艾灸任脉经穴对脑缺血再灌注大鼠组织超微结构及巢蛋白表达的影响

(广州中医药大学附属深圳市中医院,广东 深圳 518033)

摘 要:目的:观察艾灸任脉经穴对脑缺血再灌注大鼠纹状体组织超微结构及侧脑室下区巢蛋白(Nestin)表达的影响。方法:采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型。72只SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、脑缺血再灌注模型组(MCAO)、模型+艾灸任脉治疗组(R)。用电镜观察脑缺血后组织超微结构及艾灸任脉对其的影响,并用免疫组化法观察艾灸任脉经穴对缺血侧侧脑室下区Nestin阳性表达的影响。结果:脑缺血损伤后各组大鼠纹状体的神经元、胶质细胞及血管等均可见不同程度的缺血损害,艾灸任脉经穴对于改善组织缺血损害具有一定的积极作用。模型组与假手术组相比,缺血侧侧脑室下区的Nestin的阳性表达均有不同程度的增加,其中再灌注7、14天差异有统计学意义(P

关键词:艾灸任脉;脑缺血再灌注;组织超微结构;巢蛋白

中图分类号:R246 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0715-03

[FQ(4。52,X-W]

收稿日期:2009-11-10

基金项目:国家中医药管理局中医药科学技术研究专项课题(06-07JB04);深圳市科技计划资助项目(200601022 )

作者简介:于海波(1965-),男,河南许昌人,主任医师、教授,硕士研究生导师,博士,研究方向:针灸治疗神经系统疾病。

Effects of Ren Vessel Moxibustion on Ultramicrostructure and

Nestin Expression of Brain After Focal Cerebra1 Ischemia-Reperfusion in Rats

YU Haibo, MA Xiaoming, RAO Xiaodan, ZHENG Xiaobin, WU Jiaping, LIU Yongfeng

(Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine Attached to Guangzhou

University of Traditional Chinese Medicine,Shenzhen 518033,Guandong,China)

Abstract:Objective: To observe the effects of Ren vessel moxibustion on ultramicrostructure in corpora striata and nestin expression in subventricular zone (SVZ) after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats. Methods:Cerebral ischemia-reperfusion injury model was induced by the method of nylon monofilament embolism. Seventy-two rats were divided randomly into sham operation group(Sham), ischemia-reperfusion model group(MCAO) and ischemia-reperfusion injury with treatment of Ren vessel Moxibustion group(R).We observed the ultramicrostructure of brain by electron microscope after focal cerebral ischemia-reperfusion and approached the effect of Ren vessel moxibustion on it. What's more, nestin positive expression in SVZ of the ischemic side was observed by immunohistochemistry. Results: After focal cerebral ischemia-reperfusion, the neuron, gliacyte and blood vessel in corpora striata all shew ischemic damage, and Ren vessel moxibustion had a positive effect to relieve ischemic damage. Compared with Sham group, more positive cells of Nestincould be observed in MCAO group. And there are statistic difference at 7 days and 14 days after cerebral ischemia-reperfusion(P< 0.05). More positive cells could be seen in R group than those in MCAO group at 7 days, 14 days and 28 days after cerebral ischemia-reperfusion(P

Key words:ren vessel moxibustion; cerebral ischemiareperfusion; ultramicrostructure; nestin

缺血性脑血管病是严重危害人类健康的常见病和多发病,具有极高的致残率、致死率,虽然超早期溶栓和急性期神经元保护取得了重要进展,但对于大多数脑缺血患者而言,神经元死亡不可避免,如何积极有效地促进脑缺血损伤后神经的恢复仍然是医学密切关注的问题和研究的重点。随着干细胞技术的发现与应用,为神经损伤修复提供了广阔的前景,也为缺血性脑损伤的治疗带来了新的希望[1]。

近年来研究发现,脑缺血损伤可诱导内源性神经干细胞的增殖[2],巢蛋白(Nestin)是神经干细胞特异表达的中间丝蛋白中的第Ⅵ类中间丝蛋白,于1985年由Hockfield和Mckay首先发现[3]。作为神经干细胞的标记物,其表达与神经干细胞密切相关,探讨它在损伤的大脑组织中的表达规律,能够客观地反映神经干细胞的变化。

由于脑缺血本身诱导的神经干细胞较少,故探讨上调内源性神经干细胞的方法成为目前研究的热点。祖国医学认为,任脉不但是治疗中风的常用经穴,同时亦具有调节胚胎发育的作用。以此思路为指导,笔者推论艾灸任脉经穴能够促进脑内的神经干细胞增殖,从而促进脑缺血损伤修复。本实验旨在观察艾灸任脉经穴对脑缺血损伤修复作用,并进一步从干细胞角度探讨其作用机制,为临床治疗脑缺血提高疗效及认识任脉的实质提供新的理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物及分组 SPF级成年健康雄性SD大鼠72只,由广州中医药大学实验动物中心提供,粤监证字2007A024。实验前体重(250±10)g,饲养环境:室温 22℃,相对湿度 55%,12h昼夜节律,实验大鼠均自由进食及饮水,适应环境 1周后开始实验。术前禁食12h,随机分为假手术组(sham operation group, Sham)24只、模型组(MCAO group, MCAO)24只、艾灸任脉组(moxibustion Ren vessel treated group, R)24只。每组再分别随机分为7天组、14天组和28天组3个亚组。

