用高效液相色谱仪测定水产品中孔雀石绿方法研究

【摘　要】本文根据GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》、SC/T 3021-2004《水产品中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱法》和GB/T20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》，利用高效液相色谱仪测定水产品中孔雀石绿，并对此方法进行了优化。采用氰基柱分离、改变流动相比例、减少流速和等梯度洗脱方式，在1.0 μg/mL到160.0μg/mL之间线性良好，线性相关系数r≥0.999，最低检测浓度孔雀石绿为5μg/kg，隐形孔雀石绿为2μg/kg。该方法具有保留时间短、分离效果好、精密度高，线性范围宽，节省试剂，减少成本等优点.，适用于水产品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿含量检测。

【关键词】高效液相色谱；孔雀石绿；隐形孔雀石绿；水产品

0.前言

孔雀石绿（MG）为三苯甲烷类工业染料, 在水产养殖上可以有效的预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小虫病，并能保持水产品的新鲜度。一些水产品贩运商和酒店为保持水产品新鲜度普遍使用MG，使用MG后的鱼即使死亡后颜色也较为鲜亮，消费者很难从外表进行辨认。MG 在水生生物体中的主要代谢产物为隐色孔雀石绿（LMG），MG 具有毒性强、高残留和致畸、致癌、致突变等副作用。LMG 由于不溶于水，其残留毒性比MG 更强，保留时间更长。所以，目前世界上诸如美国、日本、加拿大和欧盟等许多国家已将MG 列为水产养殖禁用药物，我国也于2002年将其列入食品动物禁用的兽药及其化合物清单。2008年我国公布的食品中可能违法添加的非食用物质名单中就有孔雀石绿。虽然MG 已被列为水产养殖禁用药物，但因其价格低廉和保鲜，仍有一些水产养殖户和酒店在普遍使用。

目前孔雀石绿的检测方法主要有高效液相色谱-荧光检测法[1][2]、高效液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法[3][4][5]。本文在国标方法的基础上进行优化，前处理方法与国标法相同（此文略），就流动相的选择、流动相溶剂比例和用氨基柱代替C18柱方面进行实验。计算出线性范围、最低检测浓度和精密度。

1.实验部分

1.1仪器及试剂

1.1.1仪器

（1）高效液相色谱仪。

（2）分析天平 感量0.1mg。

1.1.2试剂

（1）乙睛：色谱纯。

（2）乙酸铵：色谱纯。

（3）孔雀石绿（MG）纯度98%。

（4）隐色孔雀石绿（LMG）纯度98%。

（5）0.125mol/L乙酸铵溶液：称取乙酸铵9.64g，用纯水溶解并定容至1000mL，用 0.45μm滤膜过滤。

（6）MG标准储备液：准确称取孔雀石绿0.1000g，用乙睛溶解并定容至100mL。该标准溶液浓度为1mg/mL。避光、冰箱冷冻保存。

（7）MG标准应用液：吸取 1mg/mL MG标准储备液用乙睛稀释至1.0μg/mL。

（8）LMG标准储备液（1mg/mL）：准确称取LMG 0.1000g，用乙睛溶解并定容至100mL 。

（9）LMG标准应用液：吸取1mg/mL LMG标准储备液用乙睛稀释至1.0μg/mL。

（10）MG和LMG标准混合溶液分别吸取MG和LMG标准储备液，用乙睛稀释成不同浓度的标准混合溶液。

1.2仪器条件

检测器：紫外-可见光检测器，波长 618nm。

色谱柱：氰基柱，4.6mm×250mm，5μm。

流动相：乙睛-0.125mol/L 乙酸铵（pH4.5）=（47+53）。

柱 温：35℃。

流 速：1mL/min。

进样量：20μL。

1.3 测定

吸取20μL MG和LMG标准混合溶液（5.0μg/mL）分别注入色谱仪，在上述色谱条件下，绘制色谱图。见下图。

5.0μg/mL 孔雀石绿和无色孔雀石绿标准混合溶液色谱图

2.结果与讨论

2.1流动相的选择

MG和LMG的HPLC法分离，无论是C18柱还是氰基柱，多采用乙睛和乙酸铵作流动相的反相体系。其中乙酸铵浓度对MG和LMG的分离有很大影响。对于梯度洗脱方式多采用 50mmol/L乙酸铵溶液，而等梯度洗脱方式乙酸铵溶液浓度较大,为0.125mol/L。

2.2 流动相溶剂比例的影响

在上述色谱条件下，用1.0μg/mL MG和LMG标准混合溶液在不同比例（V/V）的乙睛—0.125mol/L 乙酸铵溶液中观察分离效果，结果表明，在乙睛—乙酸铵溶液（pH4.5）=47+53 时分离效果好，灵敏度最高，所以选择该溶剂比为流动相比例。见表 1。

表1 流动相溶剂比例对 LMG/MG 分离的影响

2.3 最低检测浓度

在上述色谱条件下，以3S/N的响应信号为最低检测浓度，LMG的最低检测浓度为0.02μg/mL，MG的最低检测浓度为0.05μg/mL，均能满足试验要求。以取样量10.0g 计，最低检测浓度 LMG为2μg/kg，MG为5μg/kg。

2.4 线性范围试验

上述色谱条件下，LMG和MG线性关系均良好。LMG和MG线性范围为2μg/mL～160.0μg/mL，相关系数r>0.999。

2.5 精密度试验

在上述色谱条件下，分别用1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL LMG/MG混合标准溶液进行平行性测定。保留时间相对标准偏差（RSD）一般小于0.4%，峰面积相对标准偏差小于5%。见表2。

表2 不同浓度 LMG/MG 混合标准溶液测定精密度试验

3.结论

高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿的方法中，SC/T3021-2004 采用C18柱，等梯度洗脱方式，但需要较大流速（2ml/min）；而GB/T19857-2005法采用C18柱，梯度洗脱方式并需柱后衍生，比较繁琐；GB/T20361-2006法中需要荧光检测器，对只有紫外检测器的用户还需再购置；文献有采用氰基柱分离的梯度洗脱方式。我们在研究这些方法的基础上，采用氰基柱分离、改变流动相比例、减少流速（1.0mL/min）和等梯度洗脱方式，测出最低检测浓度MG为0.05μg/mL，LMG为0.02μg/mL。线性范围0.1μg/mL～160.0μg/mL。该方法具有保留时间短、分离效果好、线性范围宽，节省试剂，减少成本等优点，适用于水产品中MG和LMG含量检测。

【参考文献】

［１］GB/T20361-2006.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定，高效液相色谱荧光检测法[S].

［２］杨贤庆，孙满义，李来好等.水产品中孔雀石绿高效液相荧光检测法的改良研究[J].食品科学，2008，29（8）：26-29.

［３］GB/T 19857-2005.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定[S].

［４］桂英爱，张秀妍，马琳等.用紫外和荧光检测器同时分析水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的高效液相色谱法[J].水产科学，2008，27（2）：82-85

［５］SC/T 3021-2004.水产品中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱法[S].