生物技术实践

考点一、微生物的分离与培养

例1植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：

（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中葡萄糖苷酶可将分解成。

（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的。

（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：

酵母膏无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水培养基甲++++-++培养基乙+++-+++注：“+”表示有，“-”表示无。

据表判断，培养基甲（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是

；

培养基乙（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是。

【解析】（1）纤维素是一种由葡萄糖分子首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中的某些微生物分解利用，纤维素可以被纤维素酶分解为纤维二糖，再被葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。（2）刚果红与纤维素可形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。（3）分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，且需以纤维素作为唯一碳源。

【答案】（1）纤维二糖葡萄糖（2）红透明圈（3）不能液体培养基不能用于分离单菌落不能培养基中没有纤维素，不会形成CR-纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌

【知识链接】1.培养基的配制：培养基的成分有碳源、氮源、水、无机盐和特殊营养物质；培养基按功能可分为选择培养基和鉴别培养基；配制培养基时要求目的明确、营养协调、pH适宜。

2.无菌技术包括消毒和灭菌，两者的区别为：

项目消毒灭菌概念使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌适用对象操作空间、液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等3.纯化大肠杆菌：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。微生物的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，两者的区别为：

（1）两种接种方法的作用不完全相同：平板划线法和稀释涂布平板法都能使细菌纯化，但平板划线法不易分离出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数。

（2）稀释涂布平板法的缺点：稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

（3）平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的不同：①第一次操作：杀死接种环上原有的微生物；②每次画线之前：杀死上次画线后接种环上残留的菌种，使下次画线的菌种直接来源于上次画线的末端；③画线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

4.筛选菌株：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。菌株筛选原理的比较：

土壤中分解尿素的细菌分解纤维素的微生物①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源

②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素①选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源

②鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素可形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈5.统计菌落数目的方法：①显微镜直接计数法：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量；②间接计数法（活菌计数法）：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

考点二、传统发酵技术的应用

例2泡菜是我国的传统食品之一，但制作过程中产生的亚硝酸盐对人体健康有潜在危害。某兴趣小组准备参加“科技创新大赛”，查阅资料得到下图。

（1）制作泡菜时，泡菜坛一般用水密封，目的是。乳酸菌发酵第一阶段的产物有。

（2）据下图，与第3天相比，第8天后的泡菜更适于食用，因为后者；pH值呈下降趋势，原因是。

（3）该小组得到一株“优选”乳酸菌（亚硝酸盐还原酶活力比普通乳酸菌高5倍），拟参照资料的实验方案和食盐浓度（4%～10%），探究与普通乳酸菌相比用“优选”乳酸菌制作泡菜过程中亚硝酸盐含量的高低，并确定其最适条件。请你设计一个实验结果记录表，并推测实验结论。

【解析】（1）制作泡菜的原理是乳酸菌在无氧条件下发酵产生乳酸，泡菜坛用水密封，目的是为乳酸菌发酵提供无氧环境。乳酸菌发酵第一阶段的产物有丙酮酸和[H]（少量能量）。（2）据图可知，第3天亚硝酸盐含量最高，第8天亚硝酸盐含量最低，而亚硝酸盐对人体健康有害，因此，第8天后的泡菜更适于食用。乳酸菌发酵产生乳酸，随着发酵的进行乳酸含量越来越多，pH值呈下降趋势。（3）该实验的目的是比较食盐浓度在4%～10%内普通乳酸菌与“优选”乳酸菌发酵效果的优劣，并确定其发酵的适宜条件，因此该实验的自变量是适宜的食盐浓度，因变量是亚硝酸盐含量，而“优选”乳酸菌亚硝酸盐还原酶活力比普通乳酸菌高5倍，因此，推测“优选”乳酸菌组在制作泡菜过程中亚硝酸盐含量低于普通乳酸菌组。

