生物技术的土壤修复应用前景

1PCBs污染土壤修复技术

生物修复主要依靠微生物、植物和土壤动物吸收、代谢、降解污染物,最终使其无害化,具有对环境扰动小、不产生二次污染、运行成本低等特点.该技术主要分为两类,即植物修复和微生物修复.由于PCBs疏水性强、生物可利用性低,因此会阻碍植物对它的吸收与转化,从而影响植物修复效果.而优良的PCBs耐受或降解植物的缺乏也在一定程度上限制了该技术的推广应用.微生物修复常采用2种方式[21]:一是生物激励,通过向土壤中添加有机物如葡萄糖或者其他营养元素如N、P等,以促进土著微生物生长,达到降解污染物的目的;二是生物强化,即向土壤中添加外源的高效降解菌(或含有高效降解菌的载体),以促进土壤中污染物的降解.在实际应用过程中,通常都是将这两种技术相结合,以期达到最佳的修复效果.PCBs是人工合成的难降解化合物,其所污染的环境必须经历一个相当漫长的时期才能自然驯化出一些具有降解PCBs能力的微生物,进而转化分解PCBs,其效率较为低下.因此,通过人工筛选获得高效的PCBs降解菌,将其扩大培养后投入污染土壤中加速PCBs的降解,是一种十分可行的技术手段.目前研究工作者已经从环境中分离出了许多能够降解PCBs的微生物,主要分布在假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)及鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等多个属,代表种有真养产碱杆菌(AlcaligeneseutrophusH850)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.LB400)和假单胞菌(Pseudomonassp.KF707)[22-24].在实验室条件下,微生物降解PCBs的效果往往比较理想,但在实际应用中,由于抗毒害能力差、被原生动物吞噬、与土著微生物竞争处于劣势等原因[25],导致外源投加微生物的生物量及代谢活性迅速降低,污染物降解能力也随之下降.因此,如何使外源微生物定殖于原位环境中并稳定发挥其功能,一直是国内外学者关注的焦点,而固定化微生物技术的兴起则为解决这一问题提供了新思路.

