低强度脉冲超声刺激对人类牙周膜细胞BMP-2表达效应的研究

[摘要]目的：探讨一定强度的LIPUS对H-PDLCs进行辐照后，细胞内BMP-2的表达变化，对LIPUS诱导牙周成骨效应进行初步评估。方法：体外培养H-PDLCs，LIPUS（90mW/cm2，20min/天）连续处理1周，分别于处理1、3、5、7天后收集标本，同期培养的未接受任何处理的H-PDLCs为对照组。实时定量PCR检测各时间点细胞内BMP-2基因表达变化，2^（-CT）法分析基因相对表达变化量，对CT值组间差异进行方差分析。结果：实时定量PCR显示LIPUS处理后H-PDLCs内BMP-2表达逐渐增强，于第3天达高峰，第5天逐渐减弱，但表达仍高于同期未处理组，到第7天下降到接近同期未处理组水平。尤其是，LIPUS处理3天后较同期对照组BMP-2基因表达增加6.07倍；5天后较同期对照组BMP-2基因表达增加2.30倍，CT 值组间均具有统计学差异（P

[关键词]牙周组织缺损；牙周膜细胞；低强度脉冲超声；bmp-2；成骨效应

[中图分类号]R781.4[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）05-0767-03

Effects of Low Intensity Pulsed Ultrasound on the expression of BMP-2 in human periodontal ligament cells

YANG Zun1，REN Lei-xi1,SONG Jin-lin1,ZHOU Jie1,LI Fa-qi2,ZHAO Chun-liang2,WANG Zhi-biao2

（1.Department of Orthodontics, College of Stomatology, Chongqing Medical University；2 Chongqing Key Laboratory of Ultrasound Medical Engineering）

Abstract:Objective To investigate the expression of BMP-2 in human periodontal ligament cells（H-PDLCs） after a certain intensity of Low Intensity Pulsed Ultrasound(LIPUS), and to evaluate the osteogenic effect of LIPUS on the periodontium.MethodsH-PDLCs were cultured in vitro, and stimulated with LIPUS （90 mW/cm2, 20min/day） for one week. The samples were collected on the first day, third day, fifth day, and seventh day after the role of LIPUS. The H-PDLCs were culturedin the same conditions but without LIPUS management as control group. The expression of BMP-2 in H-PDLCs at each time point were detected by Real-time PCR,and the relative gene expression were analyzed by the method of 2^（-CT）. Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA).ResultsExpression of BMP-2 increased in LIPUS treatment group, reach the peak on day 3,then decreased on day 5, and then dropped to the original level on day 7.Analysis showed that the expression of BMP-2 gene expression increased to 6.07 times on the third day after the role of low Intensity Pulsed Ultrasound, and the expression of BMP-2 gene expression increased to 2.30 times on the fifth day. The differences of CT between two groups were statistically significant (P

Key words:periodontal defect；H-PDLCs；LIPUS；BMP-2；osteogenic effect

牙周病系发生在牙周支持组织的慢性非特异性炎症，轻者引起牙龈病变，重者累及深层组织造成牙槽骨吸收，最终导致牙齿脱落。传统的牙周基础治疗和药物治疗仅能缓解局部不利因素对牙周组织的进一步破坏；GTR、植骨术等手术治疗对牙周骨组织有一定程度的修复[1]，但存在修复缓慢，疗效有限等不足。牙周组织的成骨分化对于牙周组织修复极为关键[2]，如何促进术后局部牙周组织成骨分化就成为了一个关键的话题。

LIPUS作为一种非侵入性的机械能，能够刺激细胞分泌合成胶原、促进钙盐沉积[3]，在长骨骨折[4]以及牙周骨质缺损[5]的修复中具有促进显著成骨效应。SuzukiAkito[6]等应用LIPUS（30 mW/cm2，20min/天）处理ROS 17/2.8 细胞1周后，发现细胞内BMP-2、-4、-7表达增强。BMP-2是诱导细胞成骨分化的重要生长因子，能够提高牙周膜细胞碱性磷酸酶活性，促进钙化结节形成[7]。它的表达与牙周膜细胞成骨水平具有必然联系。牙周组织修复的前体细胞牙周膜细胞具有分泌胶原以及分化成骨的能力[8]，在一定生长因子或理化刺激的作用下，可分化成为成骨细胞，进行相关的成骨效应表达，形成新的牙槽骨和牙骨质。

