心理应激对模拟高原低压低氧环境下大鼠海马单胺递质的影响

【摘要】 目的 探讨心理应激对模拟高原低压低氧环境下大鼠海马单胺递质含量 的影响。方法 用旁观电击的方法建立大鼠心理应激模型。低氧处置为将大 鼠置于模拟海拔6000m的低压舱内24小时。观察下列心理应激对低压低氧环境下大鼠海马 细胞外液中去甲肾上腺素(NE)，多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)含量的影响。用高效液相色 谱-电化学法检测其中的单胺递质的含量。结果 ①低氧能显著降低大鼠海 马细胞外液中NE的含量(P

【关键词】 心理应激；低氧；海马；单胺递质

The Effect of Psychological Stress on Hippocampal Monoamine Metabolism in Rat un derSimulated

High-altitude Hypobaric Hypoxia. Deng Zihe, Ma Wentao, Yang L a iqi, et al. Mental Health Center of the Chinese PLA in Lanzhou Command, The Thir d Hospital of PLA, Baoji 721004, P.R.China

【Abstract】 Objective To examine the effect of psychological stress o n monoamine in extracellular fluid of hippocampus under simulated high-altitudehypobaric hypoxia. Methods Psychological stress used the way ofcommunication box. Thehypoxia disposal was that the rats were put hypobaric chamber at a simulated alt itude of 6000 meters for 24 hours. We compared the effect of psychological stres s in different intensity on the contents of norepinephrine(NE), dopamine(DA), 5- hydroxytryptamine(5-HT) in extracellular fluid of hippocampus under simulated hi gh-altitude hypobaric hypoxia. The extracellular fluid of hippocampus of rat wascollected by push-pull perfusion; we determined the contents of monoamine in i tby high performance liquid chromatography with electrichemical detection (HPLC- ECD). Results ①The simulated high-altitude hypobaric hypoxia c an decrease significantly the content of NE in extracellular fluid of hippocampu s (P

【Key words】 Psychological stress; Hypoxia; Hippocampus; Monoamine

高原低氧环境能引起机体的应激反应，能对大脑功能造成显著的影响，可改变大脑的生物化 学过程，特别是神经递质的代谢，其中单胺神经递质对缺氧非常敏感[1,2]；心理 应激同样能影响脑内的单胺递质代谢[3]，但目前尚缺乏心理应激对低氧环境下脑 内单胺递质影响的 相关研究。因此，本研究通过建立心理应激动物模型，探讨心理应激对在模拟高原低压低氧 环境下大鼠脑内单胺递质代谢的影响。由于海马是边缘环路的中枢组件，控制着认知和行为 反应，是整合应激的心理和生理反映的关键部位[4]。因此，我们用推挽灌流的方 法观察心理应激后，在模拟高原低压低氧环境下，大鼠海马细胞外液中单胺递质含量的变化 。

1 对象与方法

1.1 实验动物及分组

1.1.1 实验动物 成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重180～230g，由第四军医大学实验动 物中心提供。在光/暗周期为12/12h，光照时间7:00～19:00的条件下饲养。

1.1.2 分组方法 实验动物随机分成正常对照组(简称：Con组)、低氧组(简称：Hy组)、 心理应激(2次/天)组(简称：Ps1组)、心理应激(2次/天×2天)组(简称：Ps2组)、心理应激(2次/天) +低氧组 (简称：Ps1+Hy组)、心理应激 (2次/天×2天)+低氧组(简称：Ps2+Hy组) ，每组各8只。

1.1.3 处置方法 Ps1组组大鼠每天早9:00～9:30和下午4:30～5:00各进行应激1次；Ps2组 大鼠同样采用上述方法，共两天。Ps1+Hy组和Ps2+Hy组组大鼠在按上述方法处置后，立即放 入低压舱内持续24小时。

1.2 心理应激模型的建立 心理应激动物模型采用旁观电击(Communication Box，CB)模型 ，按Noguchi[5]等的方法稍加改进。旁观箱为透明的塑料制品，被分成四个室。电 击室(交叉 部分)中的大鼠进行足底电击刺激。电击室底部为通电铜条网格，通电电压为60～80伏，每 次通电持续5s，间隔25s，共持续30min。旁观室(对应的交叉部分)中的大鼠不接受电刺击。 被电击的大鼠出现惊叫、惊跳反应，旁观室大鼠观看电击室大鼠遭受电击的过程，通过视觉 、听觉等而产生心理应激。

1.3 模拟高原低压低氧的方法 每次2～3只大鼠放入小动物低压舱内，自由饮食水，匀速 减压至模拟海拔6000m高度(PB 47.3kPa)，维持24h。低氧处置前，各组大鼠均在相同的小动 物低压舱环境内适应性饲养一周(每天放置1h)。