【答案】（1）防止氧气进入坛内，影响乳酸菌发酵（为乳酸菌发酵提供无氧环境）丙酮酸和[H]（少量能量）（2）亚硝酸盐含量较低乳酸菌发酵产生大量乳酸

（3）实验结果记录表：

时间（天）1234567亚硝酸盐含量（mg/kg）食

盐

浓

度4%普通乳酸菌组优选乳酸菌组6%普通乳酸菌组优选乳酸菌组8%普通乳酸菌组优选乳酸菌组10%普通乳酸菌组优选乳酸菌组实验结论预测：“优选”乳酸菌组在制作泡菜过程中亚硝酸盐含量低于普通乳酸菌组。

【知识链接】果酒、果醋、腐乳、泡菜的制作比较：

比较

项目果酒的制作果醋的制作腐乳的制作泡菜的制作所需

菌类酵母菌醋酸菌毛霉乳酸菌菌种代

谢类型异养兼性厌氧型异养需氧型异养需氧型异养厌氧型发酵

条件前期需氧，后期厌氧一直需氧一直需氧厌氧适宜

温度18℃～25℃30℃～35℃15℃～18℃室温原理酵母菌在无氧条件下将葡萄糖氧化成乙醇醋酸菌在有氧条件下将乙醇氧化为醋酸毛霉能产生蛋白酶和脂肪酶，将豆腐中的蛋白质和脂肪分解为小分子有机物乳酸菌将葡萄糖分解为乳酸制作

流程挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵果酒挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵醋酸发酵果醋豆腐长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制原料选择处理与泡菜盐水混合加调料装坛发酵为成品测定亚硝酸盐含量注意

事项葡萄不要洗得太干净，葡萄入瓶先进行有氧呼吸，再进行无氧呼吸要不断通入空气，创造有氧条件一般选含水量为70%的豆腐，卤汤中盐和酒（12%）的用量要严格控制，以防止杂菌污染严格控制无氧条件考点三、植物组织培养

例3育种工作者常采用花药培养的方法，使花粉粒发育为单倍体植株。下面是采用水稻的花药进行培养过程的流程：选取水稻花药对花蕾消毒接种和培养植物体。请回答下列问题：

（1）选取的水稻花药应为期，此时细胞核由细胞中央移向细胞一侧，花药培养成功率最高。

（2）通过花药培养产生单倍体植株一般有两种途径：一种是花粉通过阶段发育为植株；另一种是在诱导培养基上先形成，再将其诱导分化成植株。

（3）试管苗形成过程中，必须从培养基中获得和小分子有机物质等营养物质。要促进花粉细胞的分裂和生长，培养基中应有和两类植物激素。

（4）若接种过花药的培养基被污染，则可能的原因有哪些？

（至少写出两条）。

【解析】（1）一般选取单核期的花药进行培养。选择单核期以前的花药接种，因其质地幼嫩，极易破碎；而选择单核期以后的花药接种，又因其花瓣已有些松动，故会给材料消毒带来困难。（2）花药离体培养有两条途径：一是脱分化形成愈伤组织，二是脱分化形成胚状体。（3）试管苗形成过程中，必须从培养基中获得无机盐或矿质元素和小分子有机物质等营养物质。要促进花粉细胞的分裂和生长，培养基中应有生长素和细胞分裂素两类植物激素。（4）若接种过花药的培养基被污染，则可能的原因有培养基灭菌不彻底、花蕾消毒不彻底、接种时操作不规范等。

【答案】（1）单核（2）胚状体愈伤组织（3）无机盐或矿质元素生长素细胞分裂素（4）①培养基灭菌不彻底；②花蕾消毒不彻底；③接种时操作不规范等

【知识链接】1.植物组织培养的理论依据和基本过程：植物组织培养的基本原理是植物细胞的全能性，包括脱分化和再分化两个过程。满足的基本条件有：①植物组织或细胞处于离体状态；②外部环境条件适宜，如温度、pH、光照、无菌操作等；③完全的营养条件：离体的植物细胞失去了植物的自养能力，所以需要为其提供水、有机营养、矿质营养、维生素等营养物质和植物激素。