基于LIPUS的的潜在生物学效应，本实验应用LIPUS处理H-PDLCs，连续动态观察LIPUS处理对H-PDLCs胞内BMP-2表达的影响，探讨LIPUS对牙周膜细胞成骨分化的诱导作用，为LIPUS促进牙周组织重建提供参考。

1材料和方法

1.1 主要材料与设备：改良型α-MEM培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；BMP-2引物（大连TaKaRa公司合成）； RNAiso Plus裂解液（大连TaKaRa公司）；SYBR Premix Ex Taq TMⅡ（大连TaKaRa公司）；dNTP Mixture（大连TaKaRa公司）；Random Primer 6mer（大连TaKaRa公司）；Ribonuclease Inhibitor（大连TaKaRa公司）；M-MLV Reverse Transcriptase（美国Promega公司）； DEPC（美国Bio Basic Inc公司）；六通道LIPUS换能器由重庆医科大学超声医学工程中心提供；荧光定量PCR仪Rotor-Gene 6000实时定量核酸扩增系统（澳大利亚Corbett Life Science公司）。

1.2 h-PDLCs体外培养：人类牙周膜标本来自重庆医科大学附属口腔医院颌面外科门诊，在征得患者及家长同意下收集12～20岁健康青少年因正畸需要拔除的双尖牙。无菌条件下，用含双抗（青霉素、链霉素）浓度为100单位/ml的PBS液反复冲洗洗牙齿去污和灭菌，直至牙齿和冲洗过的PBS液不再有血污。此时将洗净的牙齿移人另一无菌培养皿中，滴加少许含20%胎牛血清的DMEM培养液，保持根面湿润。用无菌刀片反复纵横切割根中l/3的牙周膜组织，仔细进行刮除，使组织块小于1mm×1mm×1mm。将刮下的组织碎屑用含双抗的PBS液漂洗2次，吸除多余水分。用无菌口腔探针小心将组织块以均匀间距接种于六孔板底壁上，滴加少量含20%胎牛血清α-MEM培养基，置CO2培养箱(5% CO2、95%空气、l00%湿度，37℃恒温)孵育，隔夜后再加将培养基补至约1.5ml。待原代细胞长满单层后进行传代， 0.125%胰蛋白酶进行消化，约3～5min后细胞间隙增大，胞体回缩变圆。此时加入含10%胎牛血清的α-MEM终止消化，轻轻拍打瓶壁使细胞从瓶壁上脱落下来，并用吸管吹打均匀形成细胞悬液，转移细胞悬液入离心管，1 000rpm×5min离心后弃去上清液，加入适量培养基充分吹打，按1:2比例传代接种于细胞培养瓶中。

1.3 LIPUS处理及RNA提取：取第4代H-PDLCs接种于六孔细胞培养板，对应六通道LIPUS发射仪，采用通过超声耦合剂作为媒介的辐照方式。设定LIPUS参数频率：1.0～1.5 MHz；脉冲重复频率：1.0kHz；脉冲占空比：1:5；幅宽：200μs；输出强度90mW/cm2；辐照时间：20min/天。连续处理1周，分别于处理第1、3、5、7天后提取细胞RNA。

使用RNAiso裂解液提取总RNA。弃去细胞培养基，用PBS漂洗2遍。每孔中加入1ml的RNAiso裂解液，轻轻摇晃使其与细胞其充分接触，然后静置5min。移液枪充分吹打使细胞脱落，转移至1.5mlEP管中。向裂解液中加入200μl氯仿，盖紧EP管盖，用力震荡，使溶液充分乳化，静置5min。12 000g，4℃离心15min。此时液体分为三层，无色透明上清层为RNA，白色中间层为蛋白质，粉红下层色为无机层。小心吸取上清层，移至新的1.5mlEP管中。（注意勿吸出白色中间层)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒EP管充分混匀，静置10min。12 000g，4℃离心10min。弃上清，管底见少量白色沉淀物质，即为RNA。无水乙醇和DEPC水现配成75%的乙醇1 000μl，洗涤RNA沉淀。12 000g， 4℃离心5min。小心弃去乙醇，保留沉淀，在空气中气干3～5min。加入DEPC水溶解RNA。

