准化方向发展，特别是对无菌制剂的研究已取得显着成就，推动着检验项目和方法、药典制定的依据等朝着更科学的方向发展[6]。
5 、结语
微生物的检验在诸多领域得到了应用，也逐渐产生了很多检验技术和方法，各有优点与不足。为了促进相关技术作用的充分发挥，还需要对检验技术不断进行研究，把握好检验技术的发展趋势，推动检验技术的现代化发展。
参考文献
[1]白梅临床微生物检验的快速诊断技术研究进展[J]家庭医药，2018(7):59.
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[4]郑小玲,王银环,陈君豪,等药品微生物检验替代方法国内外研究进展[]药物分析杂志, 2020(4):8-13.
[5]李慧琴，黄亚娟.食源性病原微生物快速检验技术的应用与研究进展[J]食品安全质量检测学报，2019(16)-5369-5375.
微生物的培养方法篇3
关键词: 微生物学 教学改革 教学实践
微生物学是生物工程专业必修的专业基础课,它既是应用性和实践性很强的学科,又是当前生命科学中极其活跃、生命力强大的学科。[1]如何让学生通过微生物学教学,掌握微生物学的基本理论和技能,能从事生产与管理、产品开发、科学研究等工作,是微生物学教学中存在的一个突出问题。为了使微生物学教学适应生物工程产业的需要,使学生在有限的时间内学好微生物学基础知识的同时培养学生的创新能力,我们在微生物学教学中进行了如下改革与实践。
1.明确教学目的,转变教学思想
应用型人才培养是着眼于理论的运用,突出应用性,重视培养学生的实践能力。因此,制定微生物学课程教学计划的关键是如何安排好理论与实践教学课程设置,在学时安排上,我们将理论课学时数与实验课学时数之比从原来的7∶3调整为6∶4。使学生不但要学习好理论知识,更要在实践中掌握微生物学的应用技能,积累实践经验。[2]
面对新的人才培养目标要求,在总结以前教学工作的基础上,我们转变教学思想。从培养应用型人才的目标出发,我们将教学大纲进行重新调整。具体做法是:(1)将教材中容易理解的内容,编写自学提纲让学生自学,并作适当的课后辅导,培养学生的自学能力。(2)对那些相互间既有联系又重复的章节,进行重新编排,合并讲解,既节约时间又更加清晰。(3)与实验课密切相关的内容,纳入实验课的教学中,丰富了实验课内容,减轻了理论课的压力。(4)在教学过程中重视使用幻灯机、投影仪、多媒体和网络技术等现代教学手段,使教学活动变得更加更观、生动和富有吸引力,而且可以在短时间内传授大量的知识。上述措施可以将原来的教学内容压缩1/3左右,就可以利用有限的时间,完成微生物学教学任务。
2.改革教学方法,培养学生自学能力
现代教育思想表明,教学方法应将素质教育、知识传授和能力培养融为一体。教学的主要任务是“授之以鱼不如授之以渔”,即教师应将教学重点放在学生自学能力的培养上。在微生物学教学中,单纯采用传统的教学方法,将大量的微生物学专业名词及抽象的理论硬“灌输”给学生,将会使他们产生厌倦的情绪,既不利于知识的获取,又不利于能力的培养。因此,在微生物学教学过程中,教师必须引导学生探究微生物学知识的认识过程,让学生了解微生物学概念和原理是在如何产生的,让学生明白微生物学实验的原理、操作方法。当学生了解了知识的“背景”后,便可以用这种方法去获取更多的知识,为毕业后继续学习打下坚实的基础。[3]
在教学过程中,为了更有效地激发学生学习的主动性,更好地培养学生的能力,我们坚持教研室集体备课。在备课时,分别列出微生物学教材中的重点知识、一般知识和学生自学章节的提纲,分别发给学生。在授课时,结合各章节具体内容,采用不同的教学方法,引导学生运用分析、综合和归纳的方法主动地学习,使他们对教材内容有比较深刻的领会。例如生物类群形态结构时,可将各种微生物的类群和结构先作扼要介绍,如各类微生物的形态结构、菌落形态牲和繁殖方式有何异同,它们之间是如何区别和分类的,让学生带着问题听课,将会收到事半功倍的效果。在本章节内容讲完后,再针对性地出一些具有一定难度的思考题,供学生在课后复习之用。学生要完成思考题,必须在网上或图书馆查资料。这样不仅能拓宽、强化专业知识,而且能锻炼自学能力。
3.重视实验课教学,培养学生实验技能
微生物学是建立在实验之上的一门科学,微生物学理论知识必须通过实验来验证。因此,实验既是科学研究的手段,又是教学工作的手段。学生通过做实验,可以验证理论知识,使基本技能得到训练,还可以养成严肃认真的科学态度和实事求是的工作作风,培养从事科学研究工作的能力。因此,结合我校的具体情况,我们对能开出的实验,如糖发酵实验、理化因素的诱变效应和噬菌体的分离与纯化等都尽力开出。对于不易开出的实验,如动物病毒鸡胚培养法、昆虫病毒的培养和吞噬作用等,利用放碟片的方式向学生介绍,开阔学生的视野。同时要求教师将科研和教学工作结合起来,成立课外研究小组,在教师的指导下,让学生自己动手搞科研,大大提高学生的实验技能。如我院2006级学生黄葆文、潘江等同学完成的“水牛奶酒的研制”项目,获得了2009年国家大学生挑战杯科技创新三等奖,并申请了国家发明专利。还有“桑椹饮料酒的酿制”项目、“黑米、黑芝麻婴儿营养食品的研制”项目等也获得了学校的科研奖励,并发表了科研论文。
4.培养创新能力,改革考试方法
在微生物学教学中,我们鼓励和引导学生独立思考,勇于提出自己的观点;教会学生逆向思维,大胆想象;充分开发学生创造性思维的潜能,培养创新能力。培养学生不怕困难、不怕失败,努力进取的精神也是很重要的,学生创新能力的大小,是衡量学校教学水平的高低和教育成败的重要标志之一,培养学生的创新能力也是微生物学教学改革的目标之一。
采取切实有效的措施,加强教学管理和考核是提高教学质量保证。[4]考核不应仅仅停留在检查学生对教材内容的理解和记忆水平上,而应将重点放在知识的应用上,即重点考核学生应用知识的能力、探索创新能力。为此,我们在试题的命题上作了改革,即将试题分为固定答案型和非固定答案型两大类。如在非固定答案中,给定所需的材料、仪器或设备,怎样确定一种微生物属于某种营养型等问题,目的是检查学生对所学知识的应用能力、创新能力等。
5.重视科学研究,提高教师素质
深化教学改革,开展教学、科学研究,是提高教师素质的重要途径之一。近年来的教学实践表明,要成为一名合格的微生物学教师,仅有微生物学理论知识是不够的,同时必须具备一定的科研能力。无科研工作的教师,许多知识仅停留在理论上,深入展开就显得力不从心。因此,要提高教学质量,除了要抓好课堂教学外,还要抓好科学研究。鼓励教师积极参与或主持科研课题,这样能既锻炼教师的科研能力,又能活跃学术气氛,还能使教师对理论知识的理解更加深刻,在教学过程中能对深奥理论知识的讲解做到深入浅出,言之有物,使学生为教师的知识所佩服,显著地提高教学效果。
参考文献:
[1]兰时乐,林元山,邓林伟等.生物工程专业微生物学教学改革的实践与思考[J].科技创新导报,2009,(18):168-169.
