非小细胞肺癌CD44途径免疫逃逸机制初步探讨

非小细胞肺癌cd44途径免疫逃逸机制初步探讨

【关键词】 癌,非小细胞肺；抗原,cd44；肿瘤逃逸

【摘要】

目的 探讨非小细胞肺癌cd44途径免疫逃逸的机制及其临床意义。方法 采用免疫组化envison法，检测fas、cd44s和cd44v6基因蛋白在非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织中的表达，并分析其表达与肿瘤病理分期、分化程度和淋巴结转移的关系。结果 在癌旁肺组织中fas的表达阳性率为100%，在肺鳞癌和腺癌组织表达阳性率分别为62.5%和46.4%，在非小细胞肺癌组织中fas的表达减弱(hc=37.068,p<0.01)。cd44s和cd44v6在癌旁正常肺组织中未见表达；cd44s在肺鳞癌和腺癌组织表达阳性率分别为84.4%和46.4%，cd44v6在肺鳞癌和腺癌组织表达阳性率分别为81.3%和39.3%。fas、cd44s和cd44v6的表达均与肿瘤tnm分期、分化程度及淋巴结转移有关(u=2.476～3.986,hc=10.657～20.210,p<0.01)。结论 非小细胞肺癌通过癌细胞表面cd44 分子的构型由标准型向变异体改变，降低其fas的表达，从而逃脱fas?fasl介导的细胞凋亡。非小细胞肺癌fas、cd44s和cd44v6基因蛋白的检测可作为肿瘤进展程度的判断指标；非小细胞肺癌的发病与cd44途径免疫逃逸相关。

【关键词】 癌,非小细胞肺；抗原,cd44；肿瘤逃逸

preliminary study on the mechanism of cd44 pathway immune escape in non?small cell lung cancer

li hong, zhu kai, wei zhao?xia, et al

(the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);

［abstract］ objective to investigate the immune escape mechanism pathway of cd44 in non?small cell lung cancer (nsclc) and its clinical significance. methods the immunohistochemical envison method was used to detect expressions of fas, cd44s and cd44v6 in nsclc and adjacent normal lung tissue. the relationship between their expressions and pathological stage, tumor differentiation, lymph node metastasis was analyzed. results the positive expression of fas in adjacent lung tissue was 100%; in squamous cell carcinoma (scc) and adenocarcinoma (ac) was 62.5% and 46.4%, respectively; in nsclc, the expression of fas decreased. cd44s and cd44v6 were not found in adjacent normal lung tissue. the expression rate of cd44s in scc was 84.4% and in ac was 46.4%, while cd44v6 was 81.3% and 39.3% in scc and ac, respectively. the expressions of fas, cd44s and cd44v6 in tumors were related to tnm staging, differentiation and lymph node metastasis (u=2.476-3.986,hc=10.657-20.210,p<0.01). conclusion through the surface cd44 molecule conformation, nsclc was transformed from a standard model to a variant, decreased the expression of fas, escaping fas?fasl?mediated apoptosis. the detection of fas, cd44s, and cd44v6 can be used as markers to predict the process of the cancer. the occurrence of nsclc correlates with cd44 pathway immune escape.

［key words］ carcinoma, non?small?cell lung; antigens, cd44; tumor escape

cd44作为一种黏附分子，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。既往的相关研究主要集中在其与肿瘤的浸润和转移过程中发挥的重要作用。新近研究的结果表明，黏附分子与肿瘤的免疫逃逸也密切相关[1]。cd44参与了肿瘤的免疫逃逸，其机制可能与cd44分子构型的改变，以及与fas?fasl介导的细胞凋亡相关。本研究采用免疫组化envison法，分别检测cd44s、cd44v6以及fas基因蛋白在非小细胞肺癌（nsclc）组织表达，并分析其与肿瘤tnm分期、分化程度和淋巴结转移的关系，旨在初步探讨nsclc cd44途径的免疫逃逸机制，为进一步探索新的诊治手段提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本

