高温胁迫对香菇菌丝生长及其抗哈茨木霉能力的影响

拮抗和接种试验表明，胁迫温度及其处理时间共同影响香菇（Lentinula edodes）菌丝生长及其抵抗哈茨木霉（Trichoderma harzianum）侵染的能力，3个供试菌株Q7、L607和Y2对高温胁迫的耐受能力不同，37～42 ℃短时间胁迫处理对菌丝生长及其抗哈茨木霉能力没有明显影响。Q7在37 ℃处理24 h或39 ℃处理18 h和24 h，Y2在39 ℃处理24 h和48 h，菌丝体转移至PDA中正常温度（25 ℃）均能继续生长，但已失去了抵抗哈茨木霉侵染的能力。但L607在39 ℃处理不超过30 h时，保持了对哈茨木霉的抗病力。高温胁迫处理时间过度延长可导致香菇菌丝死亡。栽培试验表明，25 ℃室内培养的香菇菌棒没有发生腐烂病，而在缺乏控温条件的栽培棚内，菌棒腐烂率达到76%。温度测定表明，当秋栽香菇制袋时间提前至7月中旬时，7月下旬至8月上旬栽培棚内菌丝体受到了40～43 ℃高温胁迫。本研究表明，高温胁迫引起香菇菌丝抵抗哈茨木霉能力下降，甚至死亡，最终导致香菇菌棒腐烂病发生。

香菇； 哈茨木霉； 抗性； 高温胁迫； 菌丝生长； 菌棒腐烂

高温胁迫导致包括食用菌在内的各种生物体的活性氧氧化生物膜，产生多种具有伤害作用的不饱和醛酮产物，使蛋白质变性，破坏细胞膜稳定性，造成一系列生理紊乱，是生理学研究的重要领域之一[12]。食用菌对高温胁迫的耐受性是影响其正常生长发育的重要特性[3]。

哈茨木霉（Trichoderma harzianum）是香菇菌丝培养期间最为常见的木霉种类[45]，前人已经注意到香菇菌丝生长及存活能力与环境条件及木霉菌存在某种关系；TOKIMOTO研究了碳氮源对木霉和香菇菌丝互作的影响[6]，BADHAM研究了环境和栽培条件对哈茨木霉和香菇的长速和竞争性影响[7]。香菇菌棒腐烂病在生产中时有发生，但其发生原因研究多基于现场调查与经验判断，将其归结于气候异常、通风散热差、木霉菌感染或高温烧菌等原因，尚未见系统的研究[89]。通常情况下，湖北省随州市及其周边地区香菇栽培在8月下旬至9月中旬制袋，秋冬季及翌年春季棚内出菇，称之为秋栽模式。2012年以来，由于劳动力资源不足，为了错开制袋高峰期，部分农户将秋栽制袋时间提前至7月中下旬，香菇菌丝在培养期间遭遇高温，导致菌棒腐烂病在湖北省大面积发生，每年烂棒达到2000万棒以上，造成了十分严重的经济损失。笔者在验证了香菇菌棒腐烂病与菌棒石膏含量、刺孔次数、补水时间及补水方式等不具有相关性的基础上，研究了高温胁迫对香菇菌丝生长及其抗哈茨木霉能力的影响，明确了秋栽香菇菌棒腐烂病的发生原因。

1 材料与方法

1.1供试菌株

香菇供试菌株秋栽7号（Q7）、L607和雨花2号（Y2）菌株均由华中农业大学菌种实验中心提供。哈茨木霉（T. harzianum）菌株系笔者自湖北省随州市随县香菇腐烂菌棒上分离，经过形态学和ITS序列鉴定，保存于华中农业大学应用真菌研究所。

1.2病害症状观察

2012～2014年笔者在湖北省随州市随县草店镇、殷店镇和三里岗镇等秋栽香菇产区进行了现场调查。观察了香菇菌棒腐烂病的症状特征及变化规律，对发病菌棒表面和横切面特征进行了观察，调查了不同栽培棚中香菇菌棒生产管理措施及发病情况，分析了解菌棒腐烂病发生规律。

1.3高温胁迫处理Q7菌丝与哈茨木霉的对峙培养

将培养料（79%木屑，20%麸皮，1%石膏）装入200 mm×20 mm的双头开口玻璃管中，橡皮塞封口，灭菌；用直径8 mm的打孔器从PDA上取供试菌株Q7经过活化的菌丝片，每支玻璃管一端接3块菌丝片；25 ℃下培养20 d之后，分别置于37 ℃条件下处理6 h和24 h作为高温胁迫处理，以25 ℃培养相同时间为对照。在高温胁迫处理之后，在玻璃管另一端接入同样大小和数量的哈茨木霉菌丝片，25 ℃下培养，观察香菇菌丝与哈茨木霉菌丝相互接触时的对峙反应。试验设3次重复。