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[3]苏文金,周常义,苏国成等.微生物学精品课程建设的思考与实践[J].集美大学学报,2008,9,(1):55-58.
[4]何新益.《食品微生物学》教学改革方法探讨[J].中国教育导刊,2008,(5):88-89.
微生物的培养方法篇4
[关键词] 结石康胶囊；微生物限度检查方法；培养基适用性检查；方法验证；回收率；培养基稀释法
结石康胶囊是我公司研制开发的中药三类新药。它以经典名方三叶青、广金钱草、海金沙、琥珀、预知子等为基础，结合现代医学研究成果，合理配方，采用现代工艺技术精制而成，纯中药制剂。按中国药典2010年版要求〔1〕，进行了微生物限度检查方法及方法学验证的试验研究，建立了结石康胶囊的微生物限度检查方法。
1仪器材料与试剂
1.1仪器材料
LMQ.J3260型立式灭菌器（山东新华医疗器械厂）；BC-156A冷藏柜（青岛海尔）；JCE-GPL智能型数显干燥/培养箱（山东维坊医疗器械厂）BSC-1000-II-A2型生物安全柜（苏州华宇净化设备有限公司）；MJ-250-I型霉菌培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；GHP-9270型隔水式恒温培养箱{上海齐欣科学仪器有限公司）；SW-CJ-1F净化工作台（苏净集团安泰空气技术有限公司）；HTY-2000A集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）；TDL-40B离心机（上海安亭科学仪厂）。
1.2培养基及试液
营养琼脂培养基（批号100607）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号100514）、胆盐乳糖增菌液（批号1004272）、营养肉汤培养基（批号100624）、改良马丁培养基（批号090403）、曙红亚甲蓝培养基（批号090813）、四硫磺酸钠亮绿培养基（批号100215）、胆盐硫乳琼脂培养基（批号090902）、三糖铁琼脂培养基（批号090224）、MUG培养基（批号091202）、靛基质、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号100830）（中国药品生物制品检定所监制）0.9%氯化钠溶液、75%乙醇、碘试液、亮绿试液（按中国药典2010年版一部附录制备〔1〕）
1.3菌种：
大肠埃希菌（Escherichiacoli） 〔CMCC（B）44102〕
金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）
〔CMCC（B）26003〕
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis） 〔CMCC（B）63501〕
乙型付伤寒沙门（SalmonellaparatyphiB）
〔CMCC（B）50094〕
白色念珠菌（Candidaalbicans） 〔CMCC（F）98001〕
黑曲霉（Aspergillusniger） 〔CMCC（F）98003〕
1.4其它
1.4.1标准对照培养基：营养琼脂培养基（批号135003-201002）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号135005-201002）、胆盐乳糖增菌液（135006-201002）、营养肉汤培养基（135004-201002）。
1.4.2培养器皿、辅助材料试验前均为121℃湿热灭菌20min，备用。
1.5样品
结石康胶囊（河南羚锐制药股份有限公司），批号分别为100109、100120、100203。
2方法
2.1菌液的制备
2.2.1取经35℃培养22小时金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌的肉汤培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液，做活菌计数用。
2.2.2取经25℃培养24小时的白色念珠菌液体培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液，做活菌计数用。
2.3.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5天，加入适量0.9％无菌氯化钠溶液洗脱孢子，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为50～100的孢子悬液。
2.2供试液的制备
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，于45水浴保温溶解胶囊，用适宜的方法混匀，作为1：10的供试品溶液。
2.3培养基适用性检查〔1〕
2.3.1将试验用营养琼脂培养基（批号100607）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号100514）与标准对照培养基营养琼脂培养基（批号135003-201002）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号135005-201002）同法制备；分别加相应试验菌对比其菌回收，其结果均大于70；本批次培养基符合适用性要求。
2.3.2将试验用胆盐乳糖增菌液（批号1004272）、营养肉汤培养基（批号100612）与标准对照培养基胆盐乳糖增菌液（135006-201002）营养肉汤培养基（135004-201002）同法制备；分别加相应试验菌对比其促生长及抑制能力，其结果均符合检验性能，本批次培养基符合适用性要求。
2.4回收率〔1〕的计算
（1）试验组：取供试品（液）加入30-100 cfu试验菌，注皿，培养，计数。
（2）菌液组：直接加入30-100 cfu试验菌，注皿，培养，计数。
（3）供试品对照组：供试品（液）注皿，培养，计数。
回收率＝ （试验组菌落数－供试品对照组菌落数） ×100％
菌液组菌落数