1.4 推挽灌流法收集海马细胞外液 各实验组处理后的大鼠，立即在戊巴比妥钠(40mg/kg ，ip)麻醉后，固定于立体定位仪上（江湾I型脑立体定位仪，上海），按Paxinos[6]等大鼠 立体定位图谱，确定右侧腹侧海马坐标，牙科钻开颅，插入自制推挽灌流套管（其外管和内 管的外径分别为1.0mm和0.6mm）至海马腹侧(Bregma后5.2mm、向右旁开5.0mm、深7.0mm)。 灌流液为人工脑脊液(aCSF)(145mM NaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl2，2mM Na2HPO4和1.2mM Ca Cl2(pH 7.2~7.4)，由恒速微量注射泵(AJ5805，上海)持续灌流，灌流速度为10.0uL/min。 持续收集40min，收集管周围用碎冰降温，收集过程在避光条件下进行，前20min灌注液弃用 ，后20min时灌注液作为检测液，灌流液用0.22um微孔膜过滤后，立即放入-70℃冰箱保存 待测。

1.5 高效液相色谱-电化学测定

1.5.1 仪器 美国Waters高效液相色谱仪；M460电化学检测器；M745B数据处机；510泵；U 6K进样器。

1.5.2 试剂 标准品为去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸( 5- HIAA)、高香草酸(HVA)、3-氧基4羟基苯乙酸（DOPAC）均由美国Sigma公司提供；3，4-二羟 苄胺(DHBA)作为内标也由Sigma公司提供。0.1mol/LHCL将上述标准品配制成100μg／L贮液 ，置于-70℃保存。标准工作液：取适量贮液，以0.1mol/LHCl稀释至所需要浓度(现用现配) 。庚烷磺酸钠离子对试剂为Sigma产品，甲醇为优级纯，其它试剂均为分析纯，实验用水为 超纯水。

1.5.3 检测 每次直接进样50μl，进行检测，具体方法见程连弟等[4]的报道。 具体的仪器及检测方法见马文涛[2]及程连弟[7]等的报道。

1.6 血浆皮质酮水平的测定 推挽灌流结束后，心脏插管取血，置于20U/ml肝素抗凝的试 管混匀，于4℃、3000r/min条件下离心分离血浆，于-20℃冰箱中保存待测。用放免方法测 定血浆皮质酮水平(中国科学院上海原子能研究所)。皮质酮放免试剂盒购于DSL（美国）， 灵敏度为2.35ng/ml，批间和批内的变异系数分别为5.7%和4.4%。

1.7 统计方法 实验结果用SPSS 15.0统计软件分析。实验数据首先进行正态分布和方差 齐性检验；方差齐性实验数据采用双因素方差分析(地区：1.平原，2.高原；应激：0.无应 激，a.心理应激2次/天，b.心理应激2次/天×2天)；组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组间皮质酮水平的比较 地区因素主效应有显著性意义(F=38.45，P

2.2 各组间海马细胞外液NE含量的比较 地区因素(F=38.34，P

2.3 各组间大鼠海马细胞外液DA含量的变化 应激因素效应有显著性意义(F=6.59 ，P

2.4 各组间大鼠海马细胞外液5-HT含量的变化 地区因素(F=17.52，P

3 讨 论

由于应激的共同特征是激活HPA轴，使肾上腺释放糖皮质激素[8]，而本实验的心理 应激大鼠 血浆皮质酮水平都显著高于对照组，心理应激模型制作成功。低压低氧环境中大鼠血浆皮质 酮水平也显著高于对照组，说明低压低氧环境中的大鼠也处于一种应激状态；进舱前施加心 理应激的大鼠，血浆皮质酮水平未进一步升高，说明低压低氧环境已经使机体的HPA轴功能 达到高激活状态，这与有关的报道相类似[9]。

在大脑中，应激反应的重要组成成份是激活脑内单胺递质系统。在中枢单胺系统中，NE和5- HT系统被认为是适应应激反应的更重要的中枢神经递质网络。海马是NE含量丰富的脑区，并 且海马腹侧接受蓝斑大量的NE能神经元投射，突触前的肾上腺受体调节NE和5-HT的释放；海 马的CA1和CA2区域，接受大量的5-HT神经元神经支配，5-HT通过海马环路调节应激反应[10]。

由于低氧暴露后，脑内的单胺递质一般在24h后才恢复到基础水平[11]，因此，本 研究的单胺 递质含量变化，基本反映了低氧处理后大鼠脑内单胺递质的含量改变。单独给予低氧应激24 h后，大鼠海马细胞外液中NE的含量明显降低，可能是由于酪氨酸羟化酶的活性降低[ 11]，导致NE含量的减少，说明NE对低氧敏感[12]。随着入舱前给予应激强度的 增加，Ps2+Hy组的 大鼠海马细胞外液中的NE含量显著高于Hy组。说明一定强度的心理应激可增加低氧环境下的 机体交感神经活性，增加NE的释放，其对中枢NE的影响可能有别于低氧。