60例nsclc标本取自2003年1月—2005年6月间青岛大学医学院附属医院肺癌手术病人，均有明确病理诊断，均无肝炎、糖尿病及其他自身免疫病。其中男33例，女27例；年龄27～73岁，平均51.6岁。根据who标准分型：鳞癌32例，腺癌28例；高分化17例，中分化22例，低分化21例；淋巴结转移阳性32例，阴性28例。按uicc 1997年肺癌ptnm分期标准:ⅰ期21例，ⅱ期13例，ⅲ期22例，ⅳ期4例。同时,取癌旁5 cm以外的正常肺组织标本18例作为对照。所有标本均经40 g/l甲醛溶液固定、石蜡包埋、5 μm厚连续切片，一张行苏木精?伊红染色核实诊断；余行免疫组化检测。

1.1.2 主要试剂

鼠抗人fas、鼠抗人cd44v6及鼠抗人cd44s单克隆抗体通用型powervisiontm?9000(pv?9000)kit、dab显色试剂盒及多聚赖氨酸粘片剂均购自北京中山生物技术有限公司；pbs缓冲液、抗体稀释液均为青岛大学医学院病理学教研室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

采用免疫组化二步法（envison法）。具体步骤:脱蜡、水化组织切片, 体积分数0.03 h2o2孵育20 min,以阻断内源性过氧化物酶,在枸橼酸盐缓冲液中微波修复抗原5 min，共2次。分别用蒸馏水、pbs洗涤5 min，共2次。分别滴加稀释一抗（3种抗体滴度均为1∶50）37 ℃水浴孵育2 h, pbs 冲洗,每次2 min,共3次；滴加二抗，37 ℃水浴孵育30 min, pbs 冲洗2 min,共3 次。 dab 溶液显色,镜下观察，充分冲洗、苏木精复染、水洗、脱水、透明、封片,光镜下观察。用pbs代替一抗作阴性对照，阳性对照为已知的肺癌阳性片[2]。

1.2.2 结果判定

采用半定量法，于200倍光镜下随机选取5个视野，各计数200个细胞。fas蛋白阳性反应为细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒，按显色强度和阳性细胞数分成4级[3]。阳性细胞＜10%为-；阳性细胞10%～25%，浅黄色为+；阳性细胞26%～50%,黄色为?；阳性细胞＞50%，棕黄色为?。 cd44v6及cd44s表达均定位于细胞膜，采用半定量积分法判定结果，即根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅积分。着色细胞比例<1/3为1分，1/3～2/3为2分，>2/3为3分。着色程度，无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据二者的乘积判断阳性等级：0分为－，1～2分为+，3～4分为?，>4分为?。

1.2.3 统计学处理方法

应用spss 10.0及ppms1.5[4]统计软件包进行处理。采用秩和检验、χ2检验、spearman rank相关检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 nsclc组织中fas蛋白的表达

fas蛋白主要表达于肺癌细胞胞膜，部分表达于细胞浆。fas蛋白在肺鳞癌和腺癌中的表达率为62.5%和46.4%，显著低于癌旁正常肺组织中的表达率100%(hc=37.068,p<0.01)。fas蛋白在肺鳞癌和腺癌中的表达差异无显著性（u=1.201,p＞0.05）。fas蛋白的表达在不同临床分期、分级、淋巴结有无转移肿瘤之间比较，差异均有显著性（u=3.381，hc=18.311、20.210,p<0.01）。见表1。

2.2 nsclc组织中cd44蛋白的表达

肺癌组织中cd44s和cd44v6蛋白均表达于肺癌细胞胞膜，cd44s和cd44v6在癌旁正常肺组织中未见表达。cd44s在肺鳞癌和腺癌组织中的表达阳性率分别为84.4%和46.4%，cd44v6在肺鳞癌和腺癌组织的表达阳性率分别为81.3%和39.3%。cd44s、cd44v6蛋白的表达在不同临床分期、病理类型、肿瘤分级、淋巴结有无转移肿瘤之间差异均有显著性（hc=10.657～17.824,u=2.476～3.986,p<0.01）。见表1。表1 nsclc组织fas、cd44s及cd44v6蛋白表达与临床病理特征的关系（略）

2.3 nsclc组织中cd44s、cd44v6与fas表达的相关性

nsclc组织cd44v6蛋白表达与cd44s、fas蛋白表达呈明显负相关(rs=-0.450、-0.347,p<0.01)， cd44s蛋白表达与fas蛋白表达呈明显正相关(rs=0.407,p<0.01),差异均有极显著意义。见表2～4。表2 nsclc组织中cd44s蛋白与cd44v6蛋白表达的相关性，表3 nsclc组织中cd44v6蛋白与fas蛋白表达的相关性，表4 nsclc组织中cd44s蛋白与fas蛋白表达的相关性（略）