2.5细菌、霉菌和酵母菌数计数方法验证〔2〕
2.5.1常规平皿法取2.2制备的供试液1ml加15~20ml菌落计数用琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养规定的时间后观察结果计数，测定菌回收率。
2.5.2培养基稀释法取2.2制备的供试液同一稀释级的供试液1ml，按培养基稀释法0.5ml/皿、0.2ml/皿操作，置规定温度培养规定的时间后观察结果计数，测定菌回收率。
2.6控制菌检查方法验证
2.6.1大肠埃希菌检查方法验证
2.6.1.1常规法
（1）试验组：取1：10的供试液10ml和1ml大肠埃希菌（约30～100cfu）加入100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。
（2）阴性对照组：取1：10的供试液10ml和1ml金黄色葡萄球菌（约30～100cfu）加入100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。
（3）阳性对照组：取1ml大肠埃希菌（约30～100cfu）加入100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。
检验按中国药典2010年版控制菌检验方法进行〔1〕。
2.6.2乙型付伤寒沙门菌检查方法验证
2.6.2.1常规法
（1）试验组：取供试品10g和1ml乙型付伤寒沙门菌（约30～100cfu）加入250ml的营养肉汤培养基中，培养18～24小时。
（2）阴性对照组：取供试品10g和1ml金黄色葡萄球菌（约30～100cfu）加入250ml的营养肉汤培养基中，培养18～24小时。
（3）阳性对照组：取1ml乙型付伤寒沙门菌（约30～100cfu）加入250ml的营养肉汤培养基中，培养18～24小时。
检验按中国药典2010年版控制菌检验方法进行〔1〕。
2.6.3大肠菌群检查方法验证
2.6.3.1常规法
（1）试验组：取1：10的供试液1ml和1ml大肠埃希菌（约30～100cfu）加入10ml的乳糖胆盐培养基中，培养18～24小时。
（2）阴性对照组：取1：10的供试液1ml和1ml金黄色葡萄球菌（约30～100cfu）加入10ml的乳糖胆盐培养基中，培养18～24小时。
检验按中国药典2010年版控制菌检验方法进行〔1〕
3结果
3.1：结石康胶囊的微生物限度检查方法计数方法验证结果见表1。
表1结石康胶囊微生物限度检查方法验证（常规法）
表1结果表明：结石康胶囊采用常规平皿方法检验时，人工污染5株代表菌株，该供试品试验结果大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉回收率高于70%，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有抑制作用，供试品平均回收率分别17%、11%均低于70%。故常规平皿法不适用该样品细菌数的测定，而霉菌及酵母菌计数可采用规法平皿法。
现用培养基稀释（0.5ml/皿）对该样品进行金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率测定，结果如表2
表2结石康胶囊微生物限度检查方法验证
（培养基稀释法0.5ml/皿）
表2结果表明：结石康胶囊采用培养基稀释法（0.5ml/皿）检验时，金黄色葡萄球菌的回收率均大于70%。而枯草杆菌三次的试验的回收率均低于70%。故培养基稀释法（0.5ml/皿）不适用该样品细菌数的测定。
现用培养基稀释（0.2ml/皿）对该样品进行枯草芽孢杆菌回收率测定，结果如表3
表3结石康胶囊微生物限度检查方法验证
表3结果表明：养基稀释（0.2ml/皿）消除供试品对人工污染枯草芽孢杆菌的抑制作用，回收率达到70%以上，因此此方法适合细菌数的测定。
3.2：结石康胶囊控制菌大肠埃希菌、乙型付伤寒沙门菌和大肠菌群检查的方法验证结果见表5、表6和表7：（常规法）
表5
表5结果表明：常规法检查大肠埃希菌时，实验组检出大肠埃希菌；阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌。因此，检查大肠埃希菌可采用常规法。
表6
表6结果表明：常规法检查沙门菌时，实验组检出沙门菌；阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌。因此，检查沙门菌可采用常规法。
表7
表7结果表明：常规法检查大肠菌群时，试验组检出大肠菌群，阴性菌对照组未检出阴性对照菌，因此大肠菌群可采用常规法。
4讨论
4.1微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法〔3〕。在复方中药制剂中，由于其成份多样性，所制备的供试液本身具有影响部分微生物生长的作用，若不经方法学验证，难以保证采用的方法适合该品种微生物限度检查，难以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。结石康胶囊是由浸膏及药粉组成，在常规检查时发现其污染微生物生长迟缓，样品有一定的抑菌作用，鉴于此，我们采用了培养基稀释法降低其药物成分浓度，经过试验，微生物生长有所改变，通过回收实验证实，结果准确、可靠；为此确立结石康胶囊的微生物限度检查方法：细菌计数采用培养基稀释法（0.2ml/皿）；霉菌和酵母菌计数采用平皿法；控制菌采用直接接种法。
4.2中国药典2010年版〔1〕规定计数验证的菌数50-100cfu的范围在实际操作过程中较难控制，建议菌数为30-100cfu，较为合理。
4.3试验表明：多数中药制剂对真菌基本无抑制作用，对细菌的抑制作用存在一定的差异；一般按品种特点通过不同的方法设计，各试验菌的回收率达到70%以上，从而确立适宜的微生物检验方法。
4.4在中药胶囊试验时发现：具有较强抑菌作用的胶囊制剂，在使用薄膜过滤法进行控制菌检查时，按常规方法制备的供试液很难进行过滤；鉴于此，供试液制备采用胶囊及药粉分离方法合理制备，从而达到理想的过滤效果。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010：70，附录ⅩⅢ.