1.4高温胁迫处理对Q7菌丝生长能力的影响

在18 mm×180 mm的单头开口试管中装入香菇栽培的培养料，灭菌，按1.3方法分别接入Q7的菌种；25 ℃下培养至菌丝长满试管，再分别置于30、33、36、39、42 ℃五个温度梯度下，分别处理6、12、18、24、30、36、42、48 h，以25 ℃条件下培养相同时间为对照。之后从试管中挑出黄豆大小的培养物接种于PDA平板，25 ℃培养观察菌丝生长情况。采用十字交叉法，测量培养7 d后不同处理下香菇菌落直径，每个处理设5个重复，采用SPASS 20.0进行差异显著性分析。

1.5高温胁迫处理对3个供试菌株菌丝存活及抗哈茨木霉能力的影响

参照1.4的方法，对3个供试菌株（Q7、L607和Y2）长满培养料的菌丝体，在39 ℃条件下胁迫处理18、24、30、36、42、48 h，在42 ℃条件下胁迫处理6、12、18 h， 以25 ℃条件下培养相同时间为对照。之后从试管中挑出黄豆大小的培养物，接种于PDA平板，25 ℃培养观察菌丝生长状况。参考1.3方法，在试管中已胁迫处理的香菇菌丝表面接入哈茨木霉菌丝片，25 ℃下培养，观察哈茨木霉侵染香菇菌丝的情况。

1.6香菇菌棒培养温度及其腐烂病发生情况

试验在随州市随县殷店镇秋栽香菇生产基地进行。2014年7月20日接种香菇栽培菌株Q7共600个栽培袋，其中300袋置于室内（25 ℃）培养，另300袋置于栽培棚进行培养（栽培棚采用白色塑料薄膜和黑色遮阳网各一层进行覆盖，菌袋分别置于栽培棚第1～6个层架上，菌袋之间保持4～5 cm距离）。7月28日进行菌袋第一次刺孔，同时开始对栽培棚内气温和菌袋内部温度进行抽样测量。室内培养（25 ℃）的菌袋于10月15日转入同一个栽培棚中，在层架上随机摆放。采用常规方法对菌棒进行转色和出菇管理，观察菌棒腐烂病发生情况。

曹现涛，等：高温胁迫对香菇菌丝生长及其抗哈茨木霉能力的影响

2 结果与分析

2.1病害症状与发生情况

香菇菌棒腐烂病一般在当年秋冬季至翌年4月发生。在第一潮菇采收之后，菌袋表面出现零星的灰白色菌落，之后菌落扩大，菌落中央出现绿色或淡绿色分生孢子堆，并散发出强烈的霉味；被感染的菌棒深褐色，水浸状，松软，腐烂；菌棒横断面上腐烂部位深褐色，感病部位与正常菌丝之间有红褐色拮抗线；病斑可以逐渐向菌棒表面及内部的正常菌丝部位扩展，直至完全感染整个菌棒，致使菌棒腐烂松散，易折断（封三图1）。

调查表明，香菇菌棒腐烂病在随州市及周边各个种植区域均有发生，但以桐柏山南侧低丘河谷地带种植区发生最严重，而大洪山及周边丘陵山区发生较轻。菌丝培养场所对发病率有明显影响，砖房室内培养菌丝时发病率明显较低，而栽培棚中培养菌丝时发病率较高。随着采收次数增加，菌棒发病率迅速上升，至第四潮菇时发病率达到60%～80%，个别菇棚可以达到90%以上，原因是前期高温胁迫使菌丝活力衰退，抗木霉能力下降，每次出菇后菌丝营养被进一步消耗，浸水补水时菌棒被更多的木霉孢子感染，加快菌棒腐烂病传播速度。

A：菌棒表面腐烂呈褐色；B：菌棒横切面出现红褐色拮抗线；C：菌棒表面出现淡绿色分生孢子堆

A， Brown rot on log surfaces； B， Redbrown antagonistic streak in log transsection； C， Cluster of light green conidia on log surface

图1 香菇菌棒腐烂病的症状

Fig.1 Symptoms of log rot inL. edodes

图2 Q7菌丝37℃胁迫处理后与哈茨木霉菌丝的对峙培养结果

Fig.2 Antagonistic reaction between L. edodes Q7 mycelia treated at 37 ℃ and T. harzianum mycelia

2.2高温胁迫处理Q7菌丝与哈茨木霉对峙培养的拮抗反应

在试管培养料中，当Q7菌丝在37 ℃处理6 h时，它与哈茨木霉菌丝接触部位产生明显的黄褐色拮抗线，表明香菇菌丝抵抗哈茨木霉的能力强，且与对照处理（25 ℃）一致（封三图2）。当香菇菌丝在37 ℃处理24 h之后，菌丝迅速被哈茨木霉菌丝覆盖，表明其失去了抵抗哈茨木霉感染的能力。

