蛋白质含量测定方法概述

摘要：食品中蛋白质含量是衡量其营养价值高低的一项重要指标，因此有关蛋白质的分析检测对于人和动物健康来说尤为重要。目前所采用的蛋白质含量检测方法主要有凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝法等，本文就实验室常用的几种蛋白质检测方法及其特点分别作简单介绍。

关键词：蛋白质含量测定；方法；特点

蛋白质含量的测定是目前生物化学中常用的一项指标测定。目前国内外所采用的检测方法主要有凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲分光光度法、考马斯亮蓝法（Bradford法）、Lowry法、二辛可酸比色法（BCA法）、荧光光度法、电流法、毛细管电泳分析法、罗丹明生物探针法以及高效光谱遥感技术分析法等。

每种测定法都有其优势，但也不可避免存在一定缺点。实验中，应综合考虑各方面因素再选择最佳使方法。实验对测定所要求的灵敏度和精确度、蛋白质的性质、溶液中存在的干扰物质、测定所要花费的时间等因素都会影响最终实验方法的选择。

本文主要就几种常见的蛋白质测定方法的原理及特点作一简单概述、比较。

1 凯氏定氮法

1.1基本原理

凯氏定氮法包括微量定氮法和全量定氮法两种方法，其测定蛋白质含量的过程主要包括消化、蒸馏、吸收、滴定等步骤。

含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵，此过程称为“消化”。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，溶液中氢离子浓度降低。用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，即可根据所用标准酸的当量数计算出待测物中的总氮量。蛋白质中的氮含量一般为16%，据此推断蛋白质含量。

1.2 方法特点

该方法仪器装置简单，试剂用量少且廉价易得。精密度、准确度高，最低可检出0.05mg氮，且样品用量少。但操作较繁琐费时，不利于大批样品的测定，且测定的结果只能是粗蛋白质的含量，处理未知样品时，其误差还有变大的危险。

1.3适用场合

适用于一切形态的食品与生物样品。对于不溶和浑浊的样品，其他许多方法不能进行测定，凯氏定氮法是唯一可行的分析方法。

2双缩脲法

2.1基本原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，都有双缩脲反应。蛋白质发生双缩脲反应时，紫色络合物颜色的深浅与其浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用以测定蛋白质含量。

2.2方法特点

该方法操作简便，试剂单一，可快速测定蛋白质含量，测定受蛋白质种类和环境温度的影响小。但灵敏度差，测定范围仅为1～20mg蛋白质。

2.3适用场合

适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。

3紫外吸收法

3.1基本原理

蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的能力。在280nm具有吸光度是蛋白质的一种普遍性质。一定范围内，蛋白质溶液在280nm的吸光度与其浓度成正比。

3.2方法特点

该方法不消耗样品，测定后样品仍能回收，低浓度盐类不干扰测定，且简便、灵敏、快速。但也存在缺点：①在测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。②若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会对结果产生较大干扰。③蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有化，因此样品与标准蛋白溶液的pH值若不同，会影响样品中蛋白含量的测定。

3.3 适用场合

适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。

4 考马斯亮蓝法

4.1 基本原理

考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，在蛋白质含量为1～1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比。

4.2方法特点

该法易于操作，干扰物质少，所用试剂较少，显色剂易于配制。同时考马斯亮蓝与蛋白质结合反应十分迅速而稳定，2min左右即达到平衡，其结合物室温下1h内保持稳定，且在5～20min之间，颜色的稳定性最好。

但由于各种蛋白质中的碱性氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，考马斯亮蓝法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

4.3适用场合

该方法适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质的测定。

5总结

蛋白质测定方法有十几种，在常用测定方法中，考马斯亮蓝法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍。凯氏定氮法测定结果较为准确，灵敏度高，故往往以该法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。但凯氏定氮法操作过程比较复杂繁琐，测定也较费时，且会产生大量有毒有害气体，危害操作者的身体健康，污染环境。紫外吸收法和考马斯亮蓝法都是较为快速的测定方法。另外，不同方法下不同物质对蛋白测定的干扰也不同。故对于不同样品，应选择合适方法测定，如对测定结果要求较高，则往往需要结合多种方法测定，并分析测定结果，最终得出最准确蛋白含量值。

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