[2]许华玉.药品微生物检查法的验证[R].2005，11，11.
微生物的培养方法篇5
[关键词] 纯化水；微生物限度检查；薄膜过滤法；检验量
[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（c）-0004-03
[Abstract] Objective To establish a more scientific and reasonable purified water microbial limit test method. Methods Membrane filtration method （sample quantity： 1 mL and 10 mL） were used to do the test， and nutrient agar， rose bengal agar medium， plate count agar and R2A medium were used to demonstrate the microbiology separately. Results Membrane filtration method （sample quantity： 10 mL） and R2A were better than the routine method and the other medium with a much higher occurrence of total aerobic plate count. The detection rate was 1-2 times higher than the rate of other method and medium. Conclusion The selected testing sample quantity and culture medium are optimal， and the optimized test method will reflect the real quality of the purified water. The study will provide support for the testing improvement and quality control level.
[Key words] Purified water； Microbial limit test； Membrane filtration method； Sample quantity
《中国药典》2010版、2015版纯化水微生物限度检查中要求使用薄膜过滤法进行检查[1-2]，但未对薄膜过滤法的检测量等进行明确规定。目前常被采用薄膜过滤法检验量1 mL。已有研究表明，薄膜过滤法1 mL和平板计数法1 mL两种方法的检测结果一致，无明显差异[3]，可见采用1 mL检验量并不能体现薄膜过滤法的优势。故薄膜过滤法1 mL的检测方法符合性、严谨性不够。
《欧洲药典》[4-5]、《美国药典》[6-7]和《英国药典》[8-9]对纯化水检测方法有不同的规定和侧重点。目前，大部分出口欧美市场的制药企业，均会按照目标出口国的国家药典要求进行纯化水检测，但对于这些检测方法的样品检验量，国内未见研究[10]。
本试验在分析2010～2012年三个年度纯化水微生物限度检测报告的基础上，拟以自制纯化水为研究对象，基于中国和欧美药典的方法，对比研究了不同方法和培养基的检测效果，明确了最佳检验量，同时明确了更灵敏的培养基，建立了更科学的纯化水检测方法。该方法的建立对于提高纯化水微生物限度检查的有效性、真实性和简便性具有重要的现实意义，并与国际标准接轨。
1 材料和设备
1.1 材料
纯化水（石家庄以岭药业股份有限公司）。
1.2 试剂及培养基
氯化钠（天津大茂化学试剂厂）；磷酸二氢钾（天津科密欧化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（天津博迪化学试剂厂）；蛋白胨培养基（北京三药科技开发公司）；营养琼脂培养基（缩写NA，北京三药科技开发公司）；玫瑰红钠琼脂培养基（缩写RBA，北京三药科技开发公司）；平板计数琼脂培养基（缩写PCA，青岛海博生物技g公司）；酵母蛋白胨葡萄糖琼脂培养基（缩写R2A，青岛海博生物技术公司，德国默克）。
1.3 设备
TW-STV3A型薄膜过滤器（瑞安市图班生物技术设备），XGL.GWX-0.36B型脉动真空蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械），FD240型干热灭菌烘箱（德国宾德），S20K型pH计（梅特勒-托利多仪器），PL202-S型电子天平（梅特勒-托利多仪器），AVC-4A1型垂直净化工作台（安斯克生物技术设备公司，ESCO），BD240型恒温培养箱（德国宾德）。
2 实验方法
2.1 检验量的对比研究
分别取1 mL和10 mL的纯化水，采用《中国药典》2015年版（CP2015）四部中的薄膜过滤法进行其微生物限度检查[2]。
取少量pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液注入过滤杯中，以湿润滤膜。湿润滤膜后取10 mL或1 mL纯化水样及20～30 mL的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，过滤，取出滤膜，薄膜菌面朝上，分别置于营养琼脂培养基和玫瑰红钠营养琼脂培养基表面，细菌35℃，培养3 d，霉菌/酵母菌23℃，培养5 d[2]（作者已按照企业操作规程对该方法进行方法学验证）。菌落计数器计数。
2.2 培养基检测效力的对比研究
采用《美国药典》USP-38（USP38）、《欧洲药典》EP7.0（EP7.0）、《英国药典》BP2015（BP2015）和CP2015中规定的薄膜过滤法[4，6，8]，设定检测量为10 mL，分别使用营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、平板计数琼脂培养基PCA和R2A培养基进行检测培养。具体操作方法同“2.1”项下方法，取滤过后薄膜，分别置于营养琼脂培养基、玫瑰红钠营养琼脂培养基、平板计数培养基和R2A琼脂培养基的平板表面进行培养，计数。
3 实验结果
3.1 检验量对比研究的实验结果