2.组织培养技术与月季花药离体培养技术的比较：

项目组织培养技术月季花药离体培养技术理论依据植物细胞的全能性基本过程脱分化再分化外植体的

细胞类型体细胞生殖细胞取材部位未开花植株的茎上部新生的侧枝花粉发育过程中的单核期花药消毒消毒剂为体积分数为70%的酒精和质量分数为0.1%的氯化汞溶液，清洗液是无菌水操作流程制备培养基外植体消毒接种培养移栽栽培选材消毒接种和培养筛选和诱导移栽栽培选育影响因素选材、营养、激素、pH、温度、光照等培养结果正常植株单倍体植株生殖方式无性生殖有性生殖可育性可育高度不育，秋水仙素处理后可育3.植物激素在组织培养中的重要作用：生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。其作用及特点为：在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。此外，两者的使用顺序不同，结果不同；用量比例不同，结果也不同。具体如下：

激素使用实验结果使用顺利先使用生长素后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞既分裂又分化生长素和细胞分裂素同时使用分化频率提高生长素和细

胞分裂素用

量的比例该比值较高时促进根的分化，抑制芽的形成该比值较低时促进芽的分化，抑制根的形成该比值适中时促进愈伤组织生长4.植物花药培养中“四分体”与动物减数分裂过程中“四分体”的区别：被子植物花粉发育过程中的“四分体”是指由一个小孢子母细胞经过减数分裂产生的连在一起的四个单倍体细胞，即“四分体”中的“四”指的是四个小孢子细胞；减数分裂中的“四分体”是指在联会状态下的一对同源染色体，因其含有四条染色单体，所以称为“四分体”，即“四分体”中的“四”指的是四条染色单体。

考点四、植物有效成分的提取

例4回答与胡萝卜素有关的问题：

（1）胡萝卜含有的胡萝卜素中，最主要的是（填“α-胡萝卜素”“β-胡萝卜素”或“γ-胡萝卜素”），该胡萝卜素在人体内可以转变成两分子，后者缺乏会引起人在弱光下视物不清的病症，该疾病称为。胡萝卜素是（填“挥发性”或“非挥发性”）物质。

（2）工业生产上，用养殖的岩藻作为原料提取胡萝卜素时，（填“需要”或“不需要”）将新鲜的岩藻干燥。

（3）现有乙醇和乙酸乙酯两种溶剂，应选用其中的作为胡萝卜素的萃取剂，不选用另外一种的理由是。

【解析】（1）胡萝卜素的化学分子式中包含多个碳碳双键，根据双键的数目可以将胡萝卜素划分为α、β、γ三类，β-胡萝卜素是其中最主要的组成成分；一分子的β-胡萝卜素在人或动物的小肠、肝脏等器官中被氧化成两分子的维生素A；由于饮食中缺乏维生素A或因某些消化系统疾病影响维生素A的吸收，致使视网膜杆状细胞没有合成视紫红质的原料而造成夜盲症（暂时性夜盲症可由补充维生素A得以痊愈）。（2）提取胡萝卜素时，由于新鲜的岩藻中具有大量的水分，故需要进行干燥。（3）乙酸乙酯属于水不溶性有机溶剂，与水不互溶，但能够溶解胡萝卜素；乙醇为水溶性有机溶剂，因萃取时能与水互溶而影响萃取效果，所以不用乙醇作为萃取剂。

【答案】（1）β-胡萝卜素维生素A夜盲症非挥发性（2）需要（3）乙酸乙酯萃取胡萝卜素的有机溶剂应不与水混溶，而乙醇为水溶性有机溶剂

【知识链接】1.植物有效成分提取方法的比较：

提取方法方法步骤原理优点局限性适用范围水蒸气

蒸馏法①水蒸气蒸馏

②分离油层

③除水过滤利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来简单易行，便于分离水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油压榨法①石灰水浸泡、漂洗