2固定化微生物技术及其在土壤修复方面的研究现状

2.1固定化微生物技术固定化微生物技术是指通过物理或化学的方法将游离的微生物与特定的载体相结合,使其固定在某一空间区域内,以提高微生物细胞的浓度、保持较高的生物活性并能反复利用的方法[26].微生物被固定后,载体为微生物提供了一个相对稳定的生存环境[14];载体作为一种屏障,能在一定程度上减轻土著微生物带来的竞争压力、削弱原生动物的吞噬作用[15];成型的固定化颗粒中微生物细胞密度大、代谢活性较强.这些特点使得固定化微生物具备了更好的环境适应能力和应用价值.载体的种类和固定化方式是决定固定化微生物性能的关键因素.良好的载体需具备机械强度高、理化性质稳定、物理性状优良、寿命长、无毒、不溶于水、价格低廉及易制备等特点[27].目前研究与应用中常见的微生物固定化载体材料主要分为4类:无机载体、天然高分子载体、人工合成高分子载体及复合载体[28-29].这4类载体各有优缺点,其中无机载体如蛭石、硅藻土以及天然高分子载体海藻酸钠、琼脂糖等均来源于自然环境,价格低廉且不易造成二次污染,是制备固定化微生物的首选载体,将其应用于环境修复方面的研究报道也较为丰富[17,30-31].此外,固定化方法也会对微生物的生长和活性造成不同程度的影响.因此,必须根据固定化微生物的用途及其应用的环境选择合适的固定方法.吸附法、包埋法、共价结合法和交联法为4种最主要的微生物固定化方法,其各自的特点见表1[26,28].交联法和共价结合法制备的固定化微生物细胞活性相对较低,而且传质阻力大、制备成本高,目前仍然处于实验室研究阶段.吸附法与包埋法对细胞活性影响小,而且制备过程比较简单,所以是目前应用较为广泛的微生物固定化方法[32].2.2固定化微生物技术在有机污染土壤修复方面的研究现状固定化微生物技术兴起于20世纪80年代,运用该技术处理含酚废水、含油废水和味精厂废水[33-37]等高浓度有机废水时均取得了良好的效果.但是到目前为止,固定化微生物技术在土壤修复方面的研究仍然处于起步阶段.其中,利用固定化微生物技术降解土壤中的残留农药及多环芳烃方面的研究报道相对较多.Su等[15]以蛭石为载体,吸附固定毛霉(Mucorsp.SF06)及芽孢杆菌(Bacillussp.SB02),用于降解土壤中的苯并[a]芘.42d内,苯并[a]芘的降解率高达95.3%,而游离菌组的降解率仅为79.6%.Balfanz等[38]将用粘土吸附固定的产碱杆菌(Alcaligenessp.A7-2)投入反应器中,提高了土壤中对氯苯酚的降解速率.吸附固定的过程比较简单,但其缺点在于微生物与载体结合不够紧密,在使用过程中微生物易从载体上流失.而包埋法则能有效克服这一缺点,所以包埋法以及包埋法与吸附法相结合的微生物固定化技术也受到了广泛关注.Lin等[14]把粉末活性炭加入到海藻酸钠凝胶包埋体系中固定黄孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBKM-F-1767),制得的固定化颗粒对五氯酚的降解能力优于游离菌,而且还具备了污染物吸附性能.范玉超等[17]采用竹炭吸附苍白杆菌(Ochrobactrumsp.AHAT-3),并辅以海藻酸钠包埋,所得到的固定化颗粒在28d内对砂姜黑土和红壤中阿特拉津的降解率分别为51.9%和52.8%,均比添加游离菌的试验组高出约10%.Wang等[19]的研究结果表明,在采用海藻酸钠和聚乙烯醇包埋微生物时,添加活性炭粉末有助于固定化颗粒形成良好的孔隙结构、利于物质传输和微生物生长.固定化微生物技术在降解有机污染物方面的优越性已经引起了越来越多的关注,而开发多样化的固定化技术则会成为研究的重点.2.3固定化微生物技术在PCBs污染物修复方面的研究现状国内外有关应用固定化微生物技术修复PCBs污染土壤的研究报道十分少见.现有研究主要集中于分离PCBs降解微生物、研究微生物对PCBs代谢谱和代谢产物以及分析相关功能基因和酶的结构[39-43].直接投加微生物修复PCBs污染土壤的研究也处于探索阶段[44-46].20世纪末美国通用电子公司尝试通过投加微生物并结合翻耕等技术实地修复PCBs污染土壤,最终发现土壤的温度、湿度及有机质含量是影响微生物降解PCBs的重要因素[47-49].2011年,Tu等[50]报道了一株具备PCBs降解能力的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti).室内模拟试验结果表明,该菌不仅能提高土壤中PCBs的降解率,而且能促进土著细菌与真菌生长,预示着该菌株具备较高的应用价值.近十年来开始有研究者关注固定化微生物对PCBs的降解(表2).Mukerjee-Dhar等[12]首次采用海藻酸钙包埋的混浊红球菌(RhodococcusopacusTSP203)降解水体中的PCBs,发现固定化的菌株具备更持久的PCBs降解能力:半连续降解试验表明,在第一个降解周期结束后,游离菌的PCBs降解活性基本丧失,而固定化菌株的PCBs降解活性可维持至第三个降解周期.聚氨酯泡沫也是一种常用的载体,Na等[51]用其包埋假单胞菌(Pseudomonassp.SY5)并获得了高活性的固定化颗粒,其对Aroclor1242中不同PCBs同系物的降解率要比游离菌高5%~40%.随后有学者尝试运用吸附型载体固定PCBs降解微生物、构建生物膜反应器,用于降解水体中的PCBs.Borja等[53]以水泥颗粒为载体设计的简易生物膜反应器运行5d后,Aroclor1260的降解率高达95%左右.Diana等[54]以聚氨酯泡沫和磨砂玻璃珠为填料,通过添加多种微生物所构建的生物膜反应器能有效的降解多种PCBs和氯代苯甲酸(chlorobenziocacids,CBAs).该研究结果表明,生物膜结构能有效抵御环境冲击对微生物造成的不利影响,从而保证微生物稳定的发挥其功能。目前,仅有少量研究涉及固定化真菌修复PCBs污染土壤.Fernández-Sánchez等[55]以甘蔗渣为主要基质培养黄孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumH-298),并用其修复PCBs污染土壤.结果表明附着在甘蔗渣上的真菌能定殖在土壤中并加速土壤中PCBs的降解.而且外源真菌和土著微生物间能建立协同关系,使得土壤中的异养生物活性提高,并促进土壤中PCBs的降解.Federici等[56]用玉米秸秆颗粒培养虎皮香菇(LentinustigrinusCBS577.79),使该菌在生长过程中逐渐与秸秆颗粒紧密结合.土壤修复试验结果显示,这种真菌能显著提高Aroclor1260的降解率,并能促进土壤微生物多样性的恢复.生物质材料不仅能作为真菌附着生长的载体,而且还能为真菌的生长提供营养,这两种效用确保了真菌稳定地定殖在土壤中,持久发挥其功能.故在探索真菌固定化方法的过程中,扩大生物质载体材料的筛选范围是非常有必要的.而以PCBs降解菌为对象、选择适当的载体材料、结合不同的物化技术制备出高性能的固定化微生物,并应用其修复PCBs污染土壤是值得深入探究的.虽然迄今为止已经发现了大量具备PCBs降解功能的细菌,但尚未出现与固定化细菌降解土壤中PCBs相关的研究报道.本课题组从长期受PCBs污染的土壤中获得了1种微生物混培物和1株飞鱼鞘氨醇菌(SphingobiumfuliginisHC3,GenBank登录号为KC747727).它们均能降解氯取代数小于4的PCBs同系物.研究还发现当微生物吸附在以水稻秸秆为材料制备的生物炭上后,其细胞能维持较高的代谢活性.因此我们尝试以生物炭为主要载体固定PCBs降解菌,以期获得能适用于PCBs污染土壤修复的固定化微生物.

