类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及相关基因Fas表达的研究

［摘 要］ 目的：研究类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)患者滑膜组织中细胞凋亡及相关基因蛋白Fas的表达和意义。方法：采用免疫组织化学方法，对9例患者及8例正常对照滑膜组织中凋亡细胞及Fas的表达进行检测。结果：RA患者滑膜组织中细胞凋亡率明显低于对照组，而Fas阳性的细胞百分比却明显高于对照组。结论：RA患者滑膜组织中细胞凋亡的减少可能是导致滑膜过度增生进而关节功能丧失的原因之一，Fas表达虽增多但不能直接诱导细胞凋亡。

［关键词］ 类风湿关节炎；细胞凋亡；免疫组织化学

类风湿关节炎(RA)是一常见的以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的全身性疾病，我国成人中发病率约为0.3%。RA的主要病理特征是关节滑膜的增生和软骨及骨组织的侵袭破坏，有很高的致残率，其发病机制目前尚不十分清楚。近年的研究表明，细胞凋亡是其发病中的一个重要机制［1～3］。我们采用TUNEL法和免疫组化法对甲醛固定及石蜡包埋的RA患者及对照的滑膜组织进行细胞凋亡及其相关基因Fas表达的研究，旨在探讨RA滑膜增生的机制及凋亡相关基因Fas介导的细胞凋亡在RA发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 在西安市第五医院住院手术治疗RA患者9例，均符合美国风湿病学会1987年的RA诊断标准，其中男性2例，女性7例，年龄16岁~67岁，平均年龄(32.8±15.0)岁，病程1 a~23 a，平均病程(12.8±7.7) a。所有患者均有不同程度的关节活动性病变(有3个或3个以上关节持续性肿胀)，平均受累关节数为18个,6例类风湿因子(RF)阳性,3例阴性,血沉16 mm/h~83 mm/h，平均(55.0±23.6) mm/h，其中关节功能分级：Ⅰ级2例，Ⅱ级1例，Ⅲ级5例，Ⅳ级1例。关节X线表现分期：Ⅱ期2例，Ⅲ期1例，Ⅳ期6例。患者滑膜组织均取自滑膜切除术中的膝关节和/或腕关节，8例正常对照的滑膜组织取自骨折或外伤截肢者的膝关节。

1.2 组织处理 切取0.5 cm～1 cm滑膜组织,4%多聚甲醛固定,3%EDTA脱钙,石蜡包埋，用10%的多聚赖氨酸处理载玻片,滑膜组织切片为6 μm,室温贮藏备用。

1.3 实验方法

1.3.1 脱氧核糖核酸末端转移酶介导的脱氧核糖核酸缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡，3%H2O2处理样品切片10 min后,用蛋白酶K(Pro?teinaseK)于37 ℃消化5 min;取TdT和DIG?d?UTP各1 μl,加入18 μl标记缓冲液于滑膜组织片37 ℃杂交2 h;封闭液孵育30 min,生物素化抗地高辛抗体反应30 min;SABC稀释液反应30 min,DAB显色,苏木素轻度复染。阳性对照采用乳腺癌石腊切片,阴性对照采用PBS替代第一抗体。

1.3.2 Fas单克隆抗体免疫组化 滑膜切片二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,0.3%H2O2的甲醇液冲洗,磷酸盐缓冲液冲洗,加入1%牛血清白蛋白,20 ℃孵育15 min。第一抗体用鼠抗人Fas多克隆抗体在4 ℃下孵育16 h，第二抗体(碱性磷酸酶?生物素标记的抗鼠IgG)孵育20 min，用3?hydroxy?2?naphthy?locid2,4?dimethylaniline进行呈色反应。细胞核用苏木素染色。

1.3.3 结果判定 TUNEL法染色胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。Fas标记阳性物质主要定位于细胞的胞质，阳性结果为红色颗粒，并在光学显微镜10×10倍视野下,在每个样本关节滑膜组织中随机选取2个～4个视野,分别计100个细胞内平均凋亡阳性细胞数和Fas阳性细胞数,