②压榨、过滤、静置

③再次过滤通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油生产成本低，易保持原料原有的结构和功能分离较为困难，出油率相对较低适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取有机溶

剂萃取

法①粉碎、干燥

②萃取、过滤

③浓缩使芳香油溶解在有机溶剂中，通过蒸发溶剂获得芳香油出油率高，易分离使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中2.依据植物有效成分的特性选择提取方法：提取挥发性较强的植物有效成分用蒸馏法；提取易溶于有机溶剂的植物有效成分用有机溶剂萃取法；提取原料中含量较高的植物有效成分用压榨法。

3.物质分离的方法：分离油水混合物可以采用分液的方法；除去压榨液中的固体物和残渣通常采用过滤的方法；除去液体中质量较小的固体残留物通常采用离心的方法；除去芳香油中的残留水分常采用加入无水硫酸钠后过滤的方法；除去不易挥发的植物有效成分中的有机溶剂常采用蒸馏法。

4.鉴定胡萝卜素常采用纸层析法。

【同步训练】

1.近年来，纪录片《舌尖上的中国》引发全民关注美食的热潮，其中多次讲述了利用不同微生物的发酵作用制作美味食品的过程。请分析回答下列问题：

（1）在果醋制作时，运用醋酸菌在供应和糖源充足时，将糖分解成醋酸；在糖源不充足时，也可以利用酒精生成醋酸，请写出该过程的化学反应式：。

（2）腐乳制作的流程是：让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制。用盐腌制时，应注意控制；配制卤汤时，要使卤汤中酒的含量控制在%左右。

（3）制作泡菜的原理是。

蔬菜在腌制过程中，会产生亚硝酸盐。在条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生反应后，与N1萘基乙二胺盐酸盐结合形成色产物。

2.某植物园中种植的有、玫瑰等花卉，还有葡萄、橘子等水果，其中玫瑰、橘子都可以作为植物芳香油提取的原料。请回答下列问题：

（1）植物芳香油的提取方法有、压榨法和等。具体采用哪种方法要根据植物原料的特点来决定。

（2）玫瑰精油适合用提取，其理由是玫瑰精油具有易挥发、难溶于水、化学性质稳定的特点。蒸馏时收集的蒸馏液不是纯的玫瑰精油，而是。经冷凝管冷却后，混合物又会重新分出层和水层。如果蒸馏过程中不进行冷却，则精油提取量会减少，原因是。

（3）橘皮精油的提取原料是橘皮，但橘皮易焦糊，宜采用法提取橘皮精油，其中将柑橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡，其目的是。

3.下图是植物组织培养过程示意图。请回答有关问题：

外植体①愈伤组织②长出丛芽③生根④移栽成活

（1）外植体若是茎段组织，则在配制MS固体培养基时，（填“必须”或“不必”）添加植物激素。

（2）外植体若是月季的花药，则图中的①过程（填“需要”或“不需要”）光照，而经②③④过程培养出的植物一般称为植株。该植株产生的途径除图中所示外，还可以是花粉通过阶段发育而来。

（3）外植体若是的根尖组织，则在正常环境下培养成的新植株叶片的颜色是，该过程体现了植物细胞具有的特点。

（4）植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂和分化的关键性激素，在植物组织培养过程中：

①若先使用细胞分裂素，后使用生长素，实验结果是细胞。

②当同时使用这两种激素时，生长素用量与细胞分裂素用量的比值（填“高”“低”或“适中”）时，可促进愈伤组织的形成。

4.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，某同学试从土壤中筛选出能高效降解尿素的细菌（目的菌），下表是该同学配制的培养基成分。

KH2PO4Na2HPO4MgSO4・7H2O葡萄糖（NH4）2SO4琼脂蒸馏水1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g定容到

1000mL（1）该培养基中主要营养物质包括。从功能上看，该培养基属于培养基。

（2）在生物的培养中，一般要对配制的培养基进行高压灭菌，其中“高压”是为了。