3应用固定化微生物技术修复PCBs污染土壤的可行性

虽然目前有关采用固定化微生物技术修复PCBs污染土壤的研究报道仍然较少,但应用该技术修复多环芳烃、石油及农药等有机物污染土壤方面的研究已经取得了一定的进展.这些有机物和PCBs具有类似的性质,如具有生物毒性、疏水性强、生物可利用性较低.Su等[15,57]以蛭石和玉米芯颗粒为载体、Chen等[58]以生物炭为载体,制备固定化微生物降解土壤中的多环芳烃;Xu等[59]以花生壳粉为载体、Liang等[60]以活性炭和沸石为载体,制备固定化微生物修复石油污染土壤;Lin[14]等采用凝胶包埋法(辅助活性炭)制备固定化微生物降解土壤中的五氯酚;范玉超等[17]用包埋法制备固定化微生物降解土壤中的阿特拉津.这些研究都表明在土壤中添加固定化微生物降解有机污染物的效果优于直接添加游离微生物.其主要原因为微生物被固定后,载体形成的屏障能在一定程度上屏蔽土著微生物带来的竞争压力、抵御环境因素变化对微生物的冲击,而且适当的固定化方法还能改善微生物的代谢活性[12-16].因此,运用固定化微生物技术修复PCBs污染土壤具有一定的可行性.而且在土壤原位修复过程中,固定化微生物技术的实施工艺简单、对土壤生态环境的扰动小,使这项技术具备了较高的推广价值.此外,目前研究工作者已经筛选出了许多能降解PCBs的微生物,其中能有效降解PCBs并且降解途径已经被阐明的代表种有红球菌(Rhodococcussp.RHA1和Rhodococcussp.R04)、伯克霍尔德氏菌LB400、和弯曲无色细菌(AchromobactergeorgiopolitanumKKS102)[61-64].这些宝贵的微生物资源将为制备固定化微生物提供物质基础.能用于固定微生物的载体材料十分丰富,如天然载体硅藻土、蛭石、琼脂糖、海藻酸钠、农作物秸秆以及人工合成载体聚乙烯醇、硅胶和聚酯酰胺泡沫等都比较容易获取或制备,为研究与开发不同性能的固定化微生物提供了充足的资源.其中,蛭石和农作物秸秆常被用作吸附载体固定微生物[15,55-56],而海藻酸钠和聚乙烯醇则可作为交联剂包埋微生物[12,14,19].