1.3.4 统计学分析 应用SPSS 11.5统计学软件做统计学分析，实验数据用±s进行RA组与对照组间t检验，检测标准取双侧α=0.05。

2 结果

2.1 TUNEL法细胞凋亡在滑膜组织中的表达 RA组与对照组均可见细胞凋亡,但RA患者滑膜衬里层中细胞凋亡率明显低于对照组，两组相比差异具有显著性(P<0.05)。

2.2 Fas蛋白在RA患者滑膜组织中的表达 RA组与正常对照组均可见Fas的阳性表达,但RA患者滑膜衬里层中Fas阳性的细胞百分比明显高于对照组，两组相比差异具有显著性(P<0.05)，见表1。

表1 凋亡细胞及Fas在滑膜衬里层细胞中的阳性表达计数结果（略）

注:与对照组比较*P<0.05

3 讨论

RA的病理特征主要表现为滑膜细胞(主要是成纤维细胞)的增殖与炎性细胞的浸润，导致滑膜增厚、骨与软骨组织的受损，最后导致关节的破坏。目前对滑膜增生的确切原因还不清楚，但这些细胞的积累肯定部分与细胞凋亡抵抗或缺陷有关［1］。本研究发现，RA患者滑膜细胞明显增生，而细胞凋亡率却明显减少，说明RA患者滑膜细胞不因过度增生而出现过多的细胞凋亡，符合其病理特点，提示滑膜细胞的凋亡障碍可能是导致滑膜增厚的原因之一。细胞凋亡受多种基因调控,有些基因如Fas、Bax、肿瘤坏死因子等诱导凋亡，而Bcl?2、P53等抑制凋亡的发生［4］。Fas蛋白是一种细胞膜表面受体，是Ⅰ型膜蛋白，属于TNF家族，FasL是TNF家族的细胞表面分子，属于Ⅱ型膜蛋白，Fas与FasL的结合可导致携带Fas的细胞凋亡［5］。已证实Fas作为凋亡主要诱导因子，存在于滑膜细胞、软骨细胞以及滑膜浸润单个核细胞，另有报道，Fas蛋白可在RA和OA患者滑膜细胞表达，与抗Fas抗体结合后可诱导滑膜细胞凋亡，表明滑膜细胞表面的Fas具有传导凋亡信号的功能［6］，RA的关节破坏可能与Fas介导的细胞凋亡有关［2］。本研究发现，Fas在RA患者的滑膜细胞的高表达率，与细胞凋亡减少并不一致，结合既往研究报道滑膜衬里层细胞本身不能同时表达Fas和FasL而诱导自身细胞的凋亡［5］，从而我们推测滑膜细胞凋亡的下降可能是因为FasL的减少，使Fas不能与FasL结合将信号传递给细胞，进而抑制和阻断了Fas介导的凋亡途径。另有研究报道，只有少量单个核细胞上Fas与FasL同时表达(＜5%)，滑膜表层发生凋亡的细胞大多数同时表达Fas和FasL，且Fas阳性的成纤维细胞与FasL阳性的单个核细胞位置上毗邻［7］，这一点也解释了RA滑膜细胞虽高表达Fas但仍能够存活及增殖。综上所述，本研究结果表明，RA滑膜细胞凋亡减少，凋亡相关基因Fas表达增高，细胞凋亡并不随滑膜的增生而增加，其凋亡诱导因子Fas表达虽增加，但可能因其配体FasL减少而不能诱导凋亡，从而导致细胞增生与凋亡的不平衡，最终引起RA滑膜的增生及关节结构的破坏，但因多种基因同时调控细胞凋亡，Fas介导的细胞凋亡的减少可能仅是RA滑膜增生的原因之一。

参考文献：

［1］ 刘莉莉.类风湿关节炎细胞凋亡分子的研究进展［J］.上海免疫学杂志，2003：142?144.

［2］ 陆意.类风湿关节炎发病机制的研究进展［J］.国外医学免疫学分册，2001：256?259.

［3］ 刘继红，李卫东，林志彬.类风湿关节炎细胞凋亡的研究现状［J］.中国临床药理学与治疗学，2003，8(2)：232?236.

［4］ Chouct,yang JS,Lee MR,et al. Apoptosis in rheumatoid arthritis?expression of Fas,FasL,P53,and Bcl?2 in rheumatoid synovial tissues ［J］.Pathology,2001,193:110.

［5］ 张兴民，蒋明，郑德先，等.类风湿关节炎患者滑膜细胞增生与Fas和bcl?2基因的表达［J］.中华医学杂志，1998，78(3)，175?178

［6］ Nakajima T, Aono H, Hasunuma T, et al. Apoptosis and functional Fas antigen in rheumatoid arthritis synoviocytes［J］. Arthritis Rheum,1995,38:485?491

［7］ 孙红胜，陈昀，庞新强，等，类风湿关节炎细胞凋亡研究进展［J］.中华风湿病学杂志，2000，3:181?3.