不同检测量的纯化水微生物检测结果见表1。通过实验可以看出，对于1 mL检验量的薄膜过滤法，19个水点的微生物限度质量均良好，只有2个水点检测出微生物污染，且菌落数少，检出率低（2/19），未发现任何不良趋势。对于10 mL检验量的薄膜过滤法，菌体检出率较高（7/19），是1 mL检验量时菌体检出率的3.5倍，5、10、15、18和19号水点均反映轻微微生物侵染，能够更好地反映纯化水的微生物限度情况。13号水点微生物污染程度接近警戒线，便于发现不良趋势，及时采取针对纯化水系统清洁维护的整改措施。可见，薄膜过滤法具有较好的集菌效果，10 mL的纯化水检测量适合于纯化水的微生物限度检查，样本代表性较好，菌体检出率高，能够更加准确和真实地反映纯化水质量，保证纯化水系统的持续、稳定、有效运行。
3.2 培养基培养效力对比研究的实验结果
使用不同培养基进行微生物限度检测的实验结果，见表2。通过以上实验可以看出，对于相同样本，使用营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基平板检测和使用PCA培养基平板检测的微生物检出率较低（前者共有21个水点未检出菌体，后者共有18个水点未检出菌体），检出情况基本一致，差异量均≤1 cfu/10 mL。并且使用营养琼脂与玫瑰红钠琼脂培养基检测需要制备两张滤膜，工作量较大。而采用R2A琼脂进行菌落计数，操作相对简单，每个水点只需要制备一张滤膜即可，并且菌体检出率较高，共计14个水点微生物限度检出（结果均
4 讨论
USP、EP、BP和CP中均规定采用薄膜过滤法进行纯化水微生物限度检查，但对于纯化水的检验量都未明确规定，要求各单位根据实际用水情况和所安装纯水系统性能自定检验量[10]。纯化水水质是决定检验量的基础，通过本文的系统实验表明当前大多企业为追求操作简单只选定1 mL作为检验量是有所局限的，这个量并不能真实反映纯化水的质量，也不利于纯化水系统的监测和维护。
纯化水微生物限度年度质量回顾和趋势分析是确定检验量的重要依据，本研究基于石家庄以岭药业股份有限公司3年来大量的纯化水分析数据，找到了较合适的检验量，供读者参考应用。
实验中发现使用营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基的培养效果与使用PCA培养基的培养效果基本一致，可能只检出了水样含菌总数的一部分，未能完全反映水样中微生物的存在情况，这与顾孔珍等[11]的报道一致。R2A培养基属于低营养类培养基，其营养成分较广泛，能促进受损细菌的恢复性再生长，更适用于纯化水的检测。这将避免由于培养基灵敏度不够而造成的纯化水质量不良趋势无法被发现的情况，能够及时准确地反映纯化水系统运行情况，及时维护，延长系统寿命。
本文研究所确定的方法可大大提高纯化水微生物限度检测的有效性，有利于生产和检验中纯化水质量的控制。同时，也为其他制药企业建立合适的纯化水微生物限度法提供参考和指导。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：78.
[2] 国家药典委员会.中国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：579.
[3] 陈力奋，刘建国，屈晓萍，等.用平皿法检测纯化水的微生物限度[J].海峡药学，2006，18（1）： 88-89.
[4] 欧洲药典委员会.欧洲药典7.0[S].2013：3561.
[5] 欧洲药典委员会.欧洲药典8.0[S].2016：3561.
[6] 美国药典委员会.美国药典38[S].2015：1231.
[7] 美国药典委员会.美国药典39[S].2016：1231.
[8] 英国药典委员会.英国药典2015[S].2015：各论0008.
[9] 英国药典委员会.英国药典2016[S].2016：各论0008.
[10] 张杰.纯化水系统的微生物控制方法研究[J].医师在线，2015，2（17）：400.
微生物的培养方法篇6
常用灭菌方法有：灼烧灭菌，将接种工具如接种环、接种针灭菌;干热灭菌：如玻璃器皿、金属用具等需保持干燥的物品。高压蒸汽灭菌：如培养基的灭菌。小编为大家整理的高中生物学科知识点归纳资料，提供参考，欢迎参阅。
知识点一
1、培养基的种类：按物理性质分为固体培养基和液体培养基，按化学成分分为合成培养基和天然培养基，按用途分为选择培养基和鉴别培养基。
2、培养基的成分一般都含有水、碳源、氮源、无机盐P14
3、微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。
4、培养基还需满足微生物对PH、特殊营养物质以及O2的要求。
5、获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。
6、常用灭菌方法有：灼烧灭菌，将接种工具如接种环、接种针灭菌;干热灭菌：如玻璃器皿、金属用具等需保持干燥的物品。高压蒸汽灭菌：如培养基的灭菌。
7、用固体培养基对大肠杆菌纯化培养，可分为两步：制备培养基和纯化大肠杆菌。
8、固体培养基的制备：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板
9、微生物常用的接种方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
10、平板划线法是通过连续划线，将菌种逐步稀释分散到培养基表面，稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，分别涂布到培养基表面。当它们稀释到一定程度后，微生物将分散成单个细胞，从而在培养基上形成单个菌落。
11、微生物的计数方法：活菌计数法、显微镜直接计数法、滤膜法。
12、活菌计数法就是当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少个活菌。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的只是一个菌落。
13、显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法，但它包括了死亡的微生物。
14、设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响。提高实验结果的可信度。①如何证明培养基是否受到污染：实验组的培养基中接种要培养的微生物，对照组中的培养基接种等量的蒸馏水(设置空白对照)。②如何证明某选择培养基是否有选择功能：实验组中的培养基用该选择培养基，对照组中培养基用普通培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)。如果普通培养基的菌落数明显大于选择培养基中的数目，则说明该选择培养基有选择功能。
15、如何分离分解尿素的细菌?培养基中以尿素为唯一氮源，加入酚红指示剂，如果PH升高，指示剂变红，可初步鉴定该菌能分解尿素。
16、如何分离分解纤维素的微生物?以纤维素为唯一碳源的培养基。
