皮肤鳞状细胞癌Fas和FADD表达的差异性分析

[摘要]目的：观察死亡受体(Fas)、Fas相关死亡结构域(Fas-associated death domain,FADD)在皮肤鳞状细胞癌(SCC)组织中的表达情况，分析其表达差异及意义。方法：应用免疫组织化学SABC法对27例SCC组织的石蜡切片及10例正常皮肤组织的切片分别进行Fas、FADD染色，在光学显微镜下观察并计数其阳性细胞，根据阳性细胞平均表达积分来判定。结果采用t检验和等级相关分析。结果： ①Fas、FADD在10例正常皮肤组织中表达均为阳性,平均表达积分3.10±0.87、3.20±0.63；②Fas在27例SCC组织中的平均表达积分2.19±1.14,低于正常对照组, 差异有统计学意义(P

[关键词]鳞状细胞癌；Fas；FADD；免疫组织化学

[中图分类号]R739.5[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）05-0781-04

Difference analysis on expression of Fas and FADD in tissues of Squamouscellcarcinoma

DU Yong-gui1,WANG Ji-hua2,ZHAO Ya-nan2,MAO Bo1,ZOU Tong-rong1,LV Ying1

(1.Department of Plastic Surgery and Burn,The First Pelople's Hospital of Yibin,Yibin 644000,Sichuan,China;2.Department of Plastic Surgery,The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650101,Yunnan,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the expressions of Fas and FADD in Squamous cell carcinoma(SCC),analyze difference and significance of expressions.MethodsFas and FADD were assayed by immunohistochemistry techniques(SABC) in specimens from 27 SCC and 10 normal skin,observed and accounted positive cells by optics microscope. According to the integrate of positive cells,the results were analyzed by T test and correlation analyse.Results①Fas、FADD were both positive expression in normal skin tissue.②The expressions of Fas in SCC were lower than in normal skin tissue,which showed difference (P

Key words:squamous cell carcinoma; Fas;FADD; immunohistochemistry

皮肤鳞状细胞癌是整形外科常见的恶性肿瘤,具有恶性程度高、生长迅速、易发生远处及淋巴结转移等特点，以50～60岁为好发高峰[1]。其发病原因并不清楚。目前研究发现,细胞凋亡调控失调与皮肤癌的发生发展关系密切[2-3]。凋亡是多细胞机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，多细胞组织通过凋亡来清除过剩的、损伤的或受感染的细胞[4]。本文利用免疫组织化学方法研究了Fas、FADD在正常皮肤、SCC的表达，分析它们在SCC发生发展中的意义, 以求为揭示SCC肿瘤细胞的凋亡调控机制提供新的线索，为临床治疗提供新的理论依据。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器: 即用型SABC免疫组化染色试剂盒(产品编号SA1022--兔IgG)；兔抗人Fas多克隆抗体(产品编号BA0048)3ml, 即用型；兔抗人FADD多克隆抗体(产品编号BA0037) 1ml,浓缩型; 抗体稀释液(产品编号AR1016),10ml,以上均购自武汉博士德生物工程有限公司；DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。光学显微镜购CH-BJ45-t-2型（Olympus，日本）；石蜡切片机Leica RM2135（Leica公司）等。

1.2标本的选择：27例标本来源于昆明医学院第二附属医院2005年1月～2008年3月整形科和病理科已确诊的存档蜡块。病例入选标准:①组织病理检查明确诊断者；②临床、病理资料保存完整者。SCC27例，患者男17例，女10例,男∶女=1.7:1；年龄28～87岁，平均年龄59.2±18.9岁,病程2月～10年，平均病程21.6月,部位主要分布在颜面、头皮、四肢、腹壁。10例正常对照组，为无器质性疾患、因外伤等原因手术的患者正常皮肤，男6例，女4例，男女比例1.5:1。年龄34～80岁，平均年龄54.3±11.3岁，经统计学分析，与SCC患者年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有皮肤标本经3.33mo1/L (10%)福尔马林固定24h，常规石蜡包埋连续切片4μm厚。

根据《中华外科病理学》[5]的组织病理分型标准，皮肤SCC可分为普通型和特殊型。普通型又可按照Broders 提出的未分化癌细胞所占的百分比将皮肤鳞状细胞癌分为I～Ⅳ级，I级为高分化鳞癌，II级为中分化鳞癌，III级～Ⅳ级为低分化鳞癌。根据此临床分级标准，本课题收集的SCC标本均为普通型,其中I级16例,为高分化鳞癌; II级7例,为中分化鳞癌；Ⅲ级4例, 为低分化鳞癌,未见Ⅳ级和特殊型病例。