单独给予低氧应激后，大鼠海马细胞外液中5-HT的含量显著升高。由于在低氧环境下，色氨 酸羟化酶的活性也是降低的[11]，海马内的5-HT含量仍然增高，可能是由于色氨酸 羟化酶的 活性在低氧环境下没有完全被抑制，5-HT的重摄取被抑制，低氧仍能刺激5-HT神经元释放一 定的5-HT。增加心理应激的强度，不能进一步增加海马内的5-HT含量，提示低氧环境已经使 机体的5-HT神经元释放达到极限或者可能是心理应激的强度不足以引起5-HT神经元进一步释 放5-HT。由于海马接受的5-HT神经元神经末梢含有抑制神经递质释放的GABA神经纤维，对应 激反应起到负反馈调节作用[13]，提示模拟低压低氧环境下海马细胞外液中的5-HT 含量的升 高是机体的适应性反应，不同于低氧对海马NE系统的影响；同时也提示5-HT系统和NE系统是 机体适应应激反应的主要神经递质，至少在海马环路内。

单独给予低氧应激后，大鼠海马细胞外液内的DA含量未见明显变化，说明虽然酪氨酸羟化酶 的活性也是降低的[14]，可减少DA的含量，低氧仍可能刺激DA神经元释放一定的DA 以及重摄取的减少[15]，从而使海马内的DA含量暂时维持正常水平。心理应激不能 改变海马内DA的含 量，提示海马内的DA系统对低氧和心理性应激不敏感。需要说明的是，单独给予心理和生理 应 激后，海马细胞外液中单胺递质含量并未改变，可能与本试验只测定了一个时间点有关。

心理应激对模拟高原低压低氧环境下大鼠海马单胺递质含量影响的研究，将有助于分析 心理应激对高原低氧环境下的机体神经内分泌系统造成的影响，从而为进一步研究防治高原 低氧环境下机体出现的生理功能障碍提供实验依据。

4 参考文献

［1］Freeman GB, Nielson P, Gibson GE. Monoamine neurotransmitter metabol ism and locomotor activity during chemical hypoxia. J. Neurochem, 1986,46(3):733 -738

［2］马文涛,郑健.模拟高原低氧应激对大鼠海马单胺递质代谢的影响.中国行为医 学科学,2006,15(2):107-108

［3］Funada M, Hara C. Differential effects of psychological stress on ac tivation of the 5-hydroxytryptamine- and dopamine-containing neurons in the br ain of freely moving rats. Brain Research, 2001,901:247-251

［4］Fuchs E, Flugge G. Chronic social stress: effects on limbic brain st ructures. Physiology & Behavior, 2003,79(3):417-427

［5］Noguchi T, Yoshida Y, Chiba S. Effects of psychological stress on mo noamine systems in subregions of the frontal cortex and nucleus accumbens of therat. Brain Research, 2001:91-100

［6］Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. New York: Academic Press, 1997:37-39

［7］程连弟,刘英琳,怡夏平.高效液相色谱电化学同时检测单胺递质及其代谢产物. 分析化学,1996,24:992

［8］马文涛,杨来启,王晓峰,等.急性应激对大鼠血清细胞因子及皮质醇水平的影响 .中华精神科杂志,2002,35(2):110

［9］Wang TY, Chen XQ, Du JZ, et al. Corticotropin-releasing factor rece p tor type 1 and 2 mRNA expression in the rat anterior pituitary is modulated by i ntermittent hypoxia, cold and restraint. Neuroscience, 2004,128(1):111-119

［10］Mongeau R, Blier P, Montigny CD. The serotonergic and noradrenergicsystems of the hippocampus: their interactions and the effects of antidepressan t treatments. Brain Research Reviews, 1997,23:145-195

［11］Ohkuwa T, Itoha H, Yamamotob T, et al. Effects of long-term hypoxi aand hypoxic exercise on brain monoamine levels in rat. Autonomic Neuroscience:Basic and Clinical , 2003,106(2):98-102

［12］Li R, Bao G, el-Mallakh RS, et al. Effects of chronic episodic hypo xia on monoamine metabolism and motor activity. Physiol Behav, 1996,60(4):1071- 1076

［13］Fuller RW. The involvement of serotonin in regulation of pituitary -adrenocortical function. Front Neuroendocrinol, 1992,13(3):250-270

［14］Hender T, Lundborg P. Regional changes in monoamine synthesis in th e developing rat brain during hypoxia. Acta Physiol Scand, 1979,106(2):139-143

［15］Akiyama Y, Koshimura K, Ohue T, et al. Effects of hypoxia on the ac tivity of the dopaminergic neuron system in the rat striatum as studied by in vi vo brain microdialysis. J Neurochem, 1991,57(3):997-1002(收稿时间：2008-02-06)