2.3高温胁迫处理对Q7生长能力的影响

与对照相比，受高温胁迫后恢复生长的香菇菌丝，其长速快于处理前。高温胁迫可导致香菇菌丝抗逆性迅速减弱，超过一定阈值会使香菇菌丝死亡。在香菇菌丝未致死的条件下，这种高温胁迫是可逆的，在适宜条件下能恢复生长活力，甚至生长速度加快（表1），未观察到菌落形态有明显变化。

**不同温度处理相同时间存在极显著差异；不同大写字母表示相同温度不同时间处理存在极显著性差异（P 0.01）；/表示菌丝死亡

Values are the means （mm/d）±SD （n=5）；* indicates a significant difference （P 0.01） among different temperature treatments for the same time period； different higher case letters indicate a significant difference （P 0.01） among different time treatments at the same temperature； （/） nonviable mycelium

2.4高温胁迫处理对3个供试菌株存活及抗哈茨木霉能力的影响

G： Growth； D： Nonviable；+： Resistant；-： Sensitive

从表2可以看出，在39 ℃下处理不超过24 h，3个供试菌株菌丝转管至25 ℃后均能恢复正常生长。但39 ℃条件下Q7处理达到30 h，以及L607处理达到36 h时，菌丝均无法恢复生长，但雨花2号处理48 h菌丝仍然可以恢复生长。在42 ℃条件下，秋栽7号和L607在处理6 h后，菌丝可以恢复生长，但3个供试菌株在其它处理条件下均已死亡，不能恢复生长（表3）。

在39 ℃高温下胁迫处理菌株Q7 18 h和24 h、胁迫处理菌株Y2 24 h和48 h，两个菌株（Q7，Y2）菌丝体虽然还能继续生长，但已失去了抵抗哈茨木霉感染的能力（表2）。哈茨木霉菌丝能迅速感染受39 ℃高温胁迫处理24 h的菌株Q7的菌丝体。但在39 ℃高温胁迫处理时间不超过30 h时，L607既能继续生长，又保持了对哈茨木霉的抗性。

3个供试菌株对42 ℃高温胁迫的耐受能力存在明显差异。在42 ℃下处理6 h时，Q7和L607菌丝生长和抗哈茨木霉能力均没有受到显著影响，但Y2菌丝已死亡，而3个供试菌株处理12 h以上菌丝均全部死亡。

上述试验表明，温度和处理时间共同影响供试菌株高温胁迫反应的结果。短时间的高温胁迫对香菇菌丝的生长和抗哈茨木霉能力均没有显著影响。随着胁迫温度上升或胁迫时间延长，菌丝抗哈茨木霉能力下降，甚至失去生长能力。

2.5培养温度对香菇菌棒腐烂病发生的影响

25 ℃条件下室内培养菌丝时，Q7菌棒在出菇期没有发生烂棒现象。在栽培棚中进行菌棒培养的条件下，第一潮至第四潮菇采收后的菌棒腐烂率分别为18%、39%、57%和76%。温度测定发现，7月28日至8月6日中午14时前后棚内不同位点气温高于棚外气温2～3 ℃，而菌袋内部温度高于棚内气温3～4 ℃。气象资料表明，7月28日至30日当地连续3 d最高气温达到35～36 ℃，在此期间棚内最高温度达到37～39 ℃，而菌袋内部最高温度达到40～43 ℃，表明秋栽7号在菌丝培养期间受到了高温胁迫，引起抗哈茨木霉的能力下降，部分菌丝死亡，导致了菌棒腐烂病发生。

3 讨论

张美敬等人（2015）研究表明，侧耳属菌株受高温胁迫后，在28～40 ℃处理0～48 h菌丝体内硫代巴比妥反应产物（TBARS）与温度和时间呈正相关，与随后的菌丝恢复生长率呈负相关[3]。本研究首次进行较系统的室内外试验，证明香菇菌丝在短时间高温胁迫时生长能力及抗哈茨木霉能力没有受到显著影响，但随着胁迫温度上升或处理时间延长，菌丝抗哈茨木霉能力下降，甚至死亡，这与张美敬等人对侧耳属高温胁迫的研究结果相似。

香菇不同栽培菌株对高温的耐受能力不同，尚需进一步测定各个栽培菌株耐受高温胁迫的能力，为预防香菇菌棒腐烂病奠定基础。哈茨木霉是一种条件致病菌，只有在香菇菌丝活力下降时才能感染。在湖北省随州市等秋栽香菇产区，由于近年来农村劳动力资源出现短缺，部分种植户为了避开用工高峰，将制袋时间从8月下旬提前至7月中下旬，导致香菇菌丝培养处于炎热的夏季高温季节，而部分菌棒培养在没有良好遮阴及通风条件的栽培棚中进行，使得菌袋内部菌丝体受到高温胁迫，导致香菇菌棒腐烂病近年来在产区大范围严重发生。

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