1.3 实验方法：采用免疫组织化学法(SABC法),按照即用型SABC免疫组化染色试剂盒使用说明书进行。对照设置：用已知的阳性切片对照，用PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：Fas、FADD的阳性表达主要位于细胞质，在细胞浆中出现棕黄色细颗粒为Fas、FADD阳性表达。采用半定量方法，根据阳性细胞百分比及染色强度进行综合评分。以细胞质或细胞核中出现淡黄至棕黄色细颗粒状着色为阳性，按染色强度分级:无着色为0，淡黄色为1，深黄色为2,棕黄色为3; 每例随机观察5个高信视野(×400)，每个视野在高倍镜下计数每100个细胞中阳性细胞数比例，最后计算5个区域中阳性细胞比例的平均值作为该标本阳性细胞的比例。着色百分数记分等级为:50%为3。上述两项相加为Fas、FADD的表达强度积分:1为阴性(-)，2为弱阳性(+),3,4为阳性(++)，>4为强阳性(+++)[6-8]。

1.4 统计方法：统计学处理采用SPSS11.5软件分别进行t检验和两变量关联性分析。检验标准α=0.05,P

2结果

2.1 正常皮肤、SCC组织中Fas、FADD 表达水平的比较：在正常皮肤、SCC中Fas蛋白的平均表达积分为3.10±0.87、2.19±1.14(表1,图1～2)。SCC中的Fas蛋白的表达与正常皮肤相比较, 较正常皮肤偏低,差异有统计学意义(P

2.2 Fas、FADD蛋白表达水平与SCC病理分期的关系：鳞状细胞癌I级、Ⅱ级、Ⅲ+Ⅳ级三组中,Fas蛋白的平均表达积分分别为2.75±0.93、1.86±0.69、0.50±0.57,三组间相互比较,差异有统计学意义(P

3讨论

Fas是除肿瘤坏死因子(TNF)外主要介导细胞凋亡的蛋白分子[9]，被称为死亡受体, 分子量为45kD，是存在于多种细胞膜上的一种I型跨膜蛋白。其胞外区含157个氨基酸残基，存在2个N-糖基化位点(102和120)，由此连接多糖成分；跨膜区含17个氨基酸;胞浆区含145个氨基酸，其中一段60～70个氨基酸序列与TNF-R1胞浆区高度同源，介导细胞凋亡，称为“死亡结构域”(death domain,DD)。FADD是一种死亡域蛋白，与Fas胞浆区呈特异性结合，故又名Fas相关死亡域蛋白。Fas是I型跨膜糖蛋白，Fas及其配基FasL合称Fas系统。Fas与其配体结合后或与激动抗体交联后，形成三聚体，招集胞浆内FADD,FADD死亡域相互作用，显露出FADD的死亡效应域(death effect domain,DED), FADD再和胱门氨酸酶-8(caspase-8)酶原发生相互作用，激活caspase-8，形成Fas信号复合体，激活胱门氨酸蛋白酶联级，导致细胞死亡，可见FADD在Fas凋亡信号转导过程中起着承上启下的作用。已有的研究结果显示:在乳腺、卵巢、结肠、前列腺、肝脏等器官的实体瘤中检测到Fas受体的表达；有报道称，在免疫豁免区如角膜上皮细胞及视网膜中亦有Fas的存在[10]。Schimonishi等[11]和Shibalita等[12]发现，肝内胆管癌，食管癌等瘤细胞可通过Fas低表达来抵抗TIL的杀伤，且Fas表达与组织学分级，血管浸润，淋巴转移显著相关,该研究结果显示:Fas异常表达与肿瘤的发生、发展以及转移密切相关。杨开颜等[13]发现鳞癌及基癌的细胞凋亡与Fas的表达有关,Fas表达高者其凋亡率亦高,提示鳞癌和基癌主要的凋亡途径可能是Fas途径。Lee等[14]和Shaker等[15]发现在基底细胞癌Fas表达降低或不表达；Boldrini等[16]通过调查30例非黑素细胞瘤(19例BCC和11例SCC)中Fas和FasL的表达,利用RT- PCR的方法发现在15.8%的BCC中和36.4%的SCC中有Fas mRNA水平的改变。故提示SCC肿瘤细胞可通过减少自身Fas表达并增强FasL表达进行免疫逃逸。