17、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三组分：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
18、筛选纤维素分解菌的方法：刚果红染色法，其原理是刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。(产生了透明圈，说明纤维素被分解了，说明有纤维素分解菌)
知识点二
1、菊花组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。
2、常用的培养基是MS培养基：主要成分包括：大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S;微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co;有机物：如甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素以及蔗糖等，常常还要添加植物激素。
3、生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。
1)按照不同的顺序使用，会得到不同的实验结果。
①先使用生长素，后使用细胞分裂素：有利于细胞分裂，但细胞不分化;
②先使用细胞分裂素，后使用生长素：细胞既分裂也分化。
③同时使用：分化频率提高。
2)两者用量的比例影响细胞的发育方向：
4、花粉是单倍体的生殖细胞，花粉的发育要经历小孢子四分体时期，单核期和双核期等阶段。
5、通过花药培养产生花粉植株(单倍体植株)一般有两种途径：
究竟是哪种途径主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
6、影响花药培养的因素：材料的选择和培养基的组成，此外，亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等都有影响。
7、月季的花药培养一般选初花期，并且选择单核期的花粉。选择花药时，一般通过镜检来确定花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的常用方法：醋酸洋红法，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青——铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
知识点三
1.果酒制作：
1)原理：酵母菌的无氧呼吸 反应式：C6H12O6 2C2H5OH+2CO2+能量。
2)菌种来源：附着在葡萄皮上的野生酵母菌或人工培养的酵母菌。
3)条件：18-25℃，密封，每隔一段时间放气(CO2)
4)检测：在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈灰绿色。
2、果醋制作：
1)原理：醋酸菌的有氧呼吸。
O2，糖源充足时，将糖分解成醋酸
O2充足，缺少糖源时，将乙醇变为乙醛，再变为醋酸。
C2H5OH+O2CH3COOH+H2O
2)条件：30-35℃，适时通入无菌空气。
3、腐乳制作：
1)菌种：青霉、酵母、曲霉、毛霉等，主要是毛霉(都是真菌)。
2)原理：毛霉产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和aa ;脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
3)条件：15-18℃，保持一定的湿度。
4)菌种来源：空气中的毛霉孢子或优良毛霉菌种直接接种。
5)加盐腌制时要逐层加盐，随层数加高而增加盐量，盐能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。
4、泡菜制作：
1)原理：乳酸菌的无氧呼吸，反应式：C6H12O62C3H6O3+能量
2)制作过程：①将清水与盐按质量比4：1配制成盐水，将盐水煮沸冷却。煮沸是为了杀灭杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响。②将新鲜蔬菜放入盐水中后，盖好坛盖。向坛盖边沿的水槽中注满水，以保证乳酸菌发酵的无氧环境。
3)亚硝酸盐含量的测定：
①方法：比色法;
②原理：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。
微生物的培养方法篇7
关键词：纤维素分解菌；刚果红；选择培养基；鉴别培养基
中图分类号：G633.91 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）23-0075-02
1 实验原理
本实验所用的染色剂刚果红（以下简称CR），它能够和多糖物质发生反应（比如纤维素、淀粉）形成红色物质，但是它并不能和多糖物质分解后的产物发生这种反应。当配置的培养基中含有纤维素的时候，加入CR，那么两种物质就会发生反应，结合成红色物质。假如培养基中有纤维素分解菌存在，纤维素就会被分解，那么红色物质就会消失，因此就会在纤维素分解菌菌落的四周呈现一个比较明显的透明圈。按照此种方法，就可以挑选出我们所需要的菌落。
2 实验流程
2.1土壤取样。在富含纤维素的环境中取土样，用无菌水溶解，取土壤浸出液待用。
2.2选择培养。取适量浸出液加入到纤维素分解菌的选择培养基中进行扩大培养增加纤维素分解菌的浓度。
2.3梯度稀释。取适量上述的培养液进行适当浓度的梯度稀释。
2.4将稀释后的样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
2.5刚果红染色法筛选产生透明圈的菌落。教材上提供的CR染色的方法主要有以下两种：
第一种实验方法：先配置适宜的培养基，然后放在适宜的条件下培养，当培养基上出现菌落后，然后加入配置好的适宜浓度的CR液体，大约染色15分钟左右，然后倒去多余的染液，再加入配置好的氯化钠溶液，大约15分钟后再除去氯化钠溶液，观察培养基上的菌落，周围有透明圈出现的菌落，就是我们所需要的纤维素分解菌（可能含有少量杂菌）。
第二种实验方法：先按要求配置好CR溶液，经过灭菌处理后，按照教材的要求以适当比例加入到培养基中，混合均匀后再制备平板。然后将培养基放到适宜条件下培养，长出菌落后，周围出现透明圈的即为所需菌落（可能含有少量杂菌）。
3 问题解惑
3.1上述两种实验方法各自有什么样的优势和缺陷呢？
我们先来看第一种方法，其主要缺陷在于培养基长出菌落之后，加入CR溶液时很容易把菌落冲散，从而会使两个甚至多个菌落发生混合，对筛选结果造成影响，出现杂菌。但是此种方法也具有优势的方面，那就是出现透明圈的菌落基本上就是分解纤维素的细菌形成的。