1.2局灶性脑缺血大鼠模型的建立 大鼠以3.5%水合氯醛腹腔麻醉(lmL/l00g体重),应用日本制尼龙线(直径0.235 mm)阻断右侧大脑中动脉血流,缺血2h后再灌注。参考Longa神经病学评分[5]评定神经功能缺损,评分为1～4分则造模成功,用于实验。假手术组仅分离右侧颈总动脉并离断右颈外动脉,不予栓塞。

1.3治疗参数 艾灸任脉组(R):大鼠手术后24h予艾灸任脉经穴,取穴依据《实验针刺学》(上海科学技术出版社,1999 年9 月第1版)选取气海、关元两穴处剪毛,艾灸时将大鼠固定,局部碘酊消毒,用自制艾柱(长度约10cm,直径约0.8cm)

在穴位上方2～3cm处悬灸大约10min,采用温和灸补法,以大鼠出现疼痛及抽搐为度,每日1次至动物处死。假手术组(Sham)和模型组(MCAO)于术后第2天将其如艾灸任脉组大鼠般固定于操作台上20min,并不作任何治疗。

1.4电镜观察组织超微结构 各组大鼠分别于再灌注后7天、14天及28天心脏灌注处死取脑,以手术刀片将纹状体部分切出大小1mm×1mm×1mm块状,置入2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定2h以上;0.1M PBS冲洗3次,每次10min;1%锇酸固定90min;0.1M PBS冲洗3次,每次10min;梯度酒精脱水:50%70%80%90%95%,漂洗1次,每次10min,再入100%乙醇2次,每次10min;无水丙酮:10min×2次;渗透、Epon、包埋剂∶丙酮=1∶1,1h(摇);纯包埋剂6h或过夜;聚合24h,60℃;用超薄切片机将组织块切成60～80nm厚的超薄切片;置菲利普 CMIO电镜下观察网孔中细胞形态及其超微结构的改变并摄片(中山医科大学电镜室)。

1.5 Nestin免疫测定各组大鼠分别于相应时间心脏灌注处死,于脑立体定位仪上行脑冠状切并取脑,将含侧脑室的组织置于4℃4%多聚甲醛中后固定6h,然后将组织块脱水、透明、浸蜡。组织蜡块以1μm冠面切片,用浸泡过多聚赖氨酸的玻片裱片,并行烤片、脱蜡、水化、自来水冲洗;加入3%H2O2室温下孵育20min以灭活内源性过氧化物酶,然后放入0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中行微波抗原修复,滴加5%牛血清白蛋白封闭液,室温下放置20min,甩去多余液体,不洗,滴加巢蛋白免疫组化单克隆抗体(MAB-0566 ,迈新公司),4℃下过夜,次日PBS冲冼3次×5min,除去PBS液,每张切片滴加50μL即用型MaxvisionTM试剂,室温下孵育10～15min;PBS冲冼3次×5min,除去PBS液,每张切片加100μL新鲜配置的DAB溶液,显微镜下观察3～5min。自来水冲洗,苏木素复染,PBS冲洗返蓝;切片经梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

1.6图像分析与统计学处理 采用德国Leica DC software数码图像分析系统进行图像分析。光镜下(20×10倍),每张切片于缺血侧侧脑室下区选取5个相邻视野,以Nestin阳性染色细胞数平均数作为指标,进行阳性细胞计数。

数据分析采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析多样本均数间多重比较,对资料方差齐性进行Levene检验,按α=0.10水准,若方差齐,则应用Least Significant difference t检验(LSD-t检验)来判断差异的统计学意义,P

2 结 果

2.1组织超微结构观察 Sham组:纹状体神经元细胞核核膜完整、清晰,核仁明显,染色质均匀分布。胞浆中线粒体结构正常、有板层样嵴和管状嵴,嵴结构完整。粗面内质网丰富、结构完整。神经胶质细胞结构正常。微血管管腔大小正常,内皮细胞光滑,基质膜完整。MCAO组及R组:缺血侧纹状体神经元可呈不规则形,甚者细胞核固缩,核膜迂曲并可见连续性中断,核仁边移,染色质团块状凝集于核膜下,胞质可见灶状破坏溶解。部分神经元出现凋亡小体。神经胶质细胞也有类似改变。微血管内膜变平,严重者内皮细胞挛缩呈锯齿状改变,管腔明显狭窄或闭塞,管周围结构可见破坏溶解。缺血后相同再灌注时间组间观察比较发现,R组较同时相MCAO组有较多正常细胞保留,且细胞形态较接近正常见图1～3。