FADD是一种死亡域蛋白，与Fas胞浆区呈特异性结合，故又名Fas相关死亡域蛋白。该蛋白由C端的DD和N端的DED两部分组成，后者是诱导凋亡作用发生的活性部位。FADD, Fas, TNFR-1死亡域之间拥有25～30%的一致性。 FADD作为凋亡信号的连接蛋自，在恶性肿瘤的发生、发展过程中起着主要的作用。许欣等[17]研究发现FADD基因低表达在食管癌的发生、发展中可能起着重要作用。目前Shin等[18]研究FADD在原发性肝癌的表达发现，FADD在癌组织中的表达率显著低于癌旁肝组织。关于FADD表达异常在非小细胞肺癌中也能起到重要的作用[19]。

本实验通过免疫组织化学方法观察到:Fas在鳞状细胞癌中阳性平均表达积分,明显低于正常皮肤的,具有统计学意义(P

[参考文献]

[1]华积德.肿瘤外科学[M].北京:人民军医出版社,1995:970.

[2]Kerr JFR,Searle J.A suggested explanation for the paradoxically slow growth rate of basal cell carcinoma that contain numerous mitotic figures[J].J Pathol,1972,107(1):41-44.

[3]Kerr JFR,Searle J.Thedigestion of cellular fragmentswithin phagolysosomes in carcinoma cells[J].J Pathol,1972,108(1):55-58.

[4]Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].Br J Cancer,1972,26(4):239-257.

[5]武忠弼,杨光华.中华外科病理学[M].北京:人民卫生出版社,2006:2212.

[6]邱雪杉,杨秀,李庆昌,等.上皮性钙粘附蛋白和p-连环素的表达与非小细胞肺癌预后的关系[J].中华病理学杂志,2002,31(4):318-321.

[7]陈嵘炜,樊翌明,吴志华,等. 皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌中FAD D,Caspase-8的表达与细胞凋亡的关系[J].广东医学院学报,2006,24(5):448-450.

[8]杜鹃,徐前喜,张建中.寻常型进行期白癫风患者白斑区角质形成细胞凋亡的检测[J].中华皮肤科杂志,2007,40(1):45-47.

[9]张天泽,徐光炜.肿瘤学[M]. 天津:天津科学技术出版社,2005:2219- 2223.

[10] Lim SC. Expression of Fas ligand and sFas ligand in human gastric adenocarcinomas[J]. Oncol Rep, 2002, 9 (1) ;103-107.

[11]Shimonishi T,Isse K,Shibata F,et al.Up-regulation of fas ligand at early stages and down-regulation of Fas at progressed stages of introhepatic cholangiocarcinoma reflect evasion from immune surveillance[J].Hepatology,2000,32(4ptl):761-769.

[12]Shibalita M,Tachibana M,Dhar DK,et al.Prognostic significance of Fas and Fas ligand expressions in human esophageal cancer[J].Clin Cancer Res,1999,5(9):2464-2469.

[13]杨开颜，俞康，李剑敏，等.鳞癌与基底细胞癌的Fas/FasL表达及其与细胞调亡的关系[J].变・畸变・突变,2003,15(4):215-216.

[14]Lee SH,Jang JJ,Lee JY,et al. Fas ligand is expressed in normal skin and in some cutaneous m alignancies[J].Br J Dermato1,1998,139(2):186-191.

[15]Shaker O,Youssef R.Role of apoptosis stimulus factor and its ligand in the induction of apoptosis in some ultraviolet induced diseases[J].Dermatol Online J,2006,12(3):4.

[16]Boldrini L,Loggini B,Gisfredi S,et al. Mutations of Fas(APO-1/CD95) and p53 genes in nonmelanoma skin cancer[J]. J Cutan Med Surg 2003 7(2):112-118.

[17]许欣,彭林涛,刘丽华,等. 食管上皮癌变过程中FAS, FASL, FAD D和casp ase-8的表达及其意义[J]. 基础医学与临床,2007,27(5):525-529.

[18]Shin EC,Shin TS,Park TH,et al. Expression of Faarclatol genes inIwman hepatoc:ellular carcinomas[J].Cancer LeTT,1998,134(2):155-162.

[19]Shin MS,Kim HS,Lei S,et al. Alteration of Fas-pathway genes associated with nodal metastasis in non-small cell lung cancer[J].Oncogene,2002,21(26):4125-4136.

[20]刘大庆,司徒镇强,许彦明,等. 人FADD基因诱导粘液表皮样癌细胞凋亡的研究[J].口腔领面外科杂志,2002,12(4):317-320.

[收稿日期]2010-10-20 [修回日期]2011-02-14

注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”