第二种方法的优势在于操作比第一种简单，而且不会出现第一种方法的相关问题；但是由于培养基中所用的某些成分（纤维素粉、马铃薯汁等）会含有少量淀粉，这样的话能够分解淀粉的细菌菌落周围也会出现透明圈，会给最后的筛选带来麻烦，这是本方法缺陷之一；第二个缺陷是，在微生物中，某些菌类是具有分解色素物质功能的，所以当培养基中有这些菌类存在时，他们可能会把菌落周围的CR分解掉，这样的话也会形成透明圈，同样会对实验结果带来干扰。
由上可见，两种方法都是各有利弊，在实际操作中到底选择哪种方法更好一些，还有待进一步探究。
3.2鉴别培养基加入了土豆汁，问题在于土豆汁中含有淀粉，淀粉也可以和CR结合成红色物质，这样分解淀粉的微生物就会影响本实验，既然如此，为什么培养基中的碳源不只加纤维素呢？
要解决上述问题，我们需要知道微生物对碳源的利用具有选择性，例如有的微生物具有分解纤维素的酶，那它就可以水解纤维素变成葡萄糖利用，而那些无分解纤维素酶的菌种，则不能生存。微生物自身的酶系统决定了其对碳源的利用方式，微生物往往能利用多种碳源，就像人一样，有钱时可以吃“大餐”，如果破产了，饿极了，窝窝头也照样吃。微生物对碳源的利用有速效碳源和迟效碳源之分，“大餐”就是微生物的速效碳源，利于吸收容易消化，比如葡萄糖或者淀粉；“窝窝头”就是微生物的迟效碳源，即微生物将速效碳源用完后为了生存，利用其他碳源，比如纤维素。
由上述可见，微生物在繁殖过程中利用培养基中的碳源有先后次序，即优先使用淀粉这样的速效碳源，当速效碳源耗尽后再使用像纤维素这样的迟效碳源。
在本实验中，选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，用纤维素粉作为碳源，把纤维素分解菌初步筛选出来，使其在培养液中占据优势。但是在鉴别选择的环节，将稀释后的样品涂布到鉴别培养基上时，细菌的密度要降低很多，这样的话不利于其发展成一个菌落，而马铃薯汁中的淀粉可以保证菌体的大量繁殖形成菌落。
微生物的培养方法篇8
关键词 微藻；异养；酵母浸粉；补糖
中图分类号 Q93-335 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）08-0178-02
Effect of Different Types of Yeast Extract Powder and Carbohydrate Supplement on the Growth of Heterotrophic Microalgae
ZHENG Shi-wen 1 ZHAO Yu-feng 2 BI Sheng-lei 1
（1 Henan Tianguan Group Co.，Ltd.，Nanyang Henan 473000； 2 Nanyang Normal University）
Abstract The heterotrophic microalgae was cultured in the culture medium compounded by FM802，FM902 and FM760 three different types of angel yeast extract powders.The culture conditions were temperature 28 ℃ and shaker rate 200 r/min of the shaking tables in darkness.In the process of cultivating had a carbohydrate supplement，and sampled 20 mL for analysis every 24 h，the experimental results showed that through carbohydrate supplement，the type for FM802 of yeast extract powder was slightly better than FM902 cultivate microalgae，the effect of FM760 was a bit poor.Carbohydrate supplement was benefit to increase the dry weight of microalgae.Microalgae still growed quickly when the pH value of culture medium was 4.2～4.5.
Key words microalgae；heterotrophic；yeast extract powder；carbohydrate supplement
生物柴油可持续发展，须有稳定和优质的原料来源，用微藻来生产生物柴油具有很大优势[1-2]。在合适培养系统下以太阳光为能源，充分利用废气、废液甚至废固培养微藻，提高藻油生产率，降低生物柴油的生产成本，实现工业化生产[3]。英国碳信托（Carbon Trust）预计，到2030年微藻生物能源行业可以创造150亿英镑的年产值，并且能够满足全球12%的飞机燃油需求，可以减少1.6亿t的二氧化碳排放（微藻的整个碳生命周期显示，相对于传统化石能源，它可以减少70%～80%的二氧化碳排放）[4]。微藻多为光合自养，但光合自养微藻的生物产量较低，异养培养可以克服光合自养培养的诸多缺陷。与未经转化的自养性小球藻相比，异养藻最大生物量是自养时的3.2倍，蛋白质、碳水化合物及叶绿素含量降低，自身既有油/脂质含量高的倾向性，异养藻细胞的粗脂肪含量提高了4倍以上。微藻异养培养可利用传统微生物发酵系统，可通过选择营养质和设置发酵条件，提高油含量，所以微藻异养培养是提高微藻产量与产油效率的有效途径[5-10]。由于异养培养微藻能耗高，培养成本高，目前普遍用来生产高附加值脂肪酸，而用来生产生物柴油成本过高，且会失去CO2减排的价值。因此异养藻细胞发酵产量和油脂含量需不断创造新高，清华大学微藻生物能源实验室早在2009年就发明了微藻异养发酵生产生物柴油新技术，所培养细胞干重达100 g/L，含油量为细胞干重60%以上，提高了该技术工业化生产的经济性[11-12]。为实现微藻高密度、高含油率、低成本培养生产生物柴油，研究异养法培养微藻，探讨培养过程中补充葡萄糖对微藻生长影响。
1 材料与方法
1.1 藻种
藻种是由清华大学微藻生物能源实验室提供的Chlorella protothecoides 0710 strain，用基础培养基配制的琼脂平板筛分，将群落规则、边缘清晰、形状饱满的黄色藻种挑选出来，用基础培养基经二级放大用于试验。