2.2 Nestin免疫测定结果 Nestin免疫阳性细胞表现为胞浆阳性,阳性的胞浆呈棕黄色染色。Sham组随着再灌注时间的延长,阳性细胞计数组间差别无统计学差异(P=0893,P>0.05)。MCAO及R组随着再灌注时间的延长阳性表达呈减弱的趋势。再灌注7天时阳性表达最高,14天时表达减弱,28天时阳性细胞计数最少。再灌注7天,MCAO组阳性细胞数明显多于同时相Sham组(P=0000, P

组(P=0.000, P

图1缺血再灌注7天各组神经元超微结构

图2缺血再灌注7天各组胶质细胞超微结构

图3缺血再灌注7天各组血管超微结构

表1各组大鼠缺血侧侧脑室下区

注:与sham 组比较,#P

3讨 论

任脉“总任一身之阴经”,是制约和调节全身阴气的主要经脉,为“阴脉之海”。阴是源头之处,故《太平圣惠方》曰:“夫任者,妊也,此是人之生养之本”。《圣济总录》曰:“任,阴也,阴为万物之母”。由此说明了人体其它经脉(包括阳经)均与其发生着重要的生养关系。艾灸疗法具有疗效好、依从性高的特点,《针灸大成》有曰:“邪客经络药不能及,灸气海、关元。”由此笔者设想艾灸任脉能够促进脑内的神经干细胞增殖,从而促进脑缺血损伤修复。

神经干细胞是一类具有自我更新能力、高度增殖潜能以及多种分化潜能的细胞[4]。近年研究证实,脑缺血或其它脑损伤时可诱导神经干细胞增殖、定向迁移及分化,对受损的脑组织结构进行修复和重塑[5]。Nestin属于类中间丝,在干细胞增殖旺盛阶段出现并大量表达,提示其在干细胞自我更新、并保持多潜能增加细胞抗损伤的能力具有其他中间纤维无法取代的作用,Nestin阳性细胞具有干细胞特征,由成年大鼠中枢神经系统中分离出的Nestin阳性细胞在体外培养中呈集落性生长。并分化出神经元与胶质细胞的前体细胞,因此巢蛋白目前已成为识别神经干细胞的重要标志蛋白[6]。作为未分化状态多能神经干细胞的抗原标志,Nestin被中枢神经系统和周围神经系统大多数增殖活跃的前体细胞所表达,发育成熟的神经系统Nestin表达降低,而损伤的神经组织Nestin表达又重新升高[7]。国内外研究表明在脑缺血大鼠室管膜下区、海马、大脑皮层均有Nestin的高表达, 提出Nestin的高表达可能预示神经干细胞的激活[8]。

因此,本实验通过电镜观察艾灸任脉经穴对脑组织超微结构的影响;通过免疫组化法观察艾灸任脉经穴对脑缺血大鼠缺血侧侧脑室下区Nestin阳性表达的影响。结果提示:艾灸任脉经穴对局灶性脑缺血再灌注大鼠的大脑纹状体的组织超微结构有明显影响,其中包括对神经元、神经胶质细胞及血管均有较好的保护作用。脑缺血损伤后,缺血侧侧脑室下区的Nestin表达均有不同程度的增高。随着再灌注时间的延长,阳性表达呈现减弱的趋势,而艾灸任脉经穴能够延迟这一趋势的发展。不同的灌注时间比较,艾灸任脉经穴组较模型组相均能明显增加缺血侧侧脑室下区巢蛋白的表达。

综上所述,艾灸任脉经穴能够促进脑缺血大鼠缺血侧侧脑室下区的神经干细胞的增殖,这可能是艾灸任脉经穴促进脑缺血损伤后神经修复的保护机制之一。艾灸任脉经穴是治疗脑缺血的一个极有前途的方法。

参考文献

[1] Weissman I L. Stem cell: units of development, units of regene ration, and units in evolution[J] .Cell,2000,100(1):157-168.

[2] Korzhevskii DE.Lentsman MV Gilyarov AV,et al.Induction of nestin synthesis in rat brain cells by ischemic damage[J].Neurosci Behav Physiol,2008,38(2):139-140.

[3] Hockfield S,Mckay RDG.Identification of major cell classes in the developing mammalian mervous system[J].J Neurosci,1985,5(12):3310-3328.

[4] Czyz J,Wiese C,Rolletschek A,et al.PotentiaI of embryonic andstem cells in vitro[J].Biol Chem,2003,384(10-11):1391-1409.

[5] Mackowiak M,Chocyk A,Markowicz-Kula K,et al.Neurogenesis in the adult[J].Pol J Pharmacol,2004,56(6):673-687.

[6] Yagita Y,Kitagava K,Sasaki T,et al.Differential expression of Musashil and nestin in therat hippocampus after ischemia[J].J Neurosci Res,2002,69(6):750-756.

[7] Pekny M,Johansson CB,Eliasson C,et al.Abnormal reaction to central nervous system injury in mice lacking glial fibrillay acidic protein and vimentin[J].Cell Biol,1999,145(3):503-514.

[8] Chiasson BJ,Tropepe V,Morshead CM ,et al.Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrste proliferative potentia1.but only subependymal cells have neura1 stem cell characteristics[J].J Neuroscience,1999,19(11):4462-4471.