1.4 实时定量PCR检测：取2μg总RNA，加入0.5μg引物6聚体，加DEPC水补足体积15μl。混匀后上RT-PCR仪进行逆转录，设置程序为70℃，5min。第一步完成后取出EP管立即冰浴，稍离心。加入试剂M-MLV 5×buffer 5μl，dNTP 2.5μl，M-MLV RT 1μl，Ribonuclease Inhibitor0.625μl，DEPC水补足至总体积25μl。程序设置为37℃，60min4℃延伸。

c-DNA制备完成后，进行实时定量PCR检测。加入反应体系SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5μl，cDNA1.0μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH2O 10.5μl。程序设定：95℃预变性30s；95℃，10s；退火温度54℃，30s；72℃，30s； 45个循环。PCR引物合成序列见表1。实时定量PCR扩增曲线见图1，实时定量PCR溶解曲线见图2。

1.5 统计分析：采用SPSS 13.0统计软件对Ct值组间差别比较进行方差分析。采用2^（-CT）法对BMP-2扩增结果ct值进行相对定量分析。

2结果

2.1 LIPUS处理对H-PDLCs内BMP-2基因表达的影响：实时定量PCR结果显示，LIPUS处理后H-PDLCs第1天、3天、5天、7天BMP-2表达均有不同程度增高。以同期培养的未受LIPUS处理的H-PDLCs为对照，其中处理第1天，Ct值处理前后组间无差异（P>0.05）；处理第3天BMP-2表达增加6.07倍，Ct值处理前后组间差别具有统计学差异（P

2.2 人类牙周膜细胞受LIPUS刺激后BMP-2基因表达的时间变化趋势：LIPUS对H-PDLCs处理后的第1天BMP-2增加不明显，处理后第3天，BMP-2表达明显升高，相对空白组增加6.07倍，而后开始下降，在处理后第5天BMP-2相对表达下降至2.30倍，在第7天回到初始水平。BMP-2表达水平见图3。

3讨论

LIPUS指强度在100 mW/cm2 以下的脉冲式超声波，在两个脉冲之间有较长的间歇时间，相对产热较弱，不具侵入性[4]。以往大量研究证实LIPUS可有效促进新鲜骨折愈合、治疗骨不连等[9-10]，系安全无创的骨损伤辅助修复手段，于1994年和2000年经美国食品与药物管理局(FDA)批准将其用于促进新鲜骨折和骨不连的治疗[11]。基于LIPUS的促进骨组织改建的生物学效应，Ikai[12]利用LIPUS（30mW/cm2、1.5MHz、200μs）处理Beagle犬前磨牙急性牙周骨质缺损20min/D，4周后发现实验侧的新生牙骨质和牙槽骨明显增加，牙龈上皮热休克蛋白70表达增加，这表明LIPUS可促进牙周损伤的修复和骨质再生。2010年，研究组前期实验也发现LIPUS对Beagle犬牙槽骨缺损具有潜在的修复效应[13-14]。

牙周组织修复不仅仅骨质再生，更重要的如何促进牙周膜细胞成骨分化。一般而言，机械刺激调节牙周膜细胞内某些具有成骨特性的生长因子如BMPs以引起细胞成骨应答，从而产生各类成骨效应指标诸如ALP、OC、OPN等的表达。BMP-2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形成蛋白BMPs之一。早在1988年人们首次纯化分离出天然BMP-2[15]，此后还利用基因重组技术表达出人类基因重组rh BMP-2[16]。它能被反应细胞所感知，通过激活或抑制相关基因，调节骨系细胞的分化和增生。在骨形成早期，BMP-2可使具有成骨分化潜能的细胞向骨形成中心聚集，分化为骨系细胞；对于成骨细胞，BMP-2则可使之维持其特有细胞表型，并诱导成骨细胞标志物的增高，促进细胞外基质钙化，参与骨的再生[17]。

因此，本研究观察一定强度的LIPUS处理人牙周膜细胞一周后BMP-2基因表达变化，探讨LIPUS促牙周组织成骨分化效应。以同期培养的人牙周膜细胞作为对照，发现LIPUS可明显提高BMP-2表达，处理第1天未见统计学差异（P>0.05）；处理第3天BMP-2表达提高6.07倍，具有统计学差异（P

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[收稿日期]2011-03-11 [修回日期]2011-04-21

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