1.2 培养基组成及培养条件
培养基组成：基础培养基为微藻自养Pr培养基添加葡萄糖30 g/L（多数文献上葡萄糖添加量为10 g/L[13-14]）和酵母粉3g/L配制而成，pH值为自然。试验培养基只改变酵母粉的型号，用量及其他成分不变。
培养条件：1 000 mL三角瓶装培养基500 mL，121 ℃灭菌30 min。在超净工作台上将培养好的种子液用50 mL移液管转接入试验培养基中。在28 ℃、200 r/min的摇床中进行暗培养，每隔24 h取样20 mL进行分析检测。
1.3 检测方法
采用液相色谱仪检测培养基中的葡萄糖含量；采用血细胞计数法检测微藻的生物量[15]；采用重量法检测微藻的干物质重；用pH测量仪测定培养基的pH值变化。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖含量
由图1可以看出，0～24 h，葡萄糖含量下降速率很小，24～96 h，葡萄糖消耗速率较大，96 h时葡萄糖含量降到3 mg/mL左右。在120 h时，补加0.5 g/mL葡萄糖溶液30 mL后取样，用液相色谱仪测出补糖后FM802、FM902和FM760酵母粉培养液中的葡萄糖含量分别为34.77、34.82、34.19 mg/mL。继续培养可以发现型号为FM760的酵母浸粉培养液的耗糖速率比其他2个型号的要小。120～144 h，FM802和FM902培养液葡萄糖消耗速率均超过0.40 mg/h，而FM760培养液葡萄糖消耗速率不到0.25 mg/h。
2.2 生长曲线
大多数微生物生长曲线都呈S型，微藻也不例外。
由图2可以看出，0～24 h微藻细胞数基本不变，这段时间是微藻生长的迟缓期。24～48 h，这段时间是微藻的对数生长期，细胞数增加了4～6倍。FM902培养液中微藻的细胞数比FM760培养液中多0.5×108个/mL以上；比FM802培养液中多不到0.2×108个/mL，随着培养的进行这个数据在不断缩小。
120 h时，培养液中的葡萄糖被消耗完，有少部分微藻细胞死亡，细胞数量略有减少。补糖后继续培养，细胞数缓慢增加，没有出现快速增长情况，到葡萄糖消耗完，型号为FM902的培养液中细胞数增加了0.8×108个/mL，其他2个型号均增加了1×108个/mL左右。最终FM802培养液中细胞数比FM902多，由此可见，FM802酵母浸粉作为氮源效用比较持久。FM760酵母浸粉的培养效果相对来说较差。
2.3 干物质重
该试验采用重量法，将10 mL培养液离心后将底部藻细胞水洗后再次离心，把离心后粘在离心管壁上的藻细胞用蒸馏水洗至恒重的洁净玻璃皿中，放于105 ℃的烘箱中烘至恒重。称量得到微藻的干物质重。
由图3可以看出，0～48 h，干物质重增加缓慢，从初始的干物质重2～3 g增加到5 g左右。48～72 h，干物质重增加了4 g左右。在96～120 h期间，葡萄糖消耗完时，干物质重只增加了0.1 g，FM802和FM902的干物质重达到10.5 g/L，而FM760只有9 g/L。
补糖后，3个型号的酵母粉培养液中微藻的干物质重均在增加，120～192 h，FM802培养液中干物质重平均增长量为0.097 g/L/h，FM902培养液的干物质重平均增长量为0.090 g/L/h，而FM760培养液的干物质重平均增长量只有0.078 g/h。在240 h葡萄糖再次消耗完时，FM802、FM902和FM760培养液中微藻的最终干物质重分别为18.7、18.4、17.3 g/L。
由补糖前后对比可以发现，第1次葡萄糖消耗完时，微藻干物质重为10 g/L左右，补糖后，当第2次葡萄糖消耗完时，微藻干物质重能达到18 g/L左右。而培养液中的微藻细胞数只增加了1亿个/mL左右，说明培养基中只补充碳源有利于微藻细胞干物质重的增加。其干物质重的增加主要是油脂含量的增大，葛珍珍等[16]经过4次分批补料，微藻的生物量达到了65.25 g/L，然后进行缺氮培养12 h，小球藻的油脂含量由42.75%提高到了63.82%，油脂产量达43.37 g/L。李玉芹等[17]也得出了与氮充足时相比，氮缺失条件下，蛋白质吸收峰强度骤然降低43.22%，油脂增高1.41倍，碳水化合物提高6.04%的结论。
2.4 pH值变化
有研究表明：pH值在6～9范围内，小球藻快速生长繁殖并积累油脂，pH值超过9.0，小球藻生长和油脂积累都受到抑制，pH值超过10.0，抑制作用更加显著，pH值7～8，小球藻生长繁殖最快，生物质产率最高，油脂含量和油脂产量均最高。所以，培养小球藻适宜的pH值范围是6～9，最适pH值范围是7～8[18]；在异养条件下，最适环境条件为温度30～32 ℃、pH值5.5～6.5[14]。该试验采用的pH值是培养基自然的pH值，酵母浸粉型号为FM802和FM902的培养基的起始pH值都为5.45，而型号为FM760的培养基的为5.42。
由图4可以看出，补糖前，3种型号的酵母浸粉培养液pH值变化曲线形状基本相同；整个培养过程中，FM902比FM802培养液的pH值大不到0.1；虽然FM760培养液的起始pH值比其他2个型号稍小，但在培养24 h以后其pH值要比其他2个型号的大0.3～0.4。pH值减小原因可能是葡萄糖快速消耗，产生酸性物质，在用液相色谱仪分析发酵液中葡萄糖含量时分析报告上显示有少量乳酸存在。当葡萄糖消
耗完时，pH值略微增大，液相色谱仪分析结果中未发现乳酸成分。
补糖后，型号为FM802和FM902的酵母浸粉培养液的pH值在不断减小，没有出现增大情况，而FM760培养液的pH值在补糖后的72 h内不断增大，仅仅比起始pH值小0.03，72 h后pH值快速减小。3种型号的酵母浸粉培养液240 h时的pH值与48h的只相差0.01。
3 结论
该文对3种不同型号的酵母浸粉及补糖对微藻异养生长的影响的试验数据进行了分析，得出以下结论，现将其总结如下。
（1）补糖后，型号为FM760的酵母浸粉培养液的耗糖速率比其他2个型号的要小。
（2）补糖前，微藻在型号为FM902的酵母浸粉中生长略显优势，补糖后，微藻在FM802中生长较好，在FM760中培养结果稍差。
（3）培养基中只补充碳源有利于微藻细胞干物质重的增加。
（4）在培养基的pH值为4.2～5.5时，微藻仍可以快速生长。补糖前，3种型号的酵母浸粉培养液pH值变化都有先减小后增大的过程，补糖后，型号为FM802和FM902的酵母浸粉培养液的pH值缓慢减小，而FM760的pH值继续增大后减小。
综合上述，补糖情况下，型号为FM802的酵母浸粉比FM902培养微藻的效果稍好，用FM760培养效果稍差；补糖有利于微藻干物质重的增加；在pH值为4～5的培养基中，微藻仍能快速生长。
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