3 讨论

fas?fasl系统激发的细胞凋亡在机体肿瘤免疫防御中发挥重要作用。其机制为：细胞毒性t淋巴细胞（ctl）和nk细胞在抗原提呈细胞、辅t细胞的作用下激活表达fasl，并与肿瘤细胞表面的fas结合，从而诱导其凋亡[5]。国内外的研究均证实nsclc的发生与fas?fasl系统密切相关[6]。

恶性肿瘤逃脱机体免疫系统的监视而生存的原因之一，就是肿瘤细胞fas表达的下调及对fas诱导的凋亡不敏感。yasuda等[7]通过实验提出，肿瘤细胞表面cd44与细胞周围的细胞间基质成分如ha的相互作用，使肿瘤细胞fas的表达和fas介导的凋亡受到抑制，通过fas?fasl途径降低肿瘤细胞对ctl的敏感性，从而使肿瘤逃脱fas介导的ctl杀伤。

fujita等[8]研究结果显示，正常组织向肿瘤的转变与细胞表面cd44 分子的构型改变有关，而且导致肿瘤细胞fas表达下调及对fas诱导的凋亡不敏感的是cd44变异体——cd44v6，而非标准型的cd44s。nsclc细胞表面cd44s的降低可以保护肿瘤细胞逃避肿瘤杀伤细胞(包括活化的巨噬细胞等) 的杀伤。

本实验研究结果显示，fas基因蛋白的表达与cd44s基因蛋白的表达呈正相关，与cd44v6基因蛋白的表达呈负相关。说明了在nsclc中，通过下调fas表达来逃脱由fas诱导的凋亡与cd44密切相关。这从另一个侧面证明了yasuda等[7]的结论，虽然其具体机制尚未阐明。受到抑制的fas?fasl途径降低了肿瘤细胞对ctl的敏感性，从而使肿瘤逃脱fas介导的ctl杀伤，此为nsclc cd44途径免疫逃逸的机制之一。

fas、cd44s和cd44v6的表达均与肿瘤tnm分期、分化程度及淋巴结转移密切相关，提示nsclc cd44s、cd44v6和fas基因蛋白表达的检测，可作为肿瘤病理分期及预后判断的指标。同时，nsclc cd44途径免疫逃逸机制及其与fas?fasl系统介导的细胞凋亡的关系启示我们：cd44在肿瘤抗宿主免疫中具有重要作用，下调cd44或逆转其表达，可以提高肿瘤细胞对免疫系统及抗癌药物的敏感性，减少肿瘤细胞的浸润和转移，不失为抗肿瘤治疗的一条新思路。

【参考文献】

[1]　penno m b, askin f b, ma h, et al. high cd44 expression on human mesotheliomas mediates association with hyaluronan[j]. cancer j sci am, 1995,1(3):196?203.

[2]　takigawa n, segawa y, mandai k, et al. serum cd44 levels in patients with non?small cell lung cancer and their relationship with clinicopathological features[j]. lung cancer, 1997,18(2):147?157.

[3]　esposito v, baldi a, liuzzi g, et al. analysis of fas (apo?1/cd95) expression in non?small cell lung cancer[j]. anticancer res, 2003,23(6c):4901?4905.

[4]　周晓彬,纪新强,徐莉. ppms 1.5统计软件的功能及其应用[j]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):91?93.

[5]　张明刚,曹雪涛. fas/fasl系统、杀伤性dc与免疫耐受[j]. 国外医学：免疫学分册, 2004,27(5):267?270.

[6]　牟宗宝,沈毅,杨景伟. 非小细胞肺癌组织fas、fasl和bcl?2表达及意义[j]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(5):397?399.

[7]　yasuda m, tanaka y, fujii k, et al. cd44 stimulation down?regulates fas expression and fas?mediated apoptosis of lung cancer cells[j]. int immunol, 2001,13(10):1309?1319.

[8]　fujita y, kitagawa m, nakamura s, et al. cd44 signaling through focal adhesion kinase and its anti?apoptotic effect[j]. febs lett, 2002,528(1?3):101?108.