4今后研究的重点

虽然固定化微生物技术在环境修复领域中表现出了巨大应用潜力,但其在PCBs污染土壤修复中的研究尚处于起步阶段,还有许多问题尚待解决:1)固定化微生物促进土壤中PCBs降解机理的探究.现有研究主要依据目标污染物的降解效率间接评价固定化微生物技术的优劣.但无法深层揭示在实际环境中,究竟是固定化微生物的哪些特点确保了它对目标污染物的降解效率高于游离菌.借助显微技术、原位杂交技术以及实时荧光定量PCR等技术,并尝试开发新的研究手段,用于直接表征土壤中固定化颗粒的形态与结构、分析固定化颗粒表面的微生物种群、检测固定化颗粒中降解菌的数量与活性、评价目标污染物是否能与固定化颗粒中的降解菌有效接触,将有助于进一步揭示固定化微生物促进土壤中PCBs降解的机理,还有助于更为准确地评价固定化微生物技术的应用价值.2)环境友好型载体的选择.投放到土壤中的固定化微生物难以回收再利用,因此筛选稳定性好、成本低廉且易获取的环境友好型材料至关重要.聚氨酯泡沫是一种常用的微生物固定化载体,具有理化性质稳定、易制备和成本低的特点[51].但由于这种材料很难自然降解,因此具有造成二次污染的风险,不适用于土壤原位修复.而一些生物质材料如小麦秸秆、蔗渣和玉米秸秆等不但能作为微生物的附着载体,提供微生物的生长所需的营养物质,而且还能充当疏松剂、提高土壤的透气性,特别适用于真菌的固定化[15,55-56].许多研究表明黑炭也是一种优良的载体.黑炭具有多孔结构,能够吸附大量的微生物并为其提供生长空间,还能充当物理屏障、减轻土著微生物带来的竞争压力[58,65].而黑炭丰富的表面官能团和较高的比表面积又能使其吸附和浓缩环境中的有机污染物[14,58],保证降解菌与污染物能相互接触,进而提高生物降解效率.而传统理论则认为黑炭加入土壤后,能强烈吸附有机污染物,从而降低其生物可利用性,不利于微生物对有机污染物的降解[66].因此,此类对有机污染物具有强烈吸附能力的材料是否适合作为固定化微生物的载体,仍有待深入研究.3)强化土壤体系的传质能力.土壤的传质能力远远低于水体,而固定化微生物颗粒自身亦存在一定的传质阻力.这两种阻力将在一定程度上阻碍微生物与目标污染物及营养物质的接触,进而干扰其功能作用的发挥.为了提高土壤体系的传质能力,一方面需要改善固定化颗粒自身的传质性能.如Wang等[19]以海藻酸钠和聚乙烯醇为交联剂、以活性炭粉末为改良剂,采用反复冻融技术,最终获得了具有良好孔隙结构、利于物质传输和微生物生长的固定化颗粒.或是筛选适合微生物附着生长的材料,采用以吸附法为主的技术制备出自身传质阻力较低的固定化微生物.另一方面,选择适当的原位调控方法如翻耕、通风等方式,提高土壤微环境中的传质水平,促进微生物、营养物质和污染物有效接触,确保以固定化微生物为核心的“微反应器”有效运转.4)多种微生物联合固定.PCBs的完全降解一般需要厌氧还原脱氯形成低氯代PCBs、低氯代PCBs氧化形成氯代苯甲酸及氯代苯甲酸矿化3个过程[67-69],分别由3类不同的微生物完成.其中氯代苯甲酸是多氯联苯好氧降解过程中最易积累的一类中间代谢产物,该类化合物能通过抑制微生物生长而间接阻碍PCBs的降解[70-71].因此,将这几类不同的微生物联合固定(尤其是好氧氧化过程中的两类微生物)、实现PCBs的完全降解、避免有毒中间代谢产物的积累也是相关研究应当关注的问题.

作者：胡金星 苏晓梅 韩慧波 沈超峰 施积炎 单位：浙江大学环境与资源学院环境保护研究所 杭州市环境保护